PD1PDL1信號(hào)通路阻斷劑的研究PPT課件[通用]

1、1.前言2.立題依據(jù)和意義6. 已有進(jìn)展5. 進(jìn)度安排 4. 研究設(shè)想及方法開題報(bào)告 3. 國內(nèi)外研究進(jìn)展1前言腫瘤逃逸是目前腫瘤免疫治療公認(rèn)的障礙?；颊吣[瘤細(xì)胞自身的缺陷和免疫系統(tǒng)的功能障礙一起作用促進(jìn)了腫瘤的瘋狂生長。T細(xì)胞在免疫治療腫瘤的過程中處于中心地位，如果能調(diào)動(dòng)體內(nèi)的殺傷武器，那將是最有效的也是最安全的治療腫瘤的途徑。腫瘤的免疫逃逸機(jī)制與機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答之間存在著極為復(fù)雜的關(guān)系。腫瘤免疫治療的過程中早期腫瘤特異性的CD8+T細(xì)胞是激活的，隨著腫瘤生長到后期失去了殺傷的功能；IFN-r的分泌功能持續(xù)增強(qiáng)，腫瘤產(chǎn)生抵抗力。總而言之，無論是通過調(diào)節(jié)因子還是免疫細(xì)胞的修飾都是為了極大限

2、度的提高病人自身的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。不但要在體內(nèi)激活原有自身的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，還要讓已經(jīng)調(diào)動(dòng)的反應(yīng)持續(xù)增強(qiáng)才是免疫治療腫瘤的策略。T細(xì)胞的活化除了需要通過APC遞呈MHC-抗原肽給抗原特異性T細(xì)胞提供第一信號(hào)外，還需要一系列協(xié)同刺激分子提供第二信號(hào)，進(jìn)而才能使T細(xì)胞達(dá)到生理活化閾值產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答，這在理論上更好地解釋了免疫系統(tǒng)對(duì)自身和非自身抗原產(chǎn)生免疫學(xué)應(yīng)答時(shí)精確而微妙的調(diào)節(jié)機(jī)制。如果缺少共刺激分子提供的第二信號(hào)，將會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的無反應(yīng)性或特異性免疫耐受甚至進(jìn)入凋亡，因此，正性和負(fù)性協(xié)同刺激信號(hào)的調(diào)節(jié)及兩者之間的平衡在極體免疫應(yīng)答的整個(gè)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。2立題依據(jù)及意義PD-L1(B7-

3、H1)屬于B7家族，具有IgV和IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)及胞漿區(qū)尾部，PD-L1與其T細(xì)胞上的受體PD1相互作用，在免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用；該分子具有廣泛的組織表達(dá)譜，在一些腫瘤細(xì)胞系上有較高的表達(dá)，許多研究均表明其與腫瘤的免疫逃逸機(jī)制相關(guān)。腫瘤部位的微環(huán)境可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的PD-L1的表達(dá)，且表達(dá)廣泛，表達(dá)的PD-L1有利于腫瘤的發(fā)生和生長，誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞的凋亡。轉(zhuǎn)染PD-L1基因的P815腫瘤細(xì)胞系在體外可抵制特異性CTL的裂解，將其接種小鼠體內(nèi)后具有更強(qiáng)的致瘤性和侵襲性。這些生物學(xué)特性均可通過阻斷PD-L1而逆轉(zhuǎn)。敲除PD1基因的小鼠，阻斷PD-L1/PD-1通路，則接種腫瘤細(xì)

4、胞不能形成腫瘤。通過阻斷PD-L1/PD-1信號(hào)通路可有效抑制腫瘤生長，可根據(jù)此設(shè)計(jì)新的對(duì)腫瘤免疫逃逸的治療方案，來加強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用。3國內(nèi)外研究進(jìn)展-PDL1在腫瘤中的表達(dá)PD1（programmed death-1）最初是在凋亡的T細(xì)胞雜交瘤中得到的，由于其和細(xì)胞凋亡相關(guān)而被命名為程序性死亡-1受體。目前，PD-1的配體被證實(shí)有兩個(gè)，分別是PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC).PD-L1蛋白廣泛表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（APCs）、活化T、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層、心肌內(nèi)皮和胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞。在許多人類腫瘤組織中均可檢測(cè)到PD-L1蛋白的表達(dá)，且許多癌組織較正常組織中

5、的PD-L1表達(dá)水平明顯上調(diào)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤等人類腫瘤組織中檢測(cè)到PD-L1蛋白的表達(dá)，且PDL1的表達(dá)水平和患者的臨床及預(yù)后緊密相關(guān)。4國內(nèi)外研究進(jìn)展-PD1/PDL1在腫瘤免疫治療中的作用在抗腫瘤免疫中，通常遵循腫瘤特異性T細(xì)胞活化、T細(xì)胞增值、腫瘤浸潤和T細(xì)胞記憶應(yīng)答加強(qiáng)的步驟。研究表明，腫瘤細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境中的APCs表達(dá)的PD-L1均可經(jīng)PD-1/PD-L1信號(hào)通路抑制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的活化，下調(diào)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫應(yīng)答。因此，干預(yù)PD-1/PD-L1信號(hào)有望成為腫瘤免疫治

6、療的新策略。PD-L1單抗能有效抑制局部腫瘤生長；阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)可以促進(jìn)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的增值，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；阻斷腫瘤細(xì)胞上相關(guān)PD-L1信號(hào)可上調(diào)浸潤C(jī)D8T細(xì)胞IFN-R的分泌，表明PD-1/PD-L1信號(hào)通路的阻斷在以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答為目的的腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用；選擇抗PD-L1單抗配合腫瘤疫苗進(jìn)行腫瘤免疫治療可有效加強(qiáng)腫瘤疫苗的免疫激活作用，減弱腫瘤微環(huán)境對(duì)療效的影響；5研究設(shè)想及方法6研究設(shè)想及方法表達(dá)可溶性PD1與腫瘤細(xì)胞上過度表達(dá)的PDL1結(jié)合；利用單鏈抗體庫篩選與PDL1特異性結(jié)合的SCFV；利用多肽庫篩選與PDL1特異性結(jié)合的多肽；SCFV或多肽阻斷

7、PD1/PDL1通路機(jī)理的研究；7PD-L1/PD-1相關(guān)蛋白的表達(dá)鑒定已有報(bào)道PD-1和PD-L1在原核中以包涵體形式表達(dá)，為了獲得可溶性的PD-1和PD-L1；我們擬采用sumo標(biāo)簽融合表達(dá)PD-1和PD-L1，以期獲得可溶性表達(dá)；鎳柱純化，sumo酶酶切，再鎳柱純化獲得與天然氨基酸相同的PD-1和PD-L1；以備單鏈抗體及多肽的篩選實(shí)驗(yàn)；采用酵母表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)純化PD1-IgG，來阻斷PD-1/PD-L1通路；8PDL1的單鏈抗體SCFV的篩選利用噬菌體展示技術(shù)從高容量半合成人抗體文庫中篩選PDL1的特異性的且具有封閉PDL1生物學(xué)活性的單鏈抗體片斷(scFv)；采用酵母表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)純

8、化SCFV-FC，來研究是否能阻斷PD-1/PD-L1通路；利用SCFV與PDL1的高親和力，研究能否融合毒素靶向殺傷高表達(dá)PDL1蛋白的腫瘤細(xì)胞；9PDL1特異性結(jié)合多肽的篩選利用NEB 7/12-mer多肽文庫；篩選與PDL1特異性結(jié)合的多肽；研究其與PDL1的結(jié)合能力，能否與其受體PD1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的能力；能否成開發(fā)成為一種阻斷PD1/PDL1信號(hào)通路的多肽藥物；10SCFV或多肽阻斷PD1/PDL1通路機(jī)理的研究T細(xì)胞活力的增強(qiáng)：流式細(xì)胞儀檢測(cè)活化狀態(tài)T細(xì)胞(CD44+)的數(shù)量是否增加；細(xì)胞因子數(shù)量的增加：ELISA檢測(cè)IFN-r、IL-10等細(xì)胞因子的表達(dá)量是否提高；腫瘤位置T細(xì)胞數(shù)目

9、的增加：免疫組化方法檢測(cè)活化T細(xì)胞是否在腫瘤位置聚集以發(fā)揮其殺傷作用；11進(jìn)度安排研究生一年級(jí)上學(xué)期：專業(yè)課的理論學(xué)習(xí)；研究生一年級(jí)下學(xué)期：閱讀大量的專業(yè)文獻(xiàn)，獲取PD1/PDL1基因；研究生二年級(jí)上學(xué)期 ：完成PD1、PDL1及相關(guān)基因的蛋白表達(dá)純化鑒定 ；研究生二年級(jí)下學(xué)期：完成PDL1結(jié)合SCFV及多肽的篩選工作，并對(duì)其活性進(jìn)行初步的鑒定；研究生三年級(jí)上學(xué)期 ：完成SCFV或多肽阻斷PD1/PDL1通路機(jī)理的研究；研究生三年級(jí)下學(xué)期 ：撰寫畢業(yè)論文，準(zhǔn)備答辯。12已有進(jìn)展-PD1表達(dá)Fig.1. SDSof SUMO-PD1 expression Lane 1: uninducedLane 2: induced by IPTG (colony 1)Lane 3: induced by IPTG (colony 2)Lane M: protein MarkerNote: Red arrow indicated the target protein13已有進(jìn)展-PDL1表達(dá)Fig.2. SDSof SUMO-PDL1 expression Lan