分子生物學(xué)常用技術(shù)雜交

1、分子生物學(xué)常用技術(shù)分子生物學(xué)常用技術(shù)u 凝膠電泳凝膠電泳u 分子雜交技分子雜交技術(shù)術(shù)u PCR PCR 技術(shù)技術(shù)DNA DNA 物理圖譜物理圖譜 DNADNA序列測(cè)定序列測(cè)定 生物芯片生物芯片“基因靶向基因靶向”技術(shù)技術(shù)RNA干擾干擾技術(shù)技術(shù)堿基對(duì)之間非共價(jià)健形成穩(wěn)定的雙鏈堿基對(duì)之間非共價(jià)健形成穩(wěn)定的雙鏈) )雜交雜交（hydridizationhydridization）指兩個(gè)以上的分子因具有）指兩個(gè)以上的分子因具有 相近的化學(xué)性質(zhì)相近的化學(xué)性質(zhì)( (或結(jié)構(gòu)互補(bǔ)或結(jié)構(gòu)互補(bǔ)) )而在適宜的而在適宜的 條件下特異地相互識(shí)別、結(jié)合形成雜交體條件下特異地相互識(shí)別、結(jié)合形成雜交體 （hybridhyb

2、rid）的過程。）的過程。（一）（一）DNA變性變性 DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成 單鏈無(wú)規(guī)則線團(tuán)樣單鏈無(wú)規(guī)則線團(tuán)樣DNA，稱為，稱為DNA變性。變性。 變性方法：變性方法：1): 加熱、加熱、 2): DNA溶液的溶液的pH改變、改變、 3): 有機(jī)溶劑等有機(jī)溶劑等 變性的變性的DNA的特征：粘度下降、沉降速度增加、的特征：粘度下降、沉降速度增加、 浮力上升、紫外吸收增加。浮力上升、紫外吸收增加。 （二）（二）DNA復(fù)性復(fù)性 變性變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié) 合，恢

3、復(fù)原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。復(fù)性合，恢復(fù)原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。復(fù)性 后的后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。 核酸分子雜交的特點(diǎn)核酸分子雜交的特點(diǎn): 高度特異性高度特異性 高度靈敏性高度靈敏性已成為分子生物學(xué)中已成為分子生物學(xué)中最常用最常用的基本技術(shù)的基本技術(shù). .廣泛應(yīng)用于廣泛應(yīng)用于: : 基因克隆的篩選基因克隆的篩選 酶切圖譜的制作酶切圖譜的制作 基因序列的定量和定性分析基因序列的定量和定性分析 基因突變的檢測(cè)等?；蛲蛔兊臋z測(cè)等。雜交的雙方雜交的雙方 : : 待測(cè)核酸序列待測(cè)核酸序列 + +探針（探針（probeprobe）待測(cè)核酸序列待測(cè)核

4、酸序列: : 克隆的克隆的DNADNA片段片段 未克隆化的基因組未克隆化的基因組DNADNA 細(xì)胞總細(xì)胞總RNA, mRNARNA, mRNA。 核酸探針：是指用放射性核素、生物素或其他核酸探針：是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)活性物質(zhì)標(biāo)記而便于檢測(cè)標(biāo)記而便于檢測(cè)的，能與特定的核酸序的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知已知DNADNA或或RNARNA片段。片段。 基因組基因組DNADNA探針探針 cDNAcDNA探針探針 寡核苷酸探針寡核苷酸探針 RNARNA探針等探針等 探探 針針 1 1、DNADNA探針探針DNADNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度探針是最常

5、用的核酸探針，指長(zhǎng)度在在幾百堿基對(duì)幾百堿基對(duì)以上的雙鏈以上的雙鏈DNADNA或單鏈或單鏈DNADNA探針。探針?，F(xiàn)已獲得現(xiàn)已獲得DNADNA探針種類很多探針種類很多: : 有細(xì)菌、病毒、有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNADNA探針。這探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。某一非編碼序列。來(lái)源來(lái)源: : 分子克隆分子克隆 PCR PCR、cDNAcDNA 探針探針 cDNAcDNA （complementary DNAcomplementary DNA）探針是指互補(bǔ)于）探針是指互補(bǔ)于mRNAmRN

6、A的的DNADNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNARNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，按照為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，按照RNARNA的核苷酸順的核苷酸順序合成序合成DNADNA（其中（其中U U與與A A配對(duì)）配對(duì)） 。 無(wú)內(nèi)含子和非編碼序列無(wú)內(nèi)含子和非編碼序列 cDNAcDNA 探針是目前應(yīng)用最為廣泛理想的一種探針。探針是目前應(yīng)用最為廣泛理想的一種探針。來(lái)源來(lái)源: : 分子克隆分子克隆 RT- PCR RT- PCRDNADNA探針（包括探針（包括cDNAcDNA探針）的優(yōu)點(diǎn)：探針）的優(yōu)點(diǎn)： : : 這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限這類探針多

7、克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖、大量制備、方法簡(jiǎn)便。繁殖、大量制備、方法簡(jiǎn)便。 : : 不易降解（相對(duì)不易降解（相對(duì)RNARNA而言），而言），DNADNA酶活性一酶活性一般能有效抑制。般能有效抑制。 : DNA: DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法等，能用于同位供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。素和非同位素標(biāo)記。3 3、RNARNA探針：探針： RNARNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNARNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高是單鏈分子，所以

8、它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高, ,特異性強(qiáng)。特異性強(qiáng)。 克隆載體體外轉(zhuǎn)錄克隆載體體外轉(zhuǎn)錄(in vitro transcription)(in vitro transcription) RNA RNA探針探針 容易降解容易降解4 4、寡核苷酸探針：、寡核苷酸探針： 根據(jù)已知的核酸序列，采用根據(jù)已知的核酸序列，采用DNADNA合成儀合成一定長(zhǎng)度的合成儀合成一定長(zhǎng)度的寡核苷酸片段，亦可作為探針使用。若不知核酸序列，寡核苷酸片段，亦可作為探針使用。若不知核酸序列，可根據(jù)可根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推倒出核酸順序蛋白質(zhì)的氨基酸順序推倒出核酸順序，但要考慮到密碼子的兼，但要考慮到密碼子的兼并性。多用于并性。

9、多用于克隆篩選克隆篩選和和點(diǎn)突變點(diǎn)突變分析。分析。 人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點(diǎn)：人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點(diǎn)： 短的探針比長(zhǎng)探針雜交速度快、穿透力強(qiáng)。短的探針比長(zhǎng)探針雜交速度快、穿透力強(qiáng)。 可以在短時(shí)間內(nèi)大量制備?？梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)大量制備。 在合成中進(jìn)行標(biāo)記制成探針。在合成中進(jìn)行標(biāo)記制成探針。 可合成單鏈探針可合成單鏈探針，避免了用雙鏈，避免了用雙鏈DNADNA探針在雜交中自我探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。復(fù)性，提高雜交效率。 寡核苷酸探針可以檢測(cè)小寡核苷酸探針可以檢測(cè)小DNADNA片段，在嚴(yán)格的雜交條件片段，在嚴(yán)格的雜交條件下，可用于檢測(cè)在序列中單堿基對(duì)的錯(cuò)配。下，可用于檢測(cè)在序列

10、中單堿基對(duì)的錯(cuò)配。 人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點(diǎn)：人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點(diǎn)： 短的探針比長(zhǎng)探針雜交速度快、穿短的探針比長(zhǎng)探針雜交速度快、穿透力強(qiáng)。透力強(qiáng)。 可以在短時(shí)間內(nèi)大量制備。可以在短時(shí)間內(nèi)大量制備。 在合成中進(jìn)行標(biāo)記制成探針。在合成中進(jìn)行標(biāo)記制成探針。 可合成單鏈探針可合成單鏈探針，避免了用雙鏈，避免了用雙鏈DNADNA探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。 寡核苷酸探針可以檢測(cè)小寡核苷酸探針可以檢測(cè)小DNADNA片段，片段，在嚴(yán)格的雜交條件下，可用于檢測(cè)在序列在嚴(yán)格的雜交條件下，可用于檢測(cè)在序列中單堿基對(duì)的錯(cuò)配。中單堿基對(duì)的錯(cuò)配。 篩選寡核苷酸

11、針的原則篩選寡核苷酸針的原則 ： 長(zhǎng)長(zhǎng)181850bp50bp，較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)合成量低，較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)合成量低；較短探針特異性會(huì)差些。；較短探針特異性會(huì)差些。 堿基成分：堿基成分：G+CG+C含量為含量為40%40%60%60%，超出此范圍則，超出此范圍則會(huì)增加非特異雜交。會(huì)增加非特異雜交。 探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的針雜交的“發(fā)夾發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。狀結(jié)構(gòu)。 避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4 4個(gè)），如個(gè)），如- -CCCCC-CCCCC-。 一旦選定某一序更符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將序列與一

12、旦選定某一序更符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將序列與核酸文庫(kù)中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核核酸文庫(kù)中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過不能超過70%70%或有連續(xù)或有連續(xù)8 8個(gè)或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。個(gè)或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。 克隆探針：克隆探針： 前述三種探針前述三種探針(DNA, (DNA, cDNAcDNA, RNA), RNA)均是可克隆的，均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。探針?？寺√结樀膬?yōu)點(diǎn)：克隆探針的優(yōu)點(diǎn)：

13、（1 1）: : 特異性強(qiáng)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度而言，特異性強(qiáng)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度而言， 較長(zhǎng)較長(zhǎng)的序列復(fù)雜度高，隨機(jī)碰撞互補(bǔ)序列的機(jī)會(huì)較短序的序列復(fù)雜度高，隨機(jī)碰撞互補(bǔ)序列的機(jī)會(huì)較短序列少；列少； （2 2）: : 可獲得較強(qiáng)的雜交信號(hào)，因?yàn)榭寺√娇色@得較強(qiáng)的雜交信號(hào)，因?yàn)榭寺√结樰^寡核苷酸探針摻入的可檢測(cè)標(biāo)記基團(tuán)更多。針較寡核苷酸探針摻入的可檢測(cè)標(biāo)記基團(tuán)更多。 核酸探針的標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵放射性同位素標(biāo)記放射性同位素標(biāo)記: : 敏感度高敏感度高 輻射危害輻射危害 最早采用最早采用, , 最常用的核酸探針標(biāo)記方法。最常用的核酸探針標(biāo)記方法

14、。 常用同位素常用同位素: : 32P、35S。 32P 32P因其能量高，信號(hào)強(qiáng)，所以最常用。因其能量高，信號(hào)強(qiáng)，所以最常用。 半衰期半衰期: 32P: 32P為為14.314.3天、天、35S35S為為87.187.1天、天、 125I 125I為為6060天、天、3H3H為為12.312.3年年 核酸探針的常用酶促標(biāo)記技術(shù)有：核酸探針的常用酶促標(biāo)記技術(shù)有： 缺口平移缺口平移 DNA DNA快速末端標(biāo)記快速末端標(biāo)記 用用T4T4多核苷酸酶標(biāo)記多核苷酸酶標(biāo)記DNA 5DNA 5末端末端 隨引物延伸隨引物延伸 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng) 缺口平移缺口平移DNA快速末端標(biāo)記；快速末端標(biāo)記；3 末端

15、末端 隨引物延伸隨引物延伸非放射性標(biāo)記物有下述幾類：金屬如金屬如Hg熒光物質(zhì)如熒光物質(zhì)如F2TC半抗原如地高辛、生物素半抗原如地高辛、生物素酶類如辣根過氧化物酶（酶類如辣根過氧化物酶（HRP）、半乳糖苷酶或）、半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（AKP）等）等不同的標(biāo)記物，所標(biāo)記探針的方法及檢測(cè)方法也不同的標(biāo)記物，所標(biāo)記探針的方法及檢測(cè)方法也各異。各異。 固相雜交: 將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中，支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。 優(yōu)點(diǎn): 1):未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，2): 膜上留下的雜交物容易檢測(cè), 3):能防止靶

16、DNA自我復(fù)性等。 常用類型有：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、 Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。 液相雜交: 參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。核糖核酸酶保護(hù)分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）等核酸分子雜交方法核酸分子雜交方法 19751975年，英國(guó)年，英國(guó)SouthernSouthern創(chuàng)建創(chuàng)建 DNA + DNADNA + DNA雜交雜交: : 即將待測(cè)即將待測(cè)DNADNA酶切、電泳、酶切、電泳、轉(zhuǎn)移（?。┎⒐潭ㄔ诠滔嘀С治锷?，用已轉(zhuǎn)移（?。┎⒐潭ㄔ诠滔嘀С治锷?，用已知知DNADNA探針進(jìn)行檢測(cè)的

17、方法。探針進(jìn)行檢測(cè)的方法。用途：用途： 1): 1): 基因定性定量基因定性定量 2): DNA 2): DNA物理圖譜物理圖譜 3): 3): 基因變異重排基因變異重排 4): 4): 基因限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)基因限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（性分析（RFLPRFLP） 5): 5): 疾病診斷疾病診斷探針探針: DNA: DNA探針探針SouthernSouthern印跡雜交印跡雜交 待測(cè)待測(cè)DNADNA樣品的制備、酶切樣品的制備、酶切 待測(cè)待測(cè)DNA DNA 樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳 凝膠中凝膠中DNADNA的變性：堿變性的變性：堿變性

18、SouthernSouthern轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素硝酸纖維素(NC)(NC)膜、尼龍膜膜、尼龍膜毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法 探針的制備探針的制備 SouthernSouthern雜交雜交 雜交結(jié)果的檢測(cè)雜交結(jié)果的檢測(cè)1DNA的變性解鏈: 數(shù)倍體積的1.5mol/L NaCl和0.5mol/L NaOH中1小時(shí)2. 中和: 然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl （pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時(shí)3轉(zhuǎn)移: 變性DNA在硝酸纖維素膜, 尼龍膜上的固定。硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45um）用6SSC浸泡30min，DN

19、A樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，然后再在80真空干燥2h or UV cross link。 4預(yù)雜交: 預(yù)熱至60的預(yù)雜交液（6SSC，0.5%SDS，5Denhardt液，100g/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，調(diào)濃度至10g/ml，用前放100水溶液中煮沸變性10min，Southern轉(zhuǎn)膜變性轉(zhuǎn)膜變性雜交雜交: 5雜交: 盡可能擠凈預(yù)雜交液，溶液的組成是6SSC，0.01mol/L EDTA，變性的標(biāo)記核酸探針，5Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml變性的鮭魚精DNA。雜交反應(yīng)在68水浴中進(jìn)行，時(shí)間一般為4-20h。 6洗膜: 2SSC

20、和0.5% SDS溶液室溫下漂洗5min, 2SSC和0.1% SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動(dòng)), 0.1%SSC和0.5%SDS溶液中,68輕輕搖動(dòng)保溫2h，洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12以下，Tm=69.3+0.41(G+C）% 。 7結(jié)果顯示: 放射自顯影法，只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時(shí)至數(shù)天，再顯影，定影即可. 暴光通常在-20或- 80 , Phosphorimage定量轉(zhuǎn)移緩沖液轉(zhuǎn)移緩沖液 121204 cell clones DNA digested with EcoRI12345678910m1112131415161718191:12:33:124:385

21、:406:417:568:639:6510:67M:1kbmarker11:7412:7513:7614:7715:7816:9517:9818:10119:235Assay the copy number of provirus in HT1080 with Southern blot 191817161514131211M109876543211:12:33:124:385:406:417:568:639:6510:67M:1kbladder11:7412:7513:7614:7715:7816:9517:9818:10119:235121004 cell clones DNA diges

22、ted with EcoRI12345678910m1112131415161718191:542:963:974:2245:2316:2327:2338;235/nondigested9:23610:239M:1kbladder11:24012:24413:24514:24815:25216:28617:29018:30119:313Assay the copy number of provirus in HT1080 with Southern blot191817161514131211M109876543211:542:963:974:2245:2316:2327:2338;235/u

23、ndigested9:23610:239M:1kbmarker11:24012:24413:24514:24815:25216:28617:29018:30119:313NorthernNorthern印跡雜交（印跡雜交（Northern blottingNorthern blotting） 這是一種將這是一種將待測(cè)待測(cè)RNARNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印并固定到膜從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印并固定到膜上、然后再與上、然后再與已知的已知的DNADNA或或RNARNA探針探針雜交的方法。雜交的方法。 DNA DNA印跡技術(shù)由印跡技術(shù)由SouthernSouthern于于19751975年創(chuàng)建，稱為年創(chuàng)建，稱為S

24、outhernSouthern印跡技術(shù)，印跡技術(shù)，RNARNA印跡技術(shù)正好與印跡技術(shù)正好與DNADNA相對(duì)應(yīng)，故被相對(duì)應(yīng)，故被稱為稱為NorthernNorthern印跡雜交。印跡雜交。 Northern Northern 印跡雜交的印跡雜交的RNARNA轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)移與SouthernSouthern印跡雜印跡雜交的交的DNADNA轉(zhuǎn)移方法類似，只是在進(jìn)樣前用甲基氫氧化銀、轉(zhuǎn)移方法類似，只是在進(jìn)樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使乙二醛或甲醛使RNARNA變性，而不用變性，而不用NaOHNaOH，因?yàn)樗鼤?huì)水解，因?yàn)樗鼤?huì)水解RNARNA的的2-2-羥基基團(tuán)。羥基基團(tuán)。RNA + DNA /RNARN

25、A + DNA /RNA雜交雜交用途：用途： 1): 基因表達(dá)基因表達(dá)(mRNA)定性定量定性定量 2): transcripts(mRNA) splicing 探針探針: DNA、RNA 探針探針Northern印跡雜交印跡雜交 Northern blottingRNA甲醛凝膠電泳和吸印方法甲醛凝膠電泳和吸印方法1. 試劑：試劑： 10MSE緩沖液：緩沖液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，醋酸鈉，1mmol/L EDTA pH8.0。 5載樣緩沖液：載樣緩沖液：50%甘油，甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)

26、。 甲醛：用水配成甲醛：用水配成37%濃度（濃度（12.3mol/L），應(yīng)在通風(fēng)柜中操作），應(yīng)在通風(fēng)柜中操作，pH高于高于4.0。 20SSC； 去離子甲酰胺；去離子甲酰胺； 50mmol/L NaOH(含含10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris，pH7.5。 2.電泳步驟：電泳步驟： （1）40ml水中加水中加0.7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60，加，加7ml10MSE緩沖液緩沖液, 11.5ml 甲醛，加水定容至甲醛，加水定容至70ml，混勻，混勻后倒入盛膠槽。后倒入盛膠槽。 （2）等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入）等膠凝固后，去掉梳子和

27、膠布，將盛膠槽放入1MSE緩沖液的電泳槽。緩沖液的電泳槽。 （3）使）使RNA變性（最多變性（最多20g），），RNA4.5ul,10MSE緩沖緩沖液液2ul，甲醛，甲醛3.5ul，去離子甲酰胺，去離子甲酰胺10ul。 （4）55加熱加熱15min，冰浴冷卻。，冰浴冷卻。 （5）加）加2ul5載樣緩沖液。載樣緩沖液。（6）上樣、同時(shí)加）上樣、同時(shí)加RNA marker/ladder。 （7）60伏電泳過夜。伏電泳過夜。 （8）取出凝膠，水中浸泡）取出凝膠，水中浸泡2次，每次次，每次5min。 （9）將膠浸到）將膠浸到50mmol/L NaOH和和10mmol/L NaCl中中45min， 水解

28、高分子水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。 （10）將膠浸到）將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中中45min,使膠中和。使膠中和。 （11）20SSC洗膠洗膠1h。 （12）20SSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。 （13）取出硝酸纖維素膜，）取出硝酸纖維素膜，80真空烘烤真空烘烤2 hNorthern blot 與與Southern blot 相似相似轉(zhuǎn)移方法與雜交程序轉(zhuǎn)移方法與雜交程序:M10802496107115206228241243 M1080249610711520622824124328S18S 核糖核酸酶保護(hù)分析（核

29、糖核酸酶保護(hù)分析（RibonucleaseRibonuclease Protection Protection AssayAssay，RPARPA）是一種）是一種高通量高通量，各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)，各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)Northern Northern BlotingBloting的的mRNAmRNA定量檢測(cè)技術(shù)。定量檢測(cè)技術(shù)。 利用利用32P-32P-（放射法）或生物素（非放法）標(biāo)記由多（放射法）或生物素（非放法）標(biāo)記由多個(gè)目標(biāo)基因的個(gè)目標(biāo)基因的DNADNA模板體外轉(zhuǎn)錄出的長(zhǎng)短不一的反義模板體外轉(zhuǎn)錄出的長(zhǎng)短不一的反義RNARNA探針，探針，將含過量探針的溶液與樣品總將含過量探針的溶液與樣品總RN

30、ARNA雜交，雜交，經(jīng)核糖核酸酶經(jīng)核糖核酸酶（RNaseRNase）處理后，未與探針雜交的單鏈處理后，未與探針雜交的單鏈RNARNA和過量的游離探和過量的游離探針被降解，而目標(biāo)針被降解，而目標(biāo)RNARNA則因與探針結(jié)合形成雙鏈而被則因與探針結(jié)合形成雙鏈而被保護(hù)保護(hù)，則雜交則雜交雙鏈雙鏈RNARNA的量代表了樣本中相應(yīng)基因的表達(dá)量的量代表了樣本中相應(yīng)基因的表達(dá)量。核糖核酸酶保護(hù)分析核糖核酸酶保護(hù)分析液相雜交液相雜交 信號(hào)檢測(cè)：信號(hào)檢測(cè)： 對(duì)于放射性對(duì)于放射性RPARPA，雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電，雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電泳，用泳，用放射自顯影放射自顯影或或磷屏成像系統(tǒng)磷屏成像系統(tǒng)檢測(cè)

31、被保護(hù)的探針的檢測(cè)被保護(hù)的探針的信號(hào)。信號(hào)。 對(duì)于非放的對(duì)于非放的RPARPA，雜交雙鏈經(jīng)過變性聚丙酰胺凝膠電，雜交雙鏈經(jīng)過變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，UVUV照射使被保護(hù)的照射使被保護(hù)的RNARNA探針與膜交探針與膜交聯(lián)而固定，再用試劑盒提供的鏈霉親和素辣根過氧化聯(lián)而固定，再用試劑盒提供的鏈霉親和素辣根過氧化物酶（物酶（StreptavidinStreptavidin-HRP-HRP）和）和化學(xué)發(fā)光底物化學(xué)發(fā)光底物與膜上與膜上biotinbiotin標(biāo)記的探針結(jié)合，這樣，再將膜放入暗盒中暴露標(biāo)記的探針結(jié)合，這樣，再將膜放入暗盒中暴露于于X X射線膠片或者用射線膠

32、片或者用CCDCCD照相機(jī)檢測(cè)雜交探針的信號(hào)。照相機(jī)檢測(cè)雜交探針的信號(hào)。 根據(jù)適當(dāng)大小的探針片斷的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)定量待測(cè)樣本中根據(jù)適當(dāng)大小的探針片斷的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)定量待測(cè)樣本中該探針該探針RNARNA代表的基因表達(dá)水平。代表的基因表達(dá)水平。放射性放射性RPA放射性非放的放射性非放的RPA 用于電泳后凝膠的干燥 干燥時(shí)間：20-40minRPA RPA vsvs Northern Blot Northern Blot 之優(yōu)勢(shì)：之優(yōu)勢(shì)： 1): 1): 過量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，過量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成， 反應(yīng)更加完全反應(yīng)更加完全 2): RPA2): RPA比比Nort

33、hern BlotNorthern Blot靈敏靈敏1515150150倍，適合檢測(cè)倍，適合檢測(cè) 各種表達(dá)水平之基因各種表達(dá)水平之基因 3): 3): RPARPA通量高通量高，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，可評(píng)價(jià)他們?cè)?，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，可評(píng)價(jià)他們?cè)?同一情況下的差異表達(dá)同一情況下的差異表達(dá) 4): 4): 快速快速, , 一次一次RPARPA就能完成就能完成10 10 多次多次Northern Northern Blot Blot的工作，加快研究速度的工作，加快研究速度 1 1菌落原位雜交菌落原位雜交（colony in situ hybridization） 是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上

34、，是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出釋放出DNADNA，將，將DNADNA烘干烘干固定于膜上與固定于膜上與32P32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)、并與主平板上的菌落對(duì)位。菌落雜交信號(hào)、并與主平板上的菌落對(duì)位。 實(shí)驗(yàn)步驟如下：實(shí)驗(yàn)步驟如下： Master plate: Master plate: 將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素 的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落種的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落種 于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板于濾膜和主

35、瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板 上菌落位置相同。上菌落位置相同。 培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1-2mm1-2mm大小的菌落。大小的菌落。 在一塊平皿中置在一塊平皿中置4 4張濾紙，用張濾紙，用10%SDS10%SDS浸透，倒掉浸透，倒掉 多余液體，將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙多余液體，將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙 上，菌落面在上，注意防止濾膜底面存有氣泡。上，菌落面在上，注意防止濾膜底面存有氣泡。 Masterplate 5min5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/L 0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaClNaOH,1.5mol/

36、LNaCl）浸濕的濾紙上，放置）浸濕的濾紙上，放置10min10min。 將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/L 1.5mol/L NaClNaCl, 0.5mol/L , 0.5mol/L Tris-HClTris-HCl pH8.0) pH8.0)浸濕的濾紙上，放浸濕的濾紙上，放置置10min10min，重復(fù)中和一次。，重復(fù)中和一次。 將濾膜移至用將濾膜移至用2 2SSPESSPE溶液浸過的濾紙上，放置溶液浸過的濾紙上，放置10min10min，SSPESSPE配成配成2020貯備液：貯備液：3.6mol/L 3.6mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(

37、pH7.4)NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa220mmol/L EDTANa2（pH7.4)pH7.4)。 將濾膜用濾紙吸干，將濾膜用濾紙吸干，8080真空烘干真空烘干2h2h。 菌落原位雜交菌落原位雜交菌落原位雜交 斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交: :是將被檢是將被檢DNA/RNADNA/RNA點(diǎn)到膜上，烘烤點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（市售有多種多管吸印儀（ManifoldMa

38、nifold），如），如MinifoldMinifold和和、Bio-Bio-Dot(Bio-RadDot(Bio-Rad) )和和HybriHybri-Dot-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。膜烤干或紫外線照流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本。射以固定標(biāo)本。 2斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交（Dotblot）。 （1 1）DNADNA斑點(diǎn)雜交：斑點(diǎn)雜交： 先將膜在水中浸濕，再放到15SSC中。 將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點(diǎn)樣于膜上, 5l(210

39、g DNA)。 將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?（2 2）RNARNA斑點(diǎn)雜交：斑點(diǎn)雜交： 每個(gè)樣品至多加10g總RNA溶于5l DEPC水， 加 5l甲醛/SSC緩沖液（10SSC中含6.15mol/L甲 醛），使RNA變性，然后取5-8l點(diǎn)樣于處理好的濾膜 上，烘干。 5 5組織原位雜交組織原位雜交（Tissue in situ hybridization） 組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出解細(xì)菌釋出DNADNA，然后進(jìn)行雜交，而組織原位雜交是

40、，然后進(jìn)行雜交，而組織原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與內(nèi)與DNADNA或或RNARNA雜交。雜交。 原位雜交的探針原位雜交的探針: : 單鏈或雙鏈單鏈或雙鏈DNADNA，RNARNA。長(zhǎng)度長(zhǎng)度:100-400nt:100-400nt，過長(zhǎng)則，過長(zhǎng)則雜交率減低。雜交率減低。寡核苷酸探針（寡核苷酸探針（16-30 16-30 ntnt）能自由出入細(xì)）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長(zhǎng)探針雜交效率明顯高于長(zhǎng)探針. . 寡核苷酸探針寡核苷酸探針, , 小小DNADNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的探針或體外轉(zhuǎn)錄

41、標(biāo)記的RNARNA探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。 原位雜交原位雜交程序程序: 組織細(xì)胞的固定組織細(xì)胞的固定 預(yù)雜交預(yù)雜交 雜交雜交 沖洗沖洗 放射自顯影放射自顯影 / 免疫酶法顯色以顯示雜交結(jié)果免疫酶法顯色以顯示雜交結(jié)果 原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。 1): 1): 對(duì)致密染色體對(duì)致密染色體DNADNA的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的位置，對(duì)分裂期間核位置，對(duì)分裂期間核DNADNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；能排布； 2): 2): 與細(xì)胞與細(xì)胞RNARNA的雜交可精確分析任何一種的雜交可精確分析任何一種RNARNA在細(xì)胞中和組在細(xì)胞中和組織中的分布。此外，織中的分布。此外， 3):3):原位雜交還是