2013區(qū)基金中期評估-41實施方案

1、組織因子激活 ERK 通路在肝癌脈癌栓形成中的作用項目實施方案(一)內(nèi)容本項目擬期實驗的基礎(chǔ)上TF 介導(dǎo) ERK 信號調(diào)控肝癌脈癌栓形成的分子機制,針對 TF 或 ERK 進行靶向?qū)嶒炛委煾深A(yù)肝癌下 3 點：脈癌栓的形成，其主要內(nèi)容包括以（1）TF 介導(dǎo) ERK 信號調(diào)控肝癌脈癌栓形成的分子機制。對前述分離出來的肝癌門靜脈癌栓細胞，在用 RNAi 技術(shù)沉默 TF 的表達及抑制劑阻斷 ERK 激活后，用商業(yè)化的芯片、蛋白等方法檢測處理前后相應(yīng)的、蛋白的變化，重點關(guān)注金屬基質(zhì)蛋白酶類、促生成因子類、類、粘附分子類等，用 Western blot、定量 PCR 法進行驗證。并且比較用 RNAi 技術(shù)

2、沉默 TF 的表達與抑制劑阻斷 ERK 激活后引起情況，分析是否有除 ERK 外其他的信號通路也參與了 TF 介導(dǎo)的肝癌、蛋白改變的脈癌栓細胞的生長增殖和遷移侵襲。對確認(rèn)有改變的、蛋白，通過 RNAi 沉默表達及載體過表達、小分子抑制劑或激活劑等方法，它們在細胞生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過程中的作用，探討它們與肝癌（2）脈癌栓形成的相關(guān)性。TF 在肝癌、脈癌栓等組織、細胞株中的表達情況和臨床、病理等指標(biāo)的相關(guān)性。本課題首先利用依托于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，進一步收集臨肝癌合并脈癌栓患者的血清（包含術(shù)前、術(shù)后血清）、手術(shù)切除組織（包括正常肝組織、癌旁組織、癌組織、癌栓組織）和肝癌不合并脈癌栓患者血清（包

3、含術(shù)前、術(shù)后血清）、手術(shù)切除組織（包括正常肝組織、癌旁組織、癌組織）至少各 100 例，用 ELISA、Western blot、定量PCR 法等檢測血清、組織中 TF、pERK 及下游相關(guān)的表達與臨床、病理等指標(biāo)的相關(guān)性。分離培養(yǎng)、蛋白的表達情況，分析 TF、pERK 等的脈癌栓組織及相應(yīng)的肝癌組織的原代細胞至少各 3 對，同時收集常規(guī)肝癌細胞株包括 Bel-7402、HepG2、SK-Hep-1、SMMC-7721、Hep3B、HCC-9204、MHCC97-L(低轉(zhuǎn)移)、MHCC97-H（高轉(zhuǎn)移）等，綜合檢測這些細胞株 TF、pERK 及下游相關(guān)、蛋白的表達情況和生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等情況

4、。對于 TF 高表達的細胞，采用 RNAi 技術(shù)沉默 TF 的表達，然后檢測 pERK 及下游相關(guān)分子表達情況和生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等情況。對于 TF 低表達的細胞，采用載體介導(dǎo)的過表達 TF 方法，然后檢測pERK 及下游相關(guān)、蛋白的表達情況和生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等情況，系統(tǒng)分析 TF 的表達與這些指標(biāo)的相關(guān)性。（3）的肝癌體內(nèi)靶向 TF 或 ERK 進行實驗治療干預(yù)肝癌脈癌栓的形成。選取前述分離出來脈癌栓細胞 2-3 株，建外穩(wěn)定沉默 TF 表達的細胞株，然后在 鼠肝內(nèi)形成原位瘤，對比有無沉默 TF 時肝內(nèi)原位瘤大小數(shù)量脈癌栓形成等情況（ex vivo 實驗）。對成功建立的 鼠肝內(nèi)原位瘤模型，

5、采用尾靜脈注射針對 TF 的 siRNA 或者腹腔注射阻斷 ERK的抑制劑，對比有無沉默 TF 或阻斷 ERK 時肝內(nèi)原位瘤大小數(shù)量vivo 實驗）。脈癌栓形成等情況（in2.擬解決的關(guān)鍵問題（1）闡明 TF 介導(dǎo) ERK 信號調(diào)控肝癌脈癌栓形成的分子機制。（2）分析 TF 在肝癌、關(guān)性。脈癌栓等組織、細胞株中的表達情況和臨床、病理等指標(biāo)的相（3）探討體內(nèi)靶向 TF 或 ERK 進行實驗治療干預(yù)肝癌脈癌栓的形成的可能性。(二)11.1（1）方法、技術(shù)路線方法實時定量 PCR（Real timeive PCR）：Trizol 裂解細胞或液氮研磨組織粉末，氯丙醇和三氯甲烷法提取總 mRNA，瓊脂糖

6、凝膠電泳檢測 mRNA 純度和有無降解。（2）（3）按照 TAKARA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作行逆轉(zhuǎn)錄，得到總 cDNA;以 cDNA 為模板，按比例加入引物、Paster MIX， SYBR Green（每個樣本每個指標(biāo)做三個重復(fù)），按照 Arism7000 實時定量 PCR 儀操作規(guī)程檢測；（4）檢測指標(biāo) mRNA 的表達水平用儀器配套的 SDS1.1 軟件分析，內(nèi)參選擇 GAPDH。1.2 Western blot（1）（2）（3）（4）（5）（6）1.3（1）以含蛋白酶抑制劑的裂解液提取細胞或組織總蛋白，Bradford 法蛋白定量；90mA 恒流 SDS 電泳；90V 恒壓轉(zhuǎn)膜 120 分

7、鐘，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸染色，根據(jù) Marker 條帶位置和目的蛋白大小剪膜；含 5%脫脂奶粉和 TBST 封閉液常溫封閉膜 1h；4孵育 1 抗過夜；TBST 洗膜 10min3 次，常溫孵育 2 抗 1h； TBST 洗膜 10min3 次，ECL 法發(fā)光；圖像掃描、分析。細胞培養(yǎng)素膜；組織塊在培養(yǎng)皿中，剔除血污和壞死組織；剪碎加入膠原酶置于 37孵箱消化20min；（2）（3）（4）培養(yǎng)。 1.4（1）度；（2）鏡下觀察消化恰當(dāng)，200 目細胞篩網(wǎng)過濾至含胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中；濾液離心，棄上清，加入 D-Hands 液混勻，再次離心；去除上清，沉淀中加入 10%FBS DMEM 培養(yǎng)

8、液 2-3ml 懸浮細胞；移入細胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染六接種對數(shù)期生長的細胞，37，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，至細胞 80%匯合DNA/脂復(fù)合物配制：分別將 2g DNA 和 5l Lipofectamine 2000 稀釋于200lDMEM 無血清培養(yǎng)基中，室溫孵育 5min 后將兩者混合，使 DNA 與陽離子脂結(jié)合并室溫孵育 20min；（3）吸去細胞培養(yǎng)液，PBS 洗 2 遍，將上述 400l DNA/脂復(fù)合物和 400l 無血清 DMEM 培養(yǎng)基輕混合后加入六。在 37，5%CO2 培養(yǎng)箱溫育 4-6h；（4）（5）1.5吸去培養(yǎng)液，加入含 10%FBS 的 DMEM，37，5%CO2 培

9、養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24-48h；根據(jù)實驗?zāi)康奶崛?mRNA，或提取總蛋白或?qū)⒓毎苯佑糜诤罄m(xù)操作。穩(wěn)定細胞株篩選：（1）（2）（3）（4）（5）按照上述方法將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞（24），培養(yǎng) 24h；用含有 G418（500g/ml）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；更換培養(yǎng)（含 G418），如此培養(yǎng) 10-14 天；多數(shù)細胞于 10 天后，挑去部分呈島裝生長的細胞團于 96培養(yǎng)，擴增；提取總蛋白，行免疫印跡檢測目的蛋白的表達變化；符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)的細胞株為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，用于下一步實驗。1.6免疫組化和微密度（MVD）檢測（1）免疫組化：石蠟切片水化抗原修復(fù)5%BSA 封閉抗 4孵育過夜抗常溫孵育 1hEnvi析

10、。兩步法 DAB 顯色蘇木精復(fù)染脫水封片鏡下圖像，數(shù)據(jù)分（2）微密度判斷：凡染成棕黃色、數(shù)個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞作為一個計數(shù)。先用低倍鏡選?。?0）3 個高密度區(qū)域，再轉(zhuǎn)到鏡（200）下計數(shù)每個區(qū)域微1.7（1）數(shù)量，以其平均值作為每例的 MVD。細胞侵襲實驗Transwell 小室的底部加入含 10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，在 Transwell上室的膜上鋪以 50l 的 Matrigel 溶液，37放置過夜。（2）（3）20min；（4）1.8（1）棄除剩余液體后于膜上鋪 400l 的細胞懸液（含 1105 個細胞），繼續(xù)培養(yǎng) 6h；取出小室，棉簽擦除上室內(nèi)定的細胞，甲醇常溫固定 15

11、min，0.1%結(jié)晶紫染色顯微鏡下隨機挑取 10 個鼠體內(nèi)成瘤、轉(zhuǎn)移實驗鏡視野計數(shù)穿膜的細胞。胰酶消化收集處于對數(shù)生長期的細胞，PBS 洗 3 次，離心沉淀，充分吹打懸浮于無血清 DMEM 培養(yǎng)液中；（2）根據(jù)實驗?zāi)康母闻K原位給每只 鼠注射 106 個細胞（0.1ml 懸液）：SPF 飼養(yǎng)小鼠，觀察小鼠生存期，小鼠取瘤計算大?。ㄒ杂螛?biāo)卡尺測量腫瘤的長（a）短（b）徑，計算腫瘤的大小：1/2 *ab2）；計數(shù)肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目，組織切片鏡下觀察門脈癌栓的情況和密度。2技術(shù)路線本項目的技術(shù)路線如下圖 2：圖 2 本項目的技術(shù)路線圖(三)項目進度及階段目標(biāo)in vivoex vivoTFpERKTFpERK2014 年 1 月 - 2014 年 4 月TF 激活 ERK 信號調(diào)控肝癌 脈癌栓形成的分子機制； 相關(guān)前期實驗試劑盒耗材；為項目開展做好前期準(zhǔn)備。2014 年 5 月 - 2014 年 12 月收集性肝癌伴脈癌栓患者標(biāo)本和臨床資料。TF 在肝癌、脈癌栓等組織、細胞株中的表達情況和臨床、病理等指標(biāo)的相關(guān)性。2015 年 1 月 - 2015 年 9 月體內(nèi)靶向 TF 或 ERK 進行實驗治療干預(yù)肝