分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA

1、實(shí)驗(yàn)三、瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA1201504 課件作者:蔣華云你提取的質(zhì)粒DNA怎么樣？準(zhǔn)備配試劑提取質(zhì)粒DNA是否提取到質(zhì)粒DNA？質(zhì)粒DNA質(zhì)量怎么樣？實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料2012-3-13課件作者：蔣華云22201504 課件作者:蔣華云電泳原理帶電物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動稱為電泳。凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為蛋白質(zhì)、核酸研究的首選標(biāo)準(zhǔn)方法。泳動率是帶電顆粒在一定的電場強(qiáng)度下，單位時間內(nèi)在介質(zhì)中的遷移距離。樣品的物理性狀（分子大小、電荷多少、顆粒形狀和空間構(gòu)型）支持物介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）電場強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度（最適

2、離子強(qiáng)度一般在0.020.2之間）2012-3-13課件作者：蔣華云33201504 課件作者:蔣華云DNA分子在瓊脂糖凝膠中DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動在一定的電場強(qiáng)度下， DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子2012-3-13課件作者：蔣華云44201504 課件作者:蔣華云不同構(gòu)型的質(zhì)粒DNA超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（covalently closed circular D

3、NA，簡稱CCCDNA）開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA一條鏈斷裂（open circular DNA，簡稱OCDNA）線狀質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA二條鏈斷裂（linear DNA，簡稱L DNA）2012-3-13課件作者：蔣華云55201504 課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)儀器分析天平微波爐（電爐）移液器（10uL）瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（水平槽）紫外線透射儀（或凝膠成像系統(tǒng)）2012-3-13課件作者：蔣華云66201504 課件作者:蔣華云瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（水平槽）7201504 課件作者:蔣華云水平槽電泳系統(tǒng)的使用緩沖液染料指示劑瓊脂糖凝膠電泳儀8201504 課件作者:蔣

4、華云電泳正在進(jìn)行電泳儀DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。 點(diǎn)樣端靠近負(fù)極DNA分子在凝膠中移動9201504 課件作者:蔣華云材料與試劑質(zhì)粒DNADNA marker 2000DNA marker 100001TAE(電泳緩沖液)6凝膠加樣緩沖液瓊脂糖1%溴化乙錠溶液（EB）（注意： EB 具有毒性，戴手套操作）10201504 課件作者:蔣華云實(shí)驗(yàn)操作步驟膠板的制備制備1%瓊脂糖凝膠加樣記錄點(diǎn)樣的順序和點(diǎn)樣量電泳DNA的遷移速度和電壓成正比，最高的電壓不超過5V/cm， DNA片段從負(fù)極向正極移動，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑移動到距凝膠前沿12cm處時，停止電泳。 90V恒

5、壓電泳25min實(shí)驗(yàn)報告請詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過程11201504 課件作者:蔣華云操作詳解制備1%瓊脂糖凝膠（1）按水平槽制膠板操作說明，將制膠板安裝好，調(diào)節(jié)水平。（2）稱取0.3g瓊脂糖，加30mL1TAE電泳緩沖液，微波爐加熱至完全透明，涼卻至60度時，加入1L1%EB，搖勻倒板。記錄加樣的順序和加樣量（3）待瓊脂糖凝膠完全凝固，將膠板放入電泳槽，加入1TAE電泳緩沖液，通常加至沒過膠面2mm，拔去梳子。（4） 選擇一個加樣孔加入5LDNA marker 2000或15000（5）吸取5 L樣品DNA和1 L 6凝膠加樣緩沖液混勻，加入加樣孔。（注意：此混勻操作可在一次性手套上完成。）電泳（6）接通電泳槽和電泳儀電源，調(diào)節(jié)電壓為90V，穩(wěn)壓電泳25分鐘。（注意：DNA片段從負(fù)極向正極移動，即加樣端靠近電泳槽負(fù)極。）12201504 課件作者:蔣華云結(jié)果檢測在紫外燈（360nm，312nm，254nm）下觀察電泳凝膠，DNA存在處顯出桔紅色熒光條帶?！咀贤馔干鋬x】記錄觀察結(jié)果或拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果【402房間】注意：紫外線對眼睛有傷害作