《血紅蛋白的提取和分離》課件9（64張）（人教版選修1）

1、2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究課題3 血紅蛋白的提取和分離(一）蛋白質(zhì)占細(xì)胞干重的50以上，細(xì)胞中含量最多的有機(jī)物2、組成元素C、H、O、N一、基礎(chǔ)知識(shí)1、含量3、相對(duì)分子質(zhì)量高分子化合物4、基本組成單位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸連接方式脫水縮合8、分子結(jié)構(gòu)7、肽鍵CONH氨基酸肽鏈蛋白質(zhì)脫水縮合盤曲折疊（一條或者多條）10、生理功能細(xì)胞和生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是人體發(fā)育和組織更新的主要原料，具有運(yùn)輸、調(diào)節(jié)、免疫、催

2、化等作用，是一切生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者氨基酸的種類不同；數(shù)目成百上千；排列順序變化多端；多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)千差萬(wàn)別9、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性氨基酸間脫水縮合時(shí)，原來(lái)的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一個(gè)氨基，另一端只有一個(gè)羧基（不計(jì)R基上的氨基和羧基）。所以對(duì)于一條多肽鏈說(shuō)，至少應(yīng)有的氨基和羧基都是一個(gè)若有個(gè)n氨基酸分子縮和成m條肽鏈,則可形成n - m個(gè)肽鍵,脫去個(gè)n - m個(gè)水分子，至有氨基和 羧基各m個(gè)11、相關(guān)計(jì)算蛋白質(zhì)可以含有一條或n條肽鏈、肽鏈通過(guò)化學(xué)鍵（如二硫鍵）互相連接，具有不同的空間結(jié)構(gòu)關(guān)于蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的計(jì)算： n 個(gè)氨基酸形成m條肽鏈，每個(gè)氨基酸的平均相對(duì)質(zhì)量

3、為a,那么由此形成的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為n a - (n - m) 181、分離生物大分子的基本思路選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子2、 蛋白質(zhì)分離和提取的原理根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同蛋白質(zhì)(二）蛋白質(zhì)的提取3、高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)4、人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含

4、量豐富便于提取血紅蛋白（三） 凝膠色譜法實(shí)例：葡聚糖、瓊脂糖3、凝膠1、別名：分配色譜法性質(zhì)：一些微小多孔的球體，內(nèi)含許多貫穿的通道2、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來(lái)進(jìn)行分離大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道4、凝膠色譜法的原理分子篩效應(yīng)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢5、具體過(guò)程蛋白質(zhì)分子量的大小4、依據(jù)的

5、特性（四）緩沖溶液 1、概念在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液能夠抵制外界的酸或堿的對(duì)溶液的PH值的影響，維持PH基本不變2、作用4、緩沖溶液的組分分類弱酸和弱酸鹽組合 H2CO3 NaHCO3 CH3COOH CH3COONa3、緩沖溶液的配制通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液弱堿和弱堿鹽 NH4OH NH4CL多元弱酸的酸式鹽和其他所對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽 NaH2PO4 Na2HPO4 KH2PO4 K2HPO4思考：在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩

6、沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)（五）電泳：1、概念帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程2、原理在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離3、類型瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳4、實(shí)例由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)

7、劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠十二烷基磺酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量應(yīng)用聚丙稀酰胺凝膠蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素原理 SDS作用為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中加入SDSSDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小 SDS作用機(jī)理討論：如何測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量？

8、使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售.二、實(shí)驗(yàn)操作樣品處理粗分離純化純度鑒定1、樣品處理（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟(1)血液組成（二）操作過(guò)程血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無(wú)機(jī)鹽磷脂葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90）兩個(gè)a肽鏈兩個(gè)一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)成分每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色組成及

9、作用本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來(lái)分離血紅蛋白選材(2)紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞目的除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過(guò)少洗滌操作A、采集血樣B、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果）C、吸取血漿：上層透明的黃色血漿D、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌E、低速離心（低速短時(shí)間）F、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒(méi)有黃色，表明洗滌干凈(3)血紅蛋白的釋放加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白(4)分離血紅蛋白溶液

10、過(guò)程將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體分離取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)(5)透析除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)過(guò)程透析目的2、凝膠色譜（1）凝膠色譜柱的制作取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃

11、管，兩端需用砂紙磨平底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底注意事項(xiàng)：安裝其他附屬結(jié)構(gòu)頂塞的制作打孔 安裝玻璃管組裝將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體（2）凝膠色譜柱的裝填凝膠的選擇A、材料“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克B、代表意義：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液凝膠的前處理凝膠色譜柱的裝填方

12、法A、固定B、裝填將色譜柱處置固定在支架上將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻注意：2、裝填凝膠柱時(shí)不得氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果 注意：2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)洗滌平衡（3）樣品加入與洗脫調(diào)節(jié)緩沖液面滴加透析樣品吸管吸1ml樣品加

13、到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊關(guān)閉出口樣品滲入凝膠床洗脫加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口小心加入pH為7的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml一試管，連續(xù)收集（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）討論：答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能注意：正確的加樣操作1、不要觸及破壞凝膠面2、貼壁加樣3、使吸管管口沿管壁

14、環(huán)繞移動(dòng)1、在血紅蛋白的整個(gè)過(guò)程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定

15、3、你能描述血紅蛋白分離的完整過(guò)程嗎？（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳2、試劑的配制丙烯酰胺和N, N-甲叉雙丙烯酰胺: 用去離子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液十二烷基硫酸鈉（SDS）: 用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存鑒定血紅蛋白純度1、目的用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液 TEMED ：作用通過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合用去離子水配制10% 過(guò)硫酸銨：作用提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液Tris甘氨酸電泳緩沖液 25 mmol/L Tris，250 mm

16、ol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS樣品處理液 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚藍(lán)，10%的甘油脫色液 10%的甲醇和10%的冰醋酸染色液 0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸1、由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行注意事項(xiàng)：2、TEMED和過(guò)硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命3、在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟完成。操作時(shí)要戴好一次性手

17、套 SDS-聚丙烯酰胺分離膠制備（1）根據(jù)廠家說(shuō)明書安裝電泳用的玻璃板（2）SDS聚丙烯酰胺凝膠制備用去離子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris緩沖液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的過(guò)硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長(zhǎng)再加0.5 cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高23 mm），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液3、電泳方法步驟用去離子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris緩沖液0.5 mL，10%的

18、SDS0.041 mL，10%的過(guò)硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合分離膠聚合完全后（約30 min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水（3）樣品處理配制SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液（5）加樣在電泳樣品中按11體積比加入樣品處理液，在100 溫度下加熱3 min，以使蛋白質(zhì)變性按順序加樣，加樣量通常為1025 L。樣品可以多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后(即進(jìn)行凝膠色譜分離之前)的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品（4）濃縮膠聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。 將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8 V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15 V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1 cm處，關(guān)閉電源（6）電泳（7）剝膠從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方