1、病原性真菌檢驗(yàn) 臨床微生物學(xué) (第三軍醫(yī)大學(xué)

1、厭氧性細(xì)菌及檢驗(yàn)1一定義有氧條件下不能生長(zhǎng)，無(wú)氧條件(不是絕對(duì)）下才可以生長(zhǎng)的一類(lèi)細(xì)菌1836年P(guān)asteur提出臨床上日益受到重視，60%臨床標(biāo)本存在厭氧菌感染-需要重視23二 分類(lèi) 1 有芽孢厭氧性細(xì)菌 一個(gè)梭菌屬包括83個(gè)種 2 無(wú)芽孢厭氧性細(xì)菌 40多個(gè)菌屬，300多個(gè)菌 種和亞種4三 感染分布原因臨床表現(xiàn)5厭氧菌在正常人體內(nèi)的分布厭氧菌皮膚上呼吸道口腔腸道尿道陰道一芽孢菌 G+桿菌 梭狀芽孢桿菌屬二無(wú)芽孢菌 （一）G+的桿菌 雙歧桿菌 （二） G-的桿菌 類(lèi)桿菌屬 （三）G+的球菌 消化球菌屬 （四）G-的球菌 韋榮氏菌屬000+000+0+6致病的原因1 組織缺氧或氧化復(fù)原電勢(shì)降低

2、 穿刺傷等封閉性傷口，血管壓迫，腫 瘤壓迫等等2 機(jī)體免疫力低下7臨床的表現(xiàn)1 感染部位產(chǎn)生大量氣體，組織膿腫和壞 死，皮下有捻發(fā)音，是產(chǎn)氣夾膜梭菌感 染的特征2分泌物有惡臭，或?yàn)榘导t色，分泌物涂 片經(jīng)革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，而培養(yǎng)陰 性的3 其它等等8厭氧菌標(biāo)本的采集和送檢標(biāo)本的采集和送檢- 1 標(biāo)本決不能被正常菌群污染； 2 應(yīng)盡量防止空氣9標(biāo)本的采集標(biāo)本來(lái)源收集的方法封閉性膿腫婦女生殖道下呼吸道分泌物胸腔竇道，子宮腔，深部創(chuàng)傷組織尿道針管抽取后穹隆穿刺抽取肺穿刺術(shù)胸腔穿刺術(shù)靜脈注射的塑料導(dǎo)管穿入無(wú)菌外科切開(kāi)上陰部膀胱穿刺10標(biāo)本的送運(yùn)與處理針筒送運(yùn)法無(wú)菌小瓶送運(yùn)法棉拭送運(yùn)法大量標(biāo)本送運(yùn)法組

3、織塊送運(yùn)法厭氧袋送運(yùn)法11別離和鑒定1213檢驗(yàn)的方法1 直接鏡檢 一些特殊的特點(diǎn)，臨床工作中的總結(jié) 可對(duì)初步判斷及臨床應(yīng)用做早一步的 指 導(dǎo)作用142 別離培養(yǎng)1 初步培養(yǎng)1 ）培養(yǎng)基的選擇 強(qiáng)化血瓊脂平板 卡那萬(wàn)古霉素凍溶血瓊脂平板 七葉苷膽汁平板等等152 ）標(biāo)本的接種 每份標(biāo)本應(yīng)接種3個(gè)培養(yǎng)平板，分別放置于有氧，無(wú)氧和含5%10%的CO2的容器中，有時(shí)需要專(zhuān)用的培養(yǎng)基163） 厭氧培養(yǎng)法 a 厭氧罐培養(yǎng)法 b 氣袋法 c 氣體噴射法 d 厭氧手套箱法 e 其它等等172 次代培養(yǎng)和厭氧菌確實(shí)定183 別離培養(yǎng)中可能失敗的原因 1）培養(yǎng)前為做標(biāo)本的直接涂片和染色鏡檢 2）標(biāo)本在空氣中放置

4、太久或接種時(shí)時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 3）未用新鮮配制的培養(yǎng)基194）未用選擇性培養(yǎng)基5）無(wú)適宜的厭氧罐或裝備出現(xiàn)問(wèn)題6）培養(yǎng)時(shí)間缺乏7）.20鑒定實(shí)驗(yàn) 1 形態(tài)和染色 重要的是為下一步的鑒定提供參考，時(shí)間 破傷風(fēng)梭菌革蘭氏染色改變拉絲實(shí)驗(yàn) 加KOH30g/l一滴，能拉絲為陰性不能為陽(yáng)性21PH 痤瘡丙酸桿菌7.0時(shí)陰性及多型性 6.0及以下革蘭氏陽(yáng)性桿菌 222 菌落性狀 1）色素 產(chǎn)黑色素類(lèi)桿菌210天可產(chǎn)生黑色素；溶齒放線菌培養(yǎng)34天產(chǎn)生粉紅色色素 2）溶血 產(chǎn)氣夾膜梭菌在新鮮的血瓊脂平板上可產(chǎn)生雙溶血環(huán) 3）熒光 233 抗生素敏感實(shí)驗(yàn)4一些特殊的敏感實(shí)驗(yàn) 聚茴香腦磺酸 鈉敏感實(shí)驗(yàn)5生化特性6氣液相色

5、撲7 PCR等等24有芽孢的厭氧菌簡(jiǎn)介 梭菌屬 G+ 陳舊性培養(yǎng)基G-25四 破傷風(fēng)梭菌大量存在于人和動(dòng)物的腸道糞便污染傷口被污染導(dǎo)致-注意消毒清潔芽孢為于頂部，呈鼓槌壯，直徑比菌體粗，呈梭狀可以被用來(lái)生物技術(shù)，外毒素致毒26一）生物學(xué)性狀 染色，培養(yǎng) 生化 對(duì)我們實(shí)驗(yàn)診斷來(lái)說(shuō)最重要27破傷風(fēng)梭菌菌體細(xì)長(zhǎng)，長(zhǎng)48um ，寬0.3 0.5um ，周身鞭毛，芽胞呈圓形，位于菌體頂端，直徑比菌體寬大，似鼓槌狀，是本菌形態(tài)上的特征。繁殖體為革蘭氏陽(yáng)性，帶上芽胞的菌體易轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。破傷風(fēng)梭菌為專(zhuān)性厭氧菌，最適生長(zhǎng)溫度為37pH7.07.5，28營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通瓊脂平板上培養(yǎng)2448小時(shí)后，可形成

6、直徑1mm 以上不規(guī)則的菌落，中心緊密，周邊疏松，似羽毛狀菌落，易在培養(yǎng)基外表遷徒擴(kuò)散。在血液瓊脂平板上有明顯溶血環(huán)，在皰肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)，肉湯渾濁，肉渣局部被消化，微變黑，產(chǎn)生氣體，生成甲基硫醇（有腐敗臭味）及硫化氫。2930一般不發(fā)酵糖類(lèi)，能液化明膠，產(chǎn)生硫化氫，形成吲哚，不能復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽。對(duì)蛋白質(zhì)有微弱消化作用。本菌繁殖體抵抗力與其他細(xì)菌相似，但芽胞抵抗力強(qiáng)大。在土壤中可存活數(shù)十年，能耐煮沸4050分鐘。對(duì)青霉素敏感，磺胺類(lèi)有抑菌作用。31二）致病性與免疫性破傷風(fēng)梭菌芽胞廣泛分布于自然界中可由傷口侵入人體，發(fā)芽繁殖而致病，但破傷風(fēng)梭菌是厭氧菌，在一般傷口中不能生長(zhǎng)，傷口的厭氧環(huán)境是

7、破傷風(fēng)梭菌感染的重要條件。窄而深的傷口（如剌傷），有泥土或異物污染，或大面積創(chuàng)傷、燒傷、壞死組織多，局部組織缺血或同時(shí)有需氧菌或兼性厭氧菌混合感染，均易造成厭氧環(huán)境，局部氧化復(fù)原電勢(shì)降低。有利于破傷風(fēng)桿菌生長(zhǎng)32破傷風(fēng)梭菌能產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素，即破傷風(fēng)痙攣毒素（Tetanospasmin）或稱(chēng)神經(jīng)毒素(Neurotoxin)。破傷風(fēng)毒痙攣毒素是一種神經(jīng)毒素，為蛋白質(zhì)，由十余種氨基酸組成不耐熱，可被腸道蛋白酶破壞，故口服毒素不起作用。在菌體內(nèi)的痙攣毒素是單一和一條多肽鏈，分子量15萬(wàn)。破傷風(fēng)毒素的毒性非常強(qiáng)烈，僅次于肉毒毒素。破傷風(fēng)梭菌沒(méi)有侵襲力33三）微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本采集檢驗(yàn)程序檢驗(yàn)方法和鑒定3

8、4五 氣性壞疽病原菌以組織壞死，水腫，產(chǎn)氣及全身中毒的嚴(yán)重的急性外傷感染包括很多-重點(diǎn) 產(chǎn)氣夾膜梭菌35產(chǎn)氣夾膜梭菌生物學(xué)性狀 形態(tài)和染色 培養(yǎng)特性 生化反應(yīng)致病性36為革蘭氏陽(yáng)性粗大梭菌，3411.5um。單獨(dú)或成雙排列，有時(shí)也可成短鏈排列。芽胞呈卵圓形，芽胞寬度不比菌體大，位于中央或末次端。培養(yǎng)時(shí)芽胞少見(jiàn)，須在無(wú)糖培養(yǎng)基中才能生成芽胞。在膿汁、壞死組織或感染動(dòng)物臟器的涂片上，可見(jiàn)有明顯的莢膜，無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。37厭氧程度不如破傷風(fēng)梭菌要求高。在血液瓊脂平板上菌落較大、灰白色、不透明，邊緣呈鋸齒狀，多數(shù)菌株有雙層溶血環(huán)，內(nèi)環(huán)是毒素的作用，而外環(huán)不完全溶血是a毒素所致。不能消化已凝固的蛋白質(zhì)

9、和血清。38在皰肉培養(yǎng)基中肉渣不被消化，有時(shí)呈肉紅色。在牛乳培養(yǎng)基中能分解乳糖產(chǎn)酸，使酪蛋白凝固，同時(shí)生成大量氣體，將凝固的酪蛋白沖成海棉狀碎塊。管內(nèi)氣體常將覆蓋在液體上的凡士林層向上推擠，這種現(xiàn)象稱(chēng)為“洶涌發(fā)酵，是本菌的特點(diǎn)之一。3940能分解多種糖類(lèi)，如葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵甘露糖或水楊苷，能液化明膠，產(chǎn)生硫化氫，41致病條件與破傷風(fēng)梭菌相似。產(chǎn)氣莢膜梭菌既能產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素，又有多種侵襲性酶，并有莢膜，構(gòu)成其強(qiáng)大的侵襲力，引起感染致病。421氣性壞疽2食物中毒3急性壞死性腸炎431直接涂片鏡檢 從傷口深部取材涂片，革蘭氏染色鏡檢，可見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性大桿菌，并有莢膜，常伴有其他雜菌，白細(xì)胞甚少，形態(tài)不規(guī)則，這是氣性壞疽標(biāo)本涂片的特點(diǎn)。442別離培養(yǎng)與鑒定 取壞死組織制成懸液，接種于血球脂平板上或皰肉培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。取細(xì)菌培養(yǎng)物涂片鏡檢，并進(jìn)一步用生化反應(yīng)鑒定。453動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 取培養(yǎng)液0.51ml給小鼠或家兔靜脈內(nèi)注射，10分鐘后殺死動(dòng)物，置3758