環(huán)境微生物學(xué)：chI3微生物生理特征4遺傳

1、微生物的遺傳與變異1 DNA2 基因3 基因突變4 基因重組5 質(zhì)粒6 遺傳工程DNA遺傳與變異的物質(zhì)基礎(chǔ)Grifith, 1928Avery, Macleod & Mac Carty, 1941Hersey & Chase, 1952RII型(活)SIII型(活)SIII型(死)肺 炎 雙 球 菌Grifith, 1928RII型(活)SIII型(活)SIII型(死)肺 炎 雙 球 菌Grifith, 1928RII型(活)SIII型(活)SIII型(死)Grifiths conclusionDNA是遺傳物質(zhì)RII型(活)SIII型(活)肺 炎 雙 球 菌莢膜多糖蛋白質(zhì)RNADNAAvery

2、, Macleod & Mac Carty, 1941RII型(活)SIII型(活)Conclusion:DNADNA是遺傳物質(zhì)病毒的感染（繁殖）過程吸附侵入復(fù)制與合成裝配釋放Hersey & Chase, 195232PO43-35SO42-32P35S攪拌 離心沉淀上清液：蛋白質(zhì)、35S沉淀物：細(xì)菌、32P只有DNA進(jìn)入了大腸桿菌體內(nèi)DNA是遺傳物質(zhì)基因遺傳功能單位結(jié)構(gòu)基因蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)編碼與合成控制操縱區(qū)操縱結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)基因控制結(jié)構(gòu)基因操縱子學(xué)說酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制ROzya結(jié)構(gòu)基因操縱區(qū)調(diào)節(jié)基因OOzya -半乳糖苷酶滲透酶轉(zhuǎn)乙酰基酶基因突變（gene mutation） 類型 選擇性

3、突變：營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）抗性突變型（resistant mutant）條件致死突變型（conditional lethal mutant）非選擇性突變：形態(tài)突變型（morphological mutant）抗原突變型（antigenic mutant）產(chǎn)量突變型基因突變（gene mutation） 特點(diǎn) 自發(fā)性稀有性：突變率106109誘變性：提高10105倍不對應(yīng)性：變量試驗(yàn)（fluctuation test） 涂布試驗(yàn)（Newcombe experiment）獨(dú)立性：穩(wěn)定性：可遺傳可逆性：正向突變（forward mutation）回復(fù)突變（reverse mutation

4、） 變量試驗(yàn)（fluctuation test）分裝培養(yǎng)涂布培養(yǎng)涂布5104/平板 12平板5.1103/菌落噴入T1培養(yǎng)重新涂布后噴入T1培養(yǎng)66共28個菌落共353個菌落培養(yǎng)涂布試驗(yàn)（Newcombe experiment）基因突變（gene mutation） 機(jī)制 堿基置換（轉(zhuǎn)換、顛換）移碼突變（缺失、添加）AGTC轉(zhuǎn)換顛換原始 轉(zhuǎn)換 顛換 插入 缺失 基因重組（gene recombination） 把兩個性狀不同的個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)遺傳分子的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組。 基因重組（gene recombination） 原核微生物 轉(zhuǎn)化（transf

5、ormation）轉(zhuǎn)染（transfection） 轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction） 接合（conjugation） 原生質(zhì)體融合（protoplast fusion） 真核微生物 有性雜交（sexual hybridization） 準(zhǔn)性雜交（parasexual hybridization） 轉(zhuǎn)化（transformation） 受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，從而獲得供體菌部分遺傳性狀。 轉(zhuǎn)化（transformation）供體菌(抽提)雙鏈DNA(吸附)感受態(tài)受體菌表面特定位點(diǎn)(轉(zhuǎn)入)雙鏈DNA解鏈，一條單鏈DNA降級，一條進(jìn)入受體菌(單鏈復(fù)制，同源

6、區(qū)段配對)雜合DNA區(qū)段(復(fù)制、表達(dá)、分離)外源基因復(fù)制、表達(dá)，轉(zhuǎn)化子/非轉(zhuǎn)化子 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）：理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。 CaCl2法：操作：1.將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成復(fù)合物。2.此時，將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激（90s），外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。3.將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出帶有外源D

7、NA分子的陽性克隆。意義：將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，不僅可以檢驗(yàn)重組載體是否構(gòu)建成功，最主要的是感受態(tài)細(xì)胞作為重組載體的宿主可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如蛋白質(zhì)表達(dá)純化等工作。轉(zhuǎn)染（transfection）轉(zhuǎn)染（transfection）： 抽提噬菌體或其他病毒的DNA或RNA，用以感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒后代。 轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction） 以缺陷噬菌體為媒介，將供體菌的DNA片段帶到受體菌細(xì)胞中，使后者獲得前者部分遺傳性狀。 轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction） 噬菌體(感染)供體菌(誤包)缺陷噬菌體(導(dǎo)入受體菌細(xì)胞)轉(zhuǎn)導(dǎo)子 mmm m m m m mmmmmm

8、mmmmmmm接合（conjugation） 通過供體菌和受體菌完整細(xì)胞間的直接接觸而傳遞大段DNA。 供體菌（雄）單鏈DNA(性菌毛)受體菌（雌）(雙鏈化、染色體交換、整合)接合子 原生質(zhì)體融合(protoplast fusion) 通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩個細(xì)胞原生質(zhì)發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子。去壁促融合劑電脈沖離心生壁分裂原生質(zhì)體融合(protoplast fusion)有性雜交(sexual hybridization) 性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代。 準(zhǔn)性雜交(parasexual hybridizat

9、ion) 通過準(zhǔn)性生殖使同種生物兩個不同菌株的體細(xì)胞發(fā)生融合，且以有絲分裂而不是減數(shù)分裂方式導(dǎo)致低頻率的基因重組，并產(chǎn)生重組子。 質(zhì)粒環(huán)狀的DNA分子染色體以外的遺傳物質(zhì)通常不影響宿主細(xì)胞的存亡能給宿主帶來具有選擇優(yōu)勢的基因獲得質(zhì)粒的細(xì)胞同時獲得質(zhì)粒所具有的性狀降解性質(zhì)粒編碼生物降解過程的關(guān)鍵酶類質(zhì)粒Chakrabarty連續(xù)融合法解脂菌+解芳烴質(zhì)粒+解萜烴質(zhì)粒+解多環(huán)芳烴質(zhì)粒多質(zhì)粒超級菌基因工程 基因工程的重要環(huán)節(jié)： 目的基因的獲得 載體的選擇 目的基因與載體DNA的體外重組 重組載體引入受體細(xì)胞 重組基因的表達(dá)及功能驗(yàn)證目的基因的獲得適當(dāng)供體細(xì)胞的DNA由mRNA合成cDNA（反轉(zhuǎn)錄酶作用

10、下）化學(xué)方法合成特定功能的基因載體的選擇微生物：細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體動物：SV40病毒植物：Ti質(zhì)粒 復(fù)制子能自我復(fù) 復(fù)制率高能在受體細(xì)胞內(nèi)增殖限定切口整合位置固定選擇性遺傳標(biāo)記工程菌易于分離 目的基因與載體DNA的體外重組 限制性核酸內(nèi)切酶處理、DNA末端結(jié)構(gòu)人為改性 BamHI（類型：Type II restriction enzyme ） 識別序列： 5 GGATCC 3形成嵌合體 重組載體引入受體細(xì)胞 轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等 16SrDNA方法鑒定細(xì)菌種屬細(xì)菌中包括有三種核糖體RNA，分別為5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，16SrRNA對應(yīng)于基因組DNA上的一段基因序列稱為16SrDNA基因由保守區(qū)和可變區(qū)組成