α-synuclein致病機(jī)制和轉(zhuǎn)基因帕金森疾病模型研究進(jìn)展

1、【基金項(xiàng)目】國家科技支撐計(jì)劃課題（2012BA139B02）和國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題（課題編號2011ZX09307-302）【作者簡介】張麗，女（1981-），博士，E-mail：.【通訊作者】張連峰E-mail： HYPERLINK mailto:Zhanglf Zhanglf.-synuclein致病機(jī)制和轉(zhuǎn)基因帕金森疾病模型研究進(jìn)展張麗，張連峰(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100021)【摘要】-synuclein是一種位于突觸前末梢的蛋白，是遺傳性和散發(fā)性帕金森病的特征性包涵體路易小體的主要成分。-

2、synuclein基因突變或者遺傳改變可導(dǎo)致帕金森病。大量研究揭示-synuclein參與了神經(jīng)元的變性過程。本文對- synuclein在帕金森疾病中的神經(jīng)元毒性機(jī)制以及- synuclein轉(zhuǎn)基因帕金森病動物模型研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。【關(guān)鍵詞】-突觸核蛋白；帕金森；疾病模型；轉(zhuǎn)基因【中圖分類號】R-33【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】The Advances in -synuclein Toxic Mechanisms and Transgenic Models of Parkinson Disease ZHANG Li, ZHANG Lian-feng (Key Laboratory of H

3、uman Disease Comparative Medicine, Ministry of Health, Peking Union Medical College (PUMC), Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences &Comparative Medicine Centre, Beijing 100021)【Abstract】-synuclein, a presynaptic protein, was found to be the major component of the

4、 lewy bodies in inherited and sporadic Parkinsons disease（PD）. -synuclein point mutations or genetic alteration can cause Parkinsons disease（PD）. It is thought to be involved in the processes of neurodegeneration. This paper reviewed the toxic mechanisms of - synuclein in Parkinson disease and - syn

5、uclein transgenic animal models. TOC o 1-3 h z u 【Key words】-synuclein；Parkson disease；Disease models；Transgenic帕金森病（Parkinsons disease，PD）是最常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變之一, 其主要癥狀是運(yùn)動功能的改變，如運(yùn)動過緩、靜止震顫、步態(tài)畸形和姿勢不穩(wěn)等病變，最后導(dǎo)致運(yùn)動能力喪失。流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著年齡增長PD患病率逐漸增高，55歲以上的人群中，帕金森病的患病率超過1%，65歲以上約為2%1。PD按遺傳發(fā)病形成可分為家族性與散發(fā)性兩種，家族性PD約占PD總數(shù)

6、的10%15%左右，具有明顯家族遺傳傾向（顯性或隱性），而散發(fā)性PD則占PD的絕大多數(shù)，無明顯遺傳傾向，但表現(xiàn)為某種遺傳易感性。- synuclein是一種位于突觸前末梢的蛋白，該基因的兩種錯義突變與家族性帕金森病密切相關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)- synuclein存在于許多神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的突觸末梢或細(xì)胞漿包涵體中，揭示該基因參與了神經(jīng)元的變性過程。1 -synuclein的表達(dá)與帕金森病-synuclein是一種分子量為14kD的小分子酸性可溶性蛋白。 - synuclein主要分布于神經(jīng)元突觸前末梢, 尤其在腦內(nèi)新皮層、海馬、嗅球、紋狀體、背側(cè)丘腦、下丘腦、黑質(zhì)及小腦等部位的神經(jīng)元胞液中含量更加

7、豐富2。PD病理特征是黑質(zhì)紋狀體多巴胺(Dopamine, DA)神經(jīng)元死亡，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)類蛋白質(zhì)物質(zhì)減少以及特征性Lewy小體（Lewy Body, LB）。LB內(nèi)多種蛋白質(zhì)富集，包括-synuclein、parkin、泛素等，其中，-synuclein蛋白是其主要成分。作為LB的重要組成部分，-synuclein既見于散發(fā)的帕金森病患者，又見于有-synuclein 基因突變的帕金森病患者3。在大小鼠中，過度表達(dá)的野生型或突變型-synuclein 均能引起人類帕金森病的部分關(guān)鍵表型和病理特征4。2 -synuclein神經(jīng)元毒性機(jī)制PD主要源于中腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元退行性變導(dǎo)致的細(xì)胞死亡

8、。-synuclein的異常表達(dá)、聚集與神經(jīng)元變性密切相關(guān)。根據(jù)目前的研究進(jìn)展，可以將-synuclein的神經(jīng)元毒性機(jī)制概括為如下四個方面。（1）-synuclein寡聚體和路易小體在-synuclein蛋白纖維化的過程中，存在-synuclein寡聚體、寡聚體中間構(gòu)象初原纖維(protofibrils)和最終的淀粉樣纖維包涵體（fibrillar inclusions）等不同聚集狀態(tài)5-6。首先，自然狀態(tài)下, -synuclein呈無序的未折疊結(jié)構(gòu)的單體, 但在高濃度時, 它可轉(zhuǎn)變成-synuclein寡聚體的中間構(gòu)象初原纖維(protofibrils), 與單體不同, 這類寡聚體富含B片

9、層結(jié)構(gòu)，在原子力顯微鏡及電鏡下，可以觀察到這類寡聚體的形成過程中，這類寡聚體先呈包含2030個-synuclein分子的圓柱狀結(jié)構(gòu), 隨后彼此聚合形成鏈條狀, 最終轉(zhuǎn)化可溶性纖維多聚體。最后，借助于微管轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞有時能將這些小球狀的聚集物形成更大的包涵體，其中包含了纖維狀的a-synuclein及其他幾種蛋白質(zhì)。其中寡聚體毒性機(jī)制可能是通過整合于細(xì)胞膜引起胞膜的瞬時通透性增加及膜內(nèi)包含物的外滲7-8,初原纖維多聚體的出現(xiàn)則與破碎的高爾基器相關(guān)，是細(xì)胞變性的早期特征9-10，而包涵體（如路易小體）的形成可能是細(xì)胞自我保護(hù)的一種方式。（2）線粒體功能障礙線粒體功能障礙（主要是呼吸鏈功能異常）導(dǎo)致A

10、TP合成衰竭也可出現(xiàn)帕金森病的臨床表現(xiàn)，使用相應(yīng)的藥物可使早期帕金森病患者的癥狀緩解。因此，線粒體功能障礙是PD研究中解釋神經(jīng)元損傷一個重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，-synuclein基因過度高表達(dá)促進(jìn)GT1-7細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)改變，如線粒體腫脹、嵴空泡化11，在PC12細(xì)胞中引起線粒體去極化和誘發(fā)線粒體依賴的細(xì)胞死亡12，而且，表達(dá)-synuclein的細(xì)胞對于蛋白復(fù)合體I抑制劑魚藤酮更加敏感13?，F(xiàn)已證實(shí)，-synuclein可與線粒體呼吸系統(tǒng)的關(guān)鍵酶細(xì)胞色素C氧化酶（COX）特異結(jié)合14。但是胞漿里的-synuclein如何接觸、作用于線粒體內(nèi)膜的機(jī)制尚有待闡明。（3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體應(yīng)激-sy

11、nuclein過表達(dá)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體囊泡運(yùn)輸障礙，進(jìn)而干擾細(xì)胞或者神經(jīng)元的正常功能15。在瞬時高表達(dá)-synuclein的COS7細(xì)胞中觀察到高爾基體碎片9，這可能是-synuclein異常積聚導(dǎo)致的結(jié)果。PC12細(xì)胞中過表達(dá)-synuclein，導(dǎo)致GRP 78和磷酸化的起始因子2（eIF-2）等兩種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑salubrinal能夠一定程度上防止細(xì)胞死亡16。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生在-synuclein誘導(dǎo)表達(dá)后的4-8個小時之后和細(xì)胞死亡之前。在-synuclein過表達(dá)果蠅模型上，通過增加囊泡運(yùn)輸調(diào)節(jié)蛋白Rab1的表達(dá)水平，能夠一定程度上減少-

12、synuclein誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元丟失15。值得警惕的是，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體應(yīng)激并不能完全逆轉(zhuǎn)多巴胺神經(jīng)元丟失，這表明在更復(fù)雜的系統(tǒng)中可能存在多種機(jī)制。然而，這些因素都還不能精確的解釋-synuclein如何影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的，也不能真正解釋DA神經(jīng)元群在PD中的選擇性損傷。（4）氧化應(yīng)激多巴胺能神經(jīng)元損傷是PD的主要病理特征，異常的a-synuclein聚集會破壞多巴胺的自身平衡，并增加黑質(zhì)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激。多巴胺在多巴胺能神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)合成后立即被轉(zhuǎn)運(yùn)到單胺能囊泡中儲存，如果未被儲存，多巴胺能夠自氧化生成有毒性的多巴胺醌類物質(zhì)，伴隨超氧化基和過氧化氫產(chǎn)生17-18。在多巴胺能神經(jīng)元中，變異a-

13、synuclein導(dǎo)致囊泡數(shù)量減少，胞質(zhì)內(nèi)多巴胺濃度升高，使多巴胺依賴的氧化應(yīng)激增強(qiáng)。在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)野生型和突變型的a-synuclein都會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，在多巴胺存在下，細(xì)胞存活數(shù)量大大減少，尤其是表達(dá)突變型的細(xì)胞19。因此，a-synuclein聚集和多巴胺引起的氧化應(yīng)激可能是PD發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。4. -synuclein帕金森動物模型為了闡明-synuclein在PD中的可能作用機(jī)制，人們開始嘗試建立各種動物模型包括轉(zhuǎn)基因模型和病毒載體注射等其它模型。這些轉(zhuǎn)基因模型不同程度模擬了PD患者的病理表型，如-synuclein蛋白的聚集和病理性沉積，轉(zhuǎn)基因動物表

14、現(xiàn)出運(yùn)動協(xié)調(diào)能力喪失等，表一對不同啟動子調(diào)控表達(dá)的-synuclein轉(zhuǎn)基因動物模型的表型進(jìn)行了比較。表一、-synuclein轉(zhuǎn)基因大鼠、小鼠模型的關(guān)鍵表型比較Table 1 Comparison of key phenotypes of -synuclein transgenic mice and rat models轉(zhuǎn)基因模型啟動子啟動子表達(dá)譜基因型運(yùn)動障礙黑質(zhì)神經(jīng)病變Synuclein聚集文獻(xiàn) 轉(zhuǎn)基因小鼠PDGF-神經(jīng)元中廣泛表達(dá)（新皮層，嗅球和中腦，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）WTA53T+-+4 17PrP神經(jīng)元表達(dá)包括運(yùn)動神經(jīng)元A30P+-18Teto四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)A53T+22thy

15、1 皮層及皮層下神經(jīng)元包括黑質(zhì)，不包括膠質(zhì)、脊髓和神經(jīng)肌肉神經(jīng)元WTA30P A53TNDNDND-+20 2019轉(zhuǎn)基因大鼠thy1 神經(jīng)元特異A30P-A53T-23注：thy1，酪氨酸酶相關(guān)蛋白1啟動子；PrP，朊蛋白啟動子； PDGF，血小板源生長因子啟動子；Teto，四環(huán)素誘導(dǎo)人工啟動子；ND，沒有檢測；-，是；+，否。Note: thy1, tyrosinase related protein 1 promoter; PrP, Prion protein promoter; PDGF，Platelet derived growth factor promoter; Teto，Tet

16、racycline inducible artificial promoter; ND，not detected; -，yes；+，no.（1） PDGF- SNCAWT轉(zhuǎn)基因小鼠模型Masliah等4制作和分析了人類野生型-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠可檢測到胞漿及核內(nèi)的有電子致密包涵體，DA能神經(jīng)元減少、紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase , TH）活性減低及運(yùn)動行為障礙等。與人類PD不同的是，黑質(zhì)內(nèi)DA能神經(jīng)元無變性缺失。（2） PDGF-SNCAA53T轉(zhuǎn)基因小鼠模型高寧等20建立了A53T突變型-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠，免疫組化顯示，轉(zhuǎn)基

17、因小鼠大腦海馬、新皮層、紋狀體區(qū)出現(xiàn)人-synuclein陽性標(biāo)記的細(xì)胞。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠存在明顯的進(jìn)行性運(yùn)動能力障礙。（3）PrP-SNCAA30P轉(zhuǎn)基因小鼠模型SNCAA30P轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出進(jìn)行性運(yùn)動能力障礙，如僵直、步態(tài)畸形和靜止震顫等。病理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性神經(jīng)膠質(zhì)增生，未發(fā)現(xiàn)LB樣-synuclein包涵體，黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元系統(tǒng)無退行變性21。（3）Thy1-SNCAA53T和Thy1-SNCAWT轉(zhuǎn)基因小鼠模型Putten等22制作了-synuclein野生型和A53T突變型小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)系統(tǒng)均出現(xiàn)了與PD病人相似的-synuc

18、lein病理學(xué)改變。（4）Thy1-SNCAA30P和Thy1-SNCAWT轉(zhuǎn)基因小鼠模型Kahle等23也通過建立轉(zhuǎn)基因鼠研究野生型和A30P突變型-synuclein的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)兩種類型的-synuclein在兩種轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)元和軸突中都有異常聚集。 （5）-Synuclein細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)基因小鼠（-synuclein BAC）Yamakado H等24建立人-synuclein BAC轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出焦慮樣行為（可能反映PD早期的非運(yùn)動癥狀）減少，下降的SERT表達(dá)水平可能提示其內(nèi)在分子機(jī)制。因此，-synuclein BAC轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為評價-synucl

19、ein劑量效應(yīng)的工具，具有重要研究價值。（6）四環(huán)素誘導(dǎo)型SNCAA53T轉(zhuǎn)基因小鼠（tetO-SNCAA53T）Lin X等25成功建立了tetO- SNCAA53T轉(zhuǎn)基因小鼠。與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)嚴(yán)重的運(yùn)動障礙和中腦多巴胺能（mDA）神經(jīng)元變性，模擬了PD關(guān)鍵的運(yùn)動表型和病理表型。而且，mDA神經(jīng)元也有明顯的亞細(xì)胞改變，如多巴胺釋放減少，高爾基體碎片，自噬體溶酶體系統(tǒng)損傷。此模型適用于PD的發(fā)病機(jī)制研究和-synuclein蛋白積聚引發(fā)的神經(jīng)損傷。（7）-synuclein轉(zhuǎn)基因大鼠帕金森模型（Thy-A30P -A53T）F. Lelan等26建立了Thy-A30P -A53

20、T轉(zhuǎn)基因SD大鼠，轉(zhuǎn)基因大鼠雖然不存在運(yùn)動障礙，但呈現(xiàn)出嗅覺障礙的PD早期非運(yùn)動表型。人-synuclein蛋白共定位于TH陽性的嗅球（OB）神經(jīng)元上，而前腦腦室下區(qū)SVZ區(qū)則不表達(dá)。Thy-A30P -A53T轉(zhuǎn)基因大鼠可以作為研究人突變的-synuclein對于嗅覺障礙的發(fā)展機(jī)制的有用工具。（8）重組腺伴隨病毒介導(dǎo)-synuclein過表達(dá)大鼠帕金森模型（rAAV-CBA-synuclein）大鼠黒質(zhì)紋狀體注射rAAV-CBA-synuclein載體，-synuclein野生型和突變型手術(shù)大鼠均表現(xiàn)出30-80%黒質(zhì)多巴胺神經(jīng)元丟失，紋狀體內(nèi)多巴胺水平下降40-50%。多巴胺神經(jīng)元丟失50

21、-60%以上的大鼠還表現(xiàn)出嚴(yán)重的運(yùn)動功能障礙27。因此，rAAV-CBA-synuclein大鼠可以作為一種PD模型，它成功復(fù)制了人PD的主要病理特征、神經(jīng)生化特征和行為學(xué)特征。綜上所述，大量研究工作揭示-synuclein與神經(jīng)元變性相關(guān)。首先，-synuclein蛋白聚集，形成具有疏水性的寡聚體，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。其次事件還包括ER內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激等。最后，以上事件激發(fā)的細(xì)胞死亡。這些結(jié)論都依賴于-synuclein相關(guān)動物模型的發(fā)展28-29。這些動物模型驚人地重現(xiàn)了PD疾病的早期特征。因此，應(yīng)合理地將其應(yīng)用到PD發(fā)病機(jī)制研究及其藥物治療研究等領(lǐng)域，為PD的研究提

22、供重要手段。參考文獻(xiàn)Zhen-Xin Zhang, Gustavo C Roman, Zhen Hong, et al. Parkinsons disease in China: prevalence in Beijing, Xian, and ShanghaiJ. The Lancet, 2005, 365(9459): 595-597.Recchia A, Debtto P, Negro A, et al. Alpha-synuclein and Parkinson s diseaseJ. The FASEB Journal, 2004; 18 (6): 617 626.Spillanti

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