淀粉酶活性測(cè)試

1、淀粉酶活性測(cè)試1淀粉酶活力的測(cè)定一、測(cè)試原理：淀粉遇碘產(chǎn)生藍(lán)色，可以在一定量的淀粉中加入不同量的淀粉酶制劑，一定時(shí)間后，不出現(xiàn)藍(lán)色且酶制劑用量最少的那個(gè)試液可以認(rèn)為剛好將淀粉全部分解，可根據(jù)酶制劑的用量、淀粉的用量以及反應(yīng)時(shí)間來計(jì)算該淀粉酶的活力。2二、儀器與試劑1.儀器恒溫水浴鍋；比色管(或試管)；溫度計(jì)。2.淀粉試液分別稱取可溶性淀粉50g(精確至0.01g)和食鹽5g,用少量蒸餾水分別溶解后，移入1000mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻備用。0.1mol/L的碘液：碘溶液：稱取1.3g碘片及3.5g碘化鉀，溶于100mL蒸餾水中，在棕色瓶中保存。酶制劑溶液：稱取(精確至0.01g)

2、淀粉酶制劑25g(或吸取25mL)，溶解后移入1000mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻備用。3三、操作步驟在已編號(hào)的10只比色管中分別加人5mL淀粉試液，另取一只比色管，內(nèi)盛蒸餾水，插入溫度計(jì)。一起放人恒溫水浴鍋中保溫(BF-7658 酶 60，胰酶40)，當(dāng)溫度恒定在所需溫度后，按管號(hào)分別加入1.0-1.9mL(間隔為0.1mL)配制好的酶制劑溶液，計(jì)時(shí)保溫60min。60min后，在每管中加人數(shù)滴0.1mol/L碘溶液。記錄不呈藍(lán)色且加入酶制劑溶液最少的試管中加入酶制劑溶液的體積V(mL)。4四、計(jì)算酶活力=mg/(gh)=W15(W2/1000)V1=5000W1W2V式中：wl稱

3、取淀粉的質(zhì)量，g；W2稱取酶制劑的質(zhì)量，g；V不呈藍(lán)色試管中淀粉酶用量最少所加酶制劑溶液的體積，mL。5五、說明由于酶制劑的活力變化較大，如完全按上述操作，所加酶制劑溶夜體積可能不一定在測(cè)試范圍中，因此可以先加大酶制劑溶液體積的間隔，找到一個(gè)大致用量，再在其左右用0.1mL的間隔較精確測(cè)定使淀粉剛好完全分解時(shí)所加入酶制劑溶液的體積。酶活力也可用酶的轉(zhuǎn)化力來表示，即計(jì)算每小時(shí)每克(或毫升)酶制劑轉(zhuǎn)化淀粉的克數(shù)。 6淀粉酶活力測(cè)定一、原理酶作用于淀粉溶液生成還原糖，然后加入費(fèi)林制劑，在加熱的情況下，定量地生成氧化亞銅沉淀。在加入碘化鉀和硫酸后，生成游離碘，此時(shí)，立即用硫代硫酸鈉溶液滴定。7二、試劑

4、和溶液 30%碘化鉀溶液：碘化鉀150g溶解于水350ml中，保存在褐色試劑瓶中，避免陽光直射；25%硫酸溶液：硫酸125g溶于375ml水中；0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液：將滴定分析用的0.1mol/L硫代硫酸鈉500ml用煮沸過的冷卻水稀釋，所得溶液的中體積為1000ml。配制好后，應(yīng)進(jìn)行標(biāo)定，求出濃度校正系數(shù)f值；81mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH5.0）：將1mol/L乙酸鈉溶液加入到1mol/L的乙酸溶液中，調(diào)pH到5.0?？扇苄缘矸廴芤海╬H5.0）：將可溶性淀粉（試劑級(jí)）在105干燥4h后稱量計(jì)算含水量。然后，根據(jù)可溶性淀粉的含水量稱取0.50g（折干）的可溶性淀粉，緩

5、慢加入到沸水50ml中，煮沸5min，用自來水冷卻后加入1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH5.0）5ml用水定容至100ml。9費(fèi)林試劑-銅溶液：硫酸銅34.66g溶解在水中，定容至500ml-酒石酸鉀鈉堿溶液：酒石酸鉀鈉173g和氫氧化鈉50g溶解在水中，定容至500ml； -使用前，精確地取等體積的銅溶液和堿液充分混合。10三、操作3.1 樣品溶液的制備 用水稀釋酶樣品，使得到酶也的（T0-T30）f1.62值為3mg-6mg葡萄糖量。 示例：真菌-淀粉酶：n=50000稀釋1ml250ml，再稀釋1ml200ml113.2 測(cè)定將可溶性淀粉溶液10ml加到100m三角瓶中，置于（40

6、0.5）恒溫水浴中。預(yù)熱10-15min,加入樣品稀釋酶液1ml。準(zhǔn)確加熱30min后。加入費(fèi)林試劑4ml使酶失活。將三角燒瓶直接在煤氣噴燈（或電爐）上加熱2min后，立即放在自來水中冷卻。隨后，加入30%碘化鉀溶液2ml和25%硫酸溶液2ml，用0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定游離出的碘，以藍(lán)色消失作為滴定終點(diǎn)T30（ml）空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)：以水取代酶液。在另一個(gè)三角燒瓶中用上述同樣的操作步驟測(cè)定空白對(duì)照值T0(ml)。臨近終點(diǎn)時(shí)，加入1%可溶性淀粉溶液1-2滴，以藍(lán)色消失作為滴定終點(diǎn)。12四、計(jì)算在本條件下，反應(yīng)30min，反應(yīng)液中產(chǎn)生相當(dāng)于10mg葡萄糖的還原糖所需的酶量，定義為一個(gè)淀粉

7、糖化酶活力單位。淀粉糖化酶活力按下式計(jì)算 淀粉糖化酶活力（u/ml）=（T0-T30）f1.621/10n式中：T30-酶反應(yīng)液滴定消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mlT0-空白溶液滴定消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 ，mlf-0.05mol/l硫代硫酸鈉溶液濃度的校正系數(shù)1.62-換算系數(shù)1/10-該分析方法的常數(shù)（相當(dāng)于10mg葡萄糖的還原糖）n-樣品的稀釋倍數(shù)13淀粉酶活力測(cè)定一、原理淀粉酶主要包括-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它們廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物界。不同來源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。植物中最重要的淀粉酶是-淀粉酶和-淀粉酶。-淀粉酶隨機(jī)作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部

8、分-1,4糖苷鍵，單獨(dú)使用時(shí)最終生成寡聚葡萄糖、-極限糊精和少量葡萄糖。 Ca2+能使-淀粉酶活化和穩(wěn)定，它比較耐熱但不耐酸，pH3.6以下可使其鈍化。14-淀粉酶從非還原端作用于-1,4糖苷鍵，遇到支鏈淀粉的-1,6鍵時(shí)停止。單獨(dú)作用時(shí)產(chǎn)物為麥芽糖和-極限糊精。-淀粉酶是一種巰基酶，不需要Ca2+及Cl-等輔助因子，最適pH偏酸，與-淀粉酶相反，它不耐熱但耐酸，70保溫15min可使其鈍化。通常提取液中-淀粉酶和-淀粉酶同時(shí)存在?？梢韵葴y(cè)定（+）淀粉酶總活力，然后在70加熱15min，鈍化-淀粉酶，測(cè)出-淀粉酶活力，用總活力減去-淀粉酶活力，就可求出-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀

9、粉生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸的顯色反應(yīng)來測(cè)定。還原糖作用于黃色的3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，生成物顏色的深淺與還原糖的量成正比。以每克樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的還原糖（麥芽糖）量表示酶活大小。15二、儀器、試劑和材料1.儀器1）電子天平；2）研缽；3）容量瓶100mL2個(gè)4）具塞刻度試管25Ml15支；5）試管8支6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支7）離心機(jī)；8）離心管9）恒溫水浴鍋；10）分光光度計(jì)162.試劑1）1%淀粉溶液；2）0.4mol/L氫氧化鈉；3）pH5.6檸檬酸緩沖液：稱取檸檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，為A液。稱取檸

10、檬酸鈉29.41g，溶解后定容至1000mL，為B液。取A液13.7mL與B液26.3mL混勻，即為pH5.6之緩沖液。4）3,5-二硝基水楊酸：精確稱取1g3,5-二硝基水楊酸溶于20mL1mol/L氫氧化鈉中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水稀釋至100ml，蓋緊瓶塞，防止CO2進(jìn)入。5）麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）稱取0.100g麥芽糖，溶于少量蒸餾水，定容至100mL。3.材料：萌發(fā)3天的小麥芽。17三、操作步驟1.酶液提取稱取2g萌發(fā)3天的小麥種子（芽長(zhǎng)1cm左右），置研缽中加少量石英砂和2m1左右蒸餾水，研成勻漿，無損地轉(zhuǎn)入100m1容量瓶中，用蒸餾水定

11、容至100m1，每隔數(shù)分鐘振蕩1次，提取20min。3000rmin離心l0min，轉(zhuǎn)出上清液備用。182.a-淀粉酶活力測(cè)定1）取試管4支，標(biāo)明2支為對(duì)照管，2支為測(cè)定管。2）于每管中各加酶液lml，在70士0.5恒溫水浴中準(zhǔn)確加熱15min，鈍化-淀粉酶。取出后迅速用流水冷卻。3）在對(duì)照管中加入4m10.4mol/L氫氧化鈉。4）在4支試管中各加入1mlpH5.6的檸檬酸緩沖液。5）將4支試管置另一個(gè)40士0.5恒溫水浴中保溫15min，再向各管分別加入40下預(yù)熱的1淀粉溶液2m1，搖勻，立即放入40恒溫水浴準(zhǔn)確計(jì)時(shí)保溫5min。取出后向測(cè)定管迅速加入4ml0.4mol/L氫氧化鈉，終止酶

12、活動(dòng)，準(zhǔn)備測(cè)糖。193.淀粉酶總活力測(cè)定取酶液5ml，用蒸餾水稀釋至100m1，為稀釋酶液。另取4支試管編號(hào)，2支為對(duì)照，2支為測(cè)定管。然后加入稀釋之酶液lml。在對(duì)照管中加入4m10.4mol氫氧化鈉。4支試管中各加1mlpH5.6之檸檬酸緩沖液。以下步驟重復(fù)-淀粉酶測(cè)定第（5）步的操作，同樣準(zhǔn)備測(cè)糖。204.麥芽糖的測(cè)定1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取25ml刻度試管7支，編號(hào)。分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸餾水使溶液達(dá)2.0ml，再各加3，5-二硝基水楊酸試劑2.0m1，置沸水浴中加熱5min。取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25m1?；靹蚝笥梅止夤舛扔?jì)在520nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，記錄吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以麥芽糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2）樣品的測(cè)定取步驟2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分別放入相應(yīng)的8支25ml具塞刻度試管中，各加入2m13,5-二硝基水楊酸試劑。以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。根據(jù)樣品比色吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出麥芽糖含量，最后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。21五、結(jié)果處理（AA0）xVT式中A為a-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖（mg）；Ao為a-淀粉酶的對(duì)照管中麥芽糖量（m