2生物大分子的制備ppt課件

1、2. 生物大分子的制備.2.1 概述 在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度開(kāi)展的今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的構(gòu)造與功能的研討是探求生命奧妙的中心課題，而生物大分子構(gòu)造與功能的研討，必需首先處理生物大分子的制備問(wèn)題，有可以到達(dá)足夠純度的生物大分子的制備任務(wù)為前題，構(gòu)造與功能的研討就無(wú)從談起。然而生物大分子的分別純化與制備是一件非常細(xì)致而困難的任務(wù)。 . 與化學(xué)產(chǎn)品的分別制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)： 生物資料的組成極其復(fù)雜，經(jīng)常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。 許多生物大分子在生物資料中的含量極微，分別純化的步驟繁多，流程長(zhǎng)。 許多生物大分子一旦分開(kāi)了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活，因

2、此分別過(guò)程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。 生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)展的，溫度、pH值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判別。 . 生物大分子的制備通常可按以下步驟進(jìn)展： 確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進(jìn)展科研、開(kāi)發(fā)還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)。 建立相應(yīng)的可靠的分析測(cè)定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵。 經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)。 生物資料的破碎和預(yù)處置。 分別純化方案的選擇和探求，這是最困難的過(guò)程。 生物大分子制備物的均一性即純度的鑒定，要求到達(dá)一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或HPLC和毛細(xì)管電泳

3、都是一個(gè)峰。 產(chǎn)物的濃縮，枯燥和保管。 . 分析測(cè)定的方法主要有兩類：即生物學(xué)和物理、化學(xué)的測(cè)定方法。生物學(xué)的測(cè)定法主要有：酶的各種測(cè)活方法、蛋白質(zhì)含量的各種測(cè)定法、免疫化學(xué)方法、放射性同位素示蹤法等；物理、化學(xué)方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法紫外可見(jiàn)、紅外和熒光等分光光度法、電泳法、以及核磁共振等。實(shí)踐操作中盡能夠多用儀器分析方法，以使分析測(cè)定更加快速、簡(jiǎn)便。. 要了解的生物大分子的物理、化學(xué)性質(zhì)主要有： 在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性。 在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。 固態(tài)時(shí)對(duì)溫度、含水量和凍干時(shí)的穩(wěn)定性。 各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的才干、帶電的

4、情況、在電場(chǎng)中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹(shù)脂等填料中的分配系數(shù)。 其他化學(xué)性質(zhì)：如對(duì)各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對(duì)各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。 對(duì)其他生物分子的特殊親和力。. 制備生物大分子的分別純化方法多種多樣，主要是利用它們之間特異性的差別，如分子的大小、外形、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。 各種方法的根本原理可以歸納為兩個(gè)方面： 利用混合物中幾個(gè)組分分配系數(shù)的差別，把它們分配到兩個(gè)或幾個(gè)相中，如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、層析和結(jié)晶等； 將混合物置于某一物相大多數(shù)是液相中，經(jīng)過(guò)物理力場(chǎng)的作用，使各組分分配于不同的區(qū)域，從而到達(dá)分別的目的，如電泳、離心、超濾等。 目

5、前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的關(guān)鍵技術(shù)是電泳、層析和高速與超速離心。 .2.2 生物大分子制備的前處置2.2.1 生物資料的選擇 制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳镔Y料。資料的來(lái)源無(wú)非是動(dòng)物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。 選擇的資料應(yīng)含量高、來(lái)源豐富、制備工藝簡(jiǎn)單、本錢(qián)低，盡能夠堅(jiān)持新穎，盡快加工處置。 動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛?，假設(shè)所要求的成分在細(xì)胞內(nèi)，那么要先破碎細(xì)胞。 植物要先去殼、除脂。 微生物資料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開(kāi)。 生物資料如暫不提取，應(yīng)冰凍保管。動(dòng)物資料那么需深度冷凍保管。 .2.2.2 細(xì)胞的破碎 不同的生物體或同終身物體的不同部位

6、的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，運(yùn)用的方法也不一樣，如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較鞏固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專門(mén)的細(xì)胞破碎方法。(1)機(jī)械法：1) 研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，參與少量石英砂研磨或勻漿。2) 組織搗碎器：這是一種較猛烈的破碎細(xì)胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C(jī)將組織打碎，然后再用10000r/min20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)(即高速分散器)將組織的細(xì)胞打碎。. (2)物理法：1) 反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至15到20，然后放于室溫(或40)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)構(gòu)成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高

7、而引起細(xì)胞溶脹破碎。2) 超聲波處置法：此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長(zhǎng)一些。3) 壓榨法：這是一種溫暖的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高壓下使細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)一個(gè)小孔忽然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。4) 冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。在90左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立刻放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。. (3)化學(xué)與生物化學(xué)方法：1) 自溶法：將新穎的生物資料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢?xì)胞構(gòu)造在本身所具有的各種水解酶如蛋白酶和酯酶等的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。

8、2) 溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在浸透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37，pH8，處置15分鐘，可以專注性地將細(xì)胞壁分解。 4) 有機(jī)溶劑處置法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS十二烷基硫酸鈉等外表活性劑處置細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法結(jié)合運(yùn)用。 .2.2.3 生物大分子的提取 “提取是在分別純化之前將經(jīng)過(guò)預(yù)處置或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使被分別的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡能夠堅(jiān)持原來(lái)的天然形狀不喪失生物活性的過(guò)程

9、。 影響提取的要素主要有： 目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大??； 由固相分散到液相的難易； 溶劑的pH值和提取時(shí)間等。通常： 極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑； 堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑； 溫度升高，溶解度加大； 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度添加。提取時(shí)所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的添加和堅(jiān)持其生物活性。. 水溶液提取： 蛋白質(zhì)和酶的提取普通以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應(yīng)留意的幾個(gè)主要影響要素是： 1) 鹽濃度即離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度對(duì)生物大分子的溶解度有極大的影響，有些

10、物質(zhì)，如DNA-蛋白復(fù)合物，在高離子強(qiáng)度下溶解度添加。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中參與少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時(shí)大大添加，稱為“鹽溶景象。鹽溶景象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動(dòng)，減少了偶極分子之間極性基團(tuán)的靜電吸引力，添加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。為了提高提取效率，有時(shí)需求降低或提高溶劑的極性。向水溶液中參與蔗糖或甘油可使其極性降低，添加離子強(qiáng)度如參與KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4可以添加溶液的極性。 . 2) pH值：蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān)。過(guò)酸、過(guò)堿均應(yīng)盡量防止，普通控制在pH=68范圍內(nèi)，提取

11、溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)。 3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時(shí)普通在05的低溫操作。 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：參與抑制劑或調(diào)理提取液的pH、離子強(qiáng)度或極性等方法使相應(yīng)的水解酶失去活性，防止它們對(duì)欲提純的蛋白質(zhì)、酶及核酸的降解作用。 . 5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，普通采用溫暖攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會(huì)引起酶等物質(zhì)的變性失活。由于普通蛋白質(zhì)都含有相當(dāng)數(shù)量的巰基，有些巰基經(jīng)常是活性部位的必需基團(tuán)，假設(shè)提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過(guò)多都會(huì)使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的

12、二硫鍵，導(dǎo)致酶活性的喪失。在提取液中參與少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。. 有機(jī)溶劑提取 一些和脂類結(jié)合比較結(jié)實(shí)或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機(jī)溶劑提取。 常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親脂性。 有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機(jī)溶液提取經(jīng)?？梢苑乐顾饷傅钠茐?，并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。 例如，胰島素見(jiàn)講義p36。 .2.3 生物大分子的分別純化 由于生物體的組成成分是如此復(fù)雜，數(shù)千種乃至上萬(wàn)種生物

13、分子又處于同一體系中，因此不能夠有一個(gè)適宜于各類分子的固定的分別程序，但多數(shù)分別任務(wù)關(guān)鍵部分的根本手段是一樣的。 為了防止盲目性，節(jié)省實(shí)驗(yàn)探求時(shí)間，要仔細(xì)參考和自創(chuàng)前人的閱歷，少走彎路。常用的分別純化方法和技術(shù)有： 沉淀法包括：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀等、離心、吸附層析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等。本章以引見(jiàn)沉淀法為主。.2.3.1 沉淀法 沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過(guò)程。沉淀法即溶解度法操作簡(jiǎn)便，本錢(qián)低廉，不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，也用于某些消費(fèi)目的的制備過(guò)程，是分別純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。經(jīng)過(guò)沉淀，將

14、目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分別。 其根本原理是根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而到達(dá)分別的目的，不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的差別而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及構(gòu)造有關(guān)，溶劑組分的改動(dòng)或參與某些沉淀劑以及改動(dòng)溶液的pH值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改動(dòng)。 .在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是： 中性鹽沉淀鹽析法：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分別純化。 有機(jī)溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分別純化。 選擇性沉淀熱變性沉淀和酸堿變性沉淀：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的

15、雜蛋白。 等電點(diǎn)沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)運(yùn)用較少，多與其他方法結(jié)合運(yùn)用。 有機(jī)聚合物沉淀： 是開(kāi)展較快的一種新方法， 主要運(yùn)用PEG聚乙二醇Polyethyene glycol作為沉淀劑。.2.3.1.1 中性鹽沉淀鹽析法 在溶液中參與中性鹽使生物大分子沉淀析出的過(guò)程稱為“鹽析。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進(jìn)展沉淀分別。 鹽析法運(yùn)用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點(diǎn)是： 本錢(qián)低，不需求特別昂貴的設(shè)備。 操作簡(jiǎn)單、平安。 對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。. 中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的根本原理 蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，由于該分子的

16、COOH、NH2和OH都是親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與極性水分子相互作用構(gòu)成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍構(gòu)成1nm100nm顆粒的親水膠體，減弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子外表極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因此溶解度也越大。親水膠體在水中的穩(wěn)定要素有兩個(gè)：即電荷和水膜。由于中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以參與大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴顯露疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即構(gòu)成沉淀。鹽析表示圖如下頁(yè)“圖 4所示。. 中性鹽的選擇 常用的中性鹽中最重要的是NH42SO4，由于它與其他常用鹽類相比有非常突出的優(yōu)點(diǎn)：

17、 1) 溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因此鹽析操作也要求在低溫下04進(jìn)展。由下表可以看到， 硫銨在0時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類： 表2-1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度克/100毫升水 0 20 80 100 NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 . 2) 分別效果好：有的提取液參與適量硫酸銨 鹽析，一步就可以除去75的雜蛋白，純 度提高了四倍。 3) 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)構(gòu)造的 作用。有的

18、酶或蛋白質(zhì)用23mol/L濃度的 NH42SO4保管可達(dá)數(shù)年之久。 4) 價(jià)錢(qián)廉價(jià)，廢液不污染環(huán)境。. 鹽析的操作方法 最常用的是固體硫酸銨參與法。將其研成細(xì)粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地參與，接近方案飽和度時(shí)，加鹽的速度更要慢一些，盡量防止部分硫酸銨濃度過(guò)大而呵斥不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再離心與過(guò)濾。 在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分別，高濃度硫酸銨常用過(guò)濾方法。 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出。. 鹽析曲線的制造 假設(shè)要分別一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒(méi)有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以自創(chuàng)，那么應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。詳細(xì)操作方法如下(講義p39)： 蛋

19、白質(zhì)量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽 和度 . 鹽析的影響要素1) 蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，假設(shè)蛋白質(zhì)濃度過(guò)高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.53.0，相當(dāng)于25 mg/mL30mg/mL。2) pH值對(duì)鹽析的影響：在等電點(diǎn)處溶解度小，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。3) 溫度的影響：對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨濃度升高而添加的。普通

20、情況下，可在室溫下進(jìn)展。但對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在04下操作，以防止活力喪失。 .2.3.1.2 有機(jī)溶劑沉淀法 根本原理 有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)酶、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早運(yùn)用的沉淀方法之一。其原理主要是： 降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中參與有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而減弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。 由于運(yùn)用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因此發(fā)生沉淀作用。 .有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是： 分辨才干比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)

21、只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。 沉淀不用脫鹽，過(guò)濾比較容易如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑。因此在生化制備中有廣泛的運(yùn)用。其缺陷是對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)展。 有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算 用于生化制備的有機(jī)溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 為了獲得沉淀而不著重于進(jìn)展分別，可用溶液體積的倍數(shù)：如參與一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機(jī)溶劑，來(lái)進(jìn)展有機(jī)溶劑沉淀。. 有機(jī)溶劑沉淀的影響要素 1) 溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反響，因此必

22、需預(yù)冷，操作要在冰鹽浴中進(jìn)展，參與有機(jī)溶劑時(shí)必需緩慢且不斷攪拌以免部分過(guò)濃。 普通規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要運(yùn)用比例更大的有機(jī)溶劑進(jìn)展沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)省有機(jī)溶劑，減少變性的危險(xiǎn)，但雜蛋白的共沉淀作用大。 通常運(yùn)用5mg/mL20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜。 . 3) pH值：選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，通常是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨才干。 4) 離子強(qiáng)度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超越5為宜，運(yùn)用乙醇的量也以不超越原蛋白質(zhì)水溶液的倍體積為宜，少量的中性鹽對(duì)蛋白量變性有良好的維護(hù)作用，但鹽濃度過(guò)高會(huì)添

23、加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。 沉淀所得的固體樣品，假設(shè)不是立刻溶解進(jìn)展下一步的分別，那么應(yīng)盡能夠抽干沉淀，減少其中有機(jī)溶劑的含量，如假設(shè)必要可以裝透析袋透析脫有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性。.2.3.1.3 選擇性變性沉淀法 這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差別，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分別提純。 熱變性 利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉淀而保管目的物在溶液中。 外表活性劑和有機(jī)溶劑變性使那些對(duì)外表活性劑和有機(jī)溶劑敏感性強(qiáng)的雜蛋白變性沉淀。通常在冰浴或冷室中

24、進(jìn)展。 選擇性酸堿變性 利用對(duì)pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。通常是在分別純化流程中附帶進(jìn)展的分別純化步驟。.2.3.1.4 等電點(diǎn)沉淀法 利器具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在到達(dá)電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分別的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)展初步的沉淀分別。 由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)非常接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)運(yùn)用此法分辨率較低，因此此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一同配合運(yùn)用，以提高沉淀才干和分別效果。 此法主要用于在分別純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。.2.3.1

25、.5 有機(jī)聚合物沉淀法 有機(jī)聚合物是六十年代開(kāi)展起來(lái)的一類重要的沉淀劑，最早運(yùn)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來(lái)廣泛用于核酸和酶的純化。其中運(yùn)用最多的是 “聚乙二醇【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)】( Polyethylene Glycol 簡(jiǎn)寫(xiě)為 PEG )，它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為600020000的 PEG。 本方法的優(yōu)點(diǎn)是：操作條件溫暖，不易引起生物大分子變性。沉淀效能高，運(yùn)用很少量的P“EG即可以沉淀相當(dāng)多 的生物大分子。沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。.2.3.2 透析 自T

26、homas Graham 1861年發(fā)明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室最簡(jiǎn)便最常用的分別純化技術(shù)之一。在生物大分子的制備過(guò)程中，除鹽、除少量有機(jī)溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術(shù)。 透析只需求運(yùn)用公用的半透膜即可完成。保管在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保管液，袋膜外的溶液稱為“滲出液或“透析液。截留分子量MwCO通常為1萬(wàn)左右。 用1 BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1 AgNO3 檢查NaCl、KCl等。.2.3.3 超濾 超越濾即超濾，自20年代問(wèn)世后，直至60年代以來(lái)開(kāi)展迅速，很快由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的分別手段開(kāi)展成重要的工業(yè)單元操作技術(shù)。超濾現(xiàn)已

27、成為一種重要的生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子如蛋白質(zhì)、酶、核酸等的濃縮、分別和純化。超濾是一種加壓膜分別技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過(guò)，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。. 超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過(guò)濾、超濾和反浸透三種。 微孔過(guò)濾所用的操作壓通常小于4104Pa，膜的平均孔徑為500埃14微米1微米104埃，用于分別較大的微粒、細(xì)菌和污染物等。 超濾所用操作壓為4104Pa7105Pa，膜的平均孔徑為10100埃，用于分別大分子溶質(zhì)。 反浸透所用的操作壓比超濾

28、更大，常到達(dá)35105Pa140105Pa，膜的平均孔徑最小，普通為10埃以下，用于分別小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。. 超濾技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，本錢(qián)低廉，不需添加任何化學(xué)試劑，尤其是超濾技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件溫暖，與蒸發(fā)、冰凍枯燥相比沒(méi)有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因此可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。 在生物大分子的制備技術(shù)中，超濾主要用于生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。 超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制劑。對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，普通只能得到1050的濃度。. 超濾技術(shù)的關(guān)鍵是膜。 常用的膜是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物制成。近年來(lái)開(kāi)展了非纖維型的各向異性膜，例

29、如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH 114都是穩(wěn)定的，且能在90下正常任務(wù)。超濾膜通常是比較穩(wěn)定的，能延續(xù)用12年。 超濾膜的根本性能目的：水通量cm3/(cm2h)；截留率以百分率表示；化學(xué)物理穩(wěn)定性包括機(jī)械強(qiáng)度等。 超濾安裝由假設(shè)干超濾組件構(gòu)成。分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型。 由于超濾法處置的液體多數(shù)是含有水溶性生物大分子、有機(jī)膠體、多糖及微生物等。這些物質(zhì)極易粘附和堆積于膜外表上，呵斥嚴(yán)重的濃差極化和堵塞，這是超濾法最關(guān)鍵的問(wèn)題，要抑制濃差極化，通?？杉哟笠后w流量，加強(qiáng)湍流和加強(qiáng)攪拌。.2.3.4 冰凍枯燥 冰凍枯燥機(jī)是生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的儀器

30、之一，由于大多數(shù)生物大分子分別純化后的最終產(chǎn)品多數(shù)是水溶液，要從水溶液中得到固體產(chǎn)品，最好的方法就是冰凍枯燥，由于生物大分子容易失活，通常不能運(yùn)用加熱蒸發(fā)濃縮的方法。 冰凍枯燥是先將生物大分子的水溶液冰凍，然后在低溫暖高真空下使冰升華，留下固體干粉。冰凍枯燥的原理可用溶劑的三相點(diǎn)相圖來(lái)闡明，見(jiàn)圖 6 ：. 當(dāng)溫度在三相點(diǎn)O以下，將壓力降至OC線以下，溶劑通常是水就可以由固相直接升華為汽相。冰：40 上方蒸汽壓為0.1mmHg， 60 上方的蒸汽壓為0.01mmHg。 1克0的冰變成0的蒸汽需吸熱580千卡，容器外壁上會(huì)掛霜。突出的優(yōu)點(diǎn)：樣品不起泡，不暴沸。得到的干粉樣品不粘壁，易取出。冰干后的

31、樣品是疏松的粉末，易溶于水。. 樣品溶液： 樣品要溶于水，不含有機(jī)溶劑，否那么冰點(diǎn)降低，樣品易融化，起大量泡沫，使樣品變性，污染真空泵油。 樣品要予先脫鹽，否那么冰凍后易融化。 樣品緩沖液在冰凍時(shí)pH能夠會(huì)有較大變化需參與pH穩(wěn)定劑，如糖類和鈣離子等。 樣品溶液的濃度不要過(guò)稀，例如蛋白質(zhì)的濃度不低于15 mg/mL 為宜。 . 裝樣品溶液的容器： 用各種尺寸的培育皿盛樣品溶液，液層不要太厚，可以運(yùn)用安瓿并和青霉素小并。用燒杯時(shí)液層厚度不要超越2 cm。 凍干稀溶液時(shí)會(huì)得到很輕的絨毛狀固體樣品，容易飛散而損失和呵斥污染，因此要用刺了孔的薄膜或吸水紙包住杯口，刺的孔不要過(guò)小過(guò)少，否那么會(huì)影響凍干速

32、度。 溶液冰凍： 可用干冰乙醇低溫浴速凍，邊凍邊旋轉(zhuǎn)構(gòu)成很薄的冰凍層，可以大大加快凍干的速度。. 凍干： 樣品全部?jī)龈汕?，不要隨便搖動(dòng)，以防水蒸汽沖散凍干的樣品粉末。 假設(shè)外霜消逝，那么闡明樣品已凍干，或是僅剩樣品中心的小冰塊，再稍加延伸凍干時(shí)間即可。 凍干后要及時(shí)取出樣品，以免樣品在室溫下仃留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而失活。 仃真空泵時(shí)要先放氣，以免泵油倒灌。放氣時(shí)要緩慢，以免氣流沖散樣品干粉。 樣品凍干后要及時(shí)密封冷藏，以防受潮。 真空泵要經(jīng)常檢查油面和油色，油面過(guò)低和油色發(fā)黑，那么需換油。.2.3.5 樣品的保管 生物大分子制廢品的正確保管極為重要，一旦保管不當(dāng)，辛辛勞苦制成的樣品失活、變性、蛻變，使前

33、面的全部制備任務(wù)化為烏有，損失繁重，全功盡棄。 影響生物大分子樣品保管的主要要素有： 空氣：空氣空氣的影響主要是潮解、微生物污染和自動(dòng)氧化。 溫度：每種生物大分子都有其穩(wěn)定的溫度范圍，溫度升高10，氧化反響約加快數(shù)倍，酶促反響添加13倍。 . 水份：樣品本身所帶的水份和由空氣中吸收的水份。水可以參與水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、離解和霉變。 光線：某些生物大分子可以吸收一定波長(zhǎng)的光，使分子活化不利于樣品保管，尤其日光中的紫外線能量大，影響最大，樣品受光催化的反響有變色、氧化和分解等，通稱光化作用。因此樣品通常都要避光保管。 樣品的pH：保管液態(tài)樣品時(shí)留意其穩(wěn)定的pH范圍，正確選擇保管液態(tài)樣品的緩沖劑的種類和濃度非常重要。 時(shí)間：生化和分子生物學(xué)樣品不能夠永久存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保管的樣品必需寫(xiě)明日期，定期檢查和處置。.現(xiàn)以保管蛋白質(zhì)和酶為例： 低溫下保管：通常要保管于520，70保管最理想。極少數(shù)酶可以耐熱：如核糖核酸酶可以短時(shí)煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中可以耐受90