兒童呼吸道常見的細菌培養(yǎng)鑒定技術應用

1、兒童呼吸道常見的細菌培養(yǎng)鑒定技術應用病原菌確定原則自從發(fā)現(xiàn)細菌以來，已經(jīng)確定上百種疾病的病原菌，對這些常見的傳染病，通常只要檢出已經(jīng)確定的病原菌，就可以認定這種疾病的原因。新出現(xiàn)的傳染病，需要用確定病原菌的古老標準來確定。對病人組織、器官中分離到的一種微生物，不足以說明就是疾病的原因。對于細菌性疾病，需要滿足郭霍原則（Koch）。郭霍原則的四個條件從一種疾病病人中能有規(guī)律地發(fā)現(xiàn)一種細菌；能夠分離這種細菌獲得純培養(yǎng)；把這種細菌的培養(yǎng)物引入易感動物體內(nèi)，可以引起與病人類似的疾?。辉趯嶒灨腥疽鸬募膊≈?，仍然能夠分了同一種細菌。只有能夠滿足所有四個條件，才能確定該種細菌室相應疾病的病原。提 綱（一）

2、呼吸道標本的采集。 痰標本是反映下呼吸道感染最直接的標志物，痰標本采集過程污染機會多，痰標本采集方便、無痛苦。（二）合格的痰標本。（三）呼吸道（痰）標本細菌培養(yǎng)存在的問題。（四）呼吸道（痰）標本接種處理。（五）呼吸道（痰）標本細菌報告。（六）肺炎鏈球菌的分離培養(yǎng)技術。（七）流感嗜血桿菌的分離培養(yǎng)技術。（一）痰標本采集方法：1)自然咳痰：要求患者留痰前用清水漱口3次, 用力咳出。首先用滅菌生理鹽水將痰液洗3次，然后將痰塊打碎，制成懸液后再接種。2) 采用吸痰器吸痰：吸痰前可以超聲霧化、輕拍背部促進患兒排痰。用于新生兒（一）痰標本采集方法：3) 纖維支氣管鏡抽取法：適用于纖維支氣管鏡檢查或治療的患

3、者。在肺內(nèi)病灶附近直接取得的標本無疑是比較理想的標本，但對患者有一定的痛苦。4）壓舌取痰法：對于多數(shù)小兒可采用此方法。以壓舌板向后壓舌，用棉拭子伸入咽部，經(jīng)壓舌刺激咳痰時，噴出的肺部或氣管分泌物會黏附在拭子上。（二）合格的痰標本。痰標本留取后應先涂片, 進行革蘭染色鏡檢合格后再接種。鏡檢不合格標本, 應通知臨床重新留取標本。痰標本合格的標準： 痰標本 鱗狀上皮細 白血球 細菌種類 合格 =10 1-3種 不合格 =25/低倍 3種（三）痰標本細菌培養(yǎng)存在的問題。痰標本不合格：痰標本已被唾液、食物、口腔細菌污染。標本接種不及時：新入院病人用藥前采集標本后未及時送檢，到下午采集中送檢。呼吸道常見細

4、菌如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌等苛養(yǎng)菌是很嬌的細菌，如不及時送檢這些細菌均會死亡，尤其腦膜炎奈瑟菌需保溫送檢。標本應在采集后1小時內(nèi)接種培養(yǎng)。（三）痰標本細菌培養(yǎng)存在的問題。培養(yǎng)基不合格： 肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌可以在綿羊血平板上生長，綿羊血不含X因子，所以流感嗜血桿菌、奈瑟菌在綿羊血巧克力平板上生長差或不生長，要加入一種含X因子的添加劑才能生長良好，而馬血、兔血同時含有V和X因子，所以采用馬血或兔血制的巧克力平板，流感嗜血桿菌、奈瑟菌生長良好。痰標本的培養(yǎng)時間： 呼吸道(痰)標本培養(yǎng)應該為2472小時。24小時培養(yǎng)后細菌生長稀少或未生長的平板應繼續(xù)培養(yǎng)到72小時后再作報告，防止

5、一些生長緩慢的細菌會遺漏，如卡他莫拉菌、奴卡菌、嗜血桿菌等。（三）痰標本細菌培養(yǎng)存在的問題。（四）呼吸道（痰）標本的接種處理涂片革蘭氏染色，觀察痰標本是否合格。血瓊脂：哥倫比亞瓊脂或胰大豆胨瓊脂、5綿羊血、或加適量抑制劑如慶大霉素有利于肺炎鏈球菌生長。巧克力瓊脂：哥倫比亞瓊脂+5馬血或兔血+3mg/100mL去甲萬古霉素或桿菌肽，有利于嗜血桿菌的分離培養(yǎng)。(五)痰標本致病菌的選擇和報告占一定優(yōu)勢并已明確的致病菌：金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、-溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、隱球菌等。對溶血葡萄球菌、其他嗜血桿菌如占70%或以上量時，也應報告給臨床醫(yī)生參考。優(yōu)勢菌：陰性桿菌占50%量或以

6、上時，應報告。(五)痰標本致病菌的選擇和報告草綠色鏈球菌、奈瑟菌、類白喉、凝固酶陰性葡萄球菌、副流感嗜血桿菌等無充分理由，不應作為致病菌報告。除呼吸道正常菌群外多于3種或以上細菌時，要考慮痰標本的口腔污染?？ㄋR別：* 可在血瓊脂或巧克力上生長* 灰略黃、干燥但可在鹽水中乳化，可用接種環(huán)推動整個菌落。（六）肺炎鏈球菌培養(yǎng)技術前 言肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoconia，SP)是兒童和成人肺炎的重要病原菌之一，存在于正常人口腔、鼻咽部，在機體抵抗力下降時致病。在兒童中可引起肺炎、中耳炎、乳突炎、鼻竇炎、細菌性腦膜炎、敗血癥等疾病，尤其對嬰幼兒構成嚴重威脅。國外概況在

7、美國，每年侵襲性SP感染的發(fā)生率為72-103/10萬兒童，而歐洲為10-24/10萬兒童/年。每年約有600多萬例中耳炎由SP引起，占急性中耳炎30-50；在發(fā)展中國家，每年約有500萬5歲以下兒童死于SP引起的肺炎，10-50萬兒童死于SP引起的腦膜炎。國內(nèi)概況：國內(nèi)最早兒童肺炎鏈球菌腦膜炎個案報告在1942年。60年代中期以前研究資料顯示SP肺炎、腦膜炎在冬春季發(fā)病較多，是兒科住院病人中常見病例多發(fā)生在嬰幼兒。SP性腦膜炎占化腦的，僅次于流腦。SP也是小兒肺炎的重要病原菌之一，SP所致大葉性肺炎，5歲以下兒童中可占70。國內(nèi)概況：80年代后的研究資料顯示SP腦膜炎占同期化腦的。SP引起的

8、敗血癥還是少見，約占5左右。一項13歲以下兒童中耳炎病原學研究顯示SP引起的感染占病例，是最常見的病原菌。本院情況我院2006年參與惠氏中國住院兒童肺炎流行病學調(diào)查研究，從入選的1097例肺炎住院兒童的痰標本中檢出肺炎鏈球菌79例，檢出率為7.2%。近三年，我院肺炎鏈球菌檢出458多株，其中呼吸道331株，耳分泌物85株，血液檢出18株，腦脊液檢出11株，胸積液5株，其他部位（外陰部、皮膚創(chuàng)傷濃液等）檢出8株。肺炎鏈球菌的致病力SP的莢膜在細菌的侵襲力上起主要作用，有莢膜的SP有毒力，失去莢膜則獨力減低或喪失。還可產(chǎn)生溶血素、紫斑產(chǎn)生因子、殺細胞素、皮膚致死毒素等。根據(jù)SP莢膜多糖抗原的不同可

9、分為90個血清型，與疾病相關的血清型分布隨時間、地點、年齡不同而變化。標本來源 根據(jù)不同病因可采集痰、肺泡灌洗液、膿液、耳分泌物、外陰分泌物、胸腔積液、腦脊液和血液等標本。痰應采用深部咳出的，選擇鐵銹色部分或膿性分泌物。培養(yǎng)基血瓊脂平板：胰大豆蛋白胨瓊脂或哥倫比亞瓊脂加5%綿羊血；加慶大霉素的血瓊脂平板：在普通血瓊脂中加入抑制劑慶大霉素注射液，混勻傾倒平板，瓊脂中慶大霉素最后濃度相當于1.25 mg/250mL。標本接種及培養(yǎng)條件用鼻咽拭子采取患兒鼻咽分泌物、痰、咽拭子、肺泡灌洗液等呼吸道標本接種慶大霉素血平板或普通血平板，置于35，5CO2溫箱培養(yǎng)18-24小時。初次分離培養(yǎng)在510%的CO

10、2條件下生長良好。血液、腦脊液標本用血培養(yǎng)基增菌后轉(zhuǎn)種慶大霉素血平板或普通血平板置于355CO2溫箱培養(yǎng)18-24小時。菌落特點：在血瓊脂平板形成細小、圓形、中央臍窩狀、表面光滑、草綠色、扁平周圍有草綠色溶血環(huán)的直徑的菌落。典型的SP菌落圓形、呈臍窩狀、較濕潤、邊緣整齊。不典型的SP菌落有水滴樣，菌落較大，邊緣不整齊；還有細小、似草綠色鏈球菌但較濕潤的菌落也需注意。細菌染色形態(tài)革蘭氏染色陽性，呈矛頭狀，成雙或鏈狀排列，有莢膜；在痰標本中大多數(shù)成雙排列。鑒定要點：Optochin敏感，膽汁溶菌和莢膜腫脹試驗陽性，菊糖分解試驗陽性，小鼠毒力試驗陽性。Optochin（乙基羥化奎寧）試驗： 將被檢菌

11、的肉湯培養(yǎng)液均勻涂布于血瓊脂平板，貼Optochin紙片經(jīng)35培養(yǎng)1824小時，抑菌環(huán)直徑14mm為敏感。 注意：近年有報道OP耐藥的肺炎鏈球菌。 2009年的全國質(zhì)控有一株菌就是OP耐藥的肺炎鏈球菌。膽汁溶菌試驗：平板法：取10去氧膽酸鈉1接種環(huán)，加于血瓊脂平板的被檢菌上，35孵育30分鐘，菌落溶解消失為陽性；試管法：在隔夜培養(yǎng)液中加入去氧膽酸鈉溶液，37水浴1030分鐘，培養(yǎng)液由濁變清為陽性。用生理鹽水代替去氧膽酸鈉溶液作陰性對照。肺炎鏈球菌藥敏試驗方法阿莫西林、青霉素、頭孢曲松、頭抱呋辛、頭孢克洛、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南是用于治療肺炎鏈球菌感染的常用藥物，根據(jù)CLSI文件

12、，肺炎鏈球菌藥敏必須采用MIC法。目前我們采用的MIC法有E-Test法和儀器法。肺炎鏈球菌藥敏試驗方法：E-Test法：培養(yǎng)基采用M-H瓊脂+5脫纖維綿羊血， E-Test試驗條采用瑞典AB-Biodisk公司產(chǎn)品，菌液調(diào)麥氏單位，涂布平板，9cm平板貼兩條紙片，相反方向貼，12cm平板可以貼5條紙片，低濃度相向貼， 355CO2溫箱培養(yǎng)20-24小時看結果，操作及結果判斷參照產(chǎn)品說明書。儀器法：梅里埃公司的VITEK-2-COMPACT，GP-68卡片是肺炎鏈球菌專用卡片。肺炎鏈球菌的耐藥機制SP不產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，對青霉素和頭孢菌素耐藥性非質(zhì)粒介導，而是通過一系列PBP靶位自身改變，與抗生

13、素的親和力下降所致，即-內(nèi)酰胺類抗生素通過-內(nèi)酰胺環(huán)與PBPs的絲氨酸活化位點共價結合使之失去活性，從而阻斷細菌細胞壁合成，發(fā)揮殺菌作用，產(chǎn)生耐藥的主要機制。肺炎鏈球菌的耐藥機制SP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥主要是由于核糖體靶位的改變、主動外排機制增強及產(chǎn)生修飾酶滅活藥物。本地耐藥情況和趨勢： 20062009年資料顯示：廣州地區(qū)兒童PRSP低于匈牙利、韓國、臺灣，與香港接近，高于上海、北京，廣州地區(qū)兒童鼻咽部肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥性不高，主要表現(xiàn)為中介，CLSI修改前2006年的PRSP水平為11.2%，中介為77.2%，2008年修改后PRSP 水平更低。本地耐藥情況和趨勢： SP對大環(huán)內(nèi)

14、脂類抗生素的耐藥情況較為嚴重，其中紅霉素的耐藥率達80.5%， 且多數(shù)為高水平耐藥， 其中59%的菌株MIC為256g/ml，其耐藥情況與杭州地區(qū)的紅霉素的耐藥率90.1%、74%的菌株MIC為256g/ml比杭州地區(qū)要低，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的廣泛使用可能是造成其耐藥率增加的重要原因。本地耐藥情況和趨勢： 20062009年資料耐藥性顯示，SP對三代頭孢類抗生素和青霉素加酶抑制劑藥物的耐藥性較低，阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松分別為0和3.8%，一代頭孢菌素頭孢呋辛的耐藥率為72.2%。本地耐藥情況和趨勢： SP對紅霉素、四環(huán)素、復方新諾明、克林霉和氯霉素的多重耐藥情況較為嚴重，多重耐藥發(fā)生率為7

15、5%，高于北京、上海、杭州地區(qū)。本地耐藥情況和趨勢： 結 論： 廣州地區(qū)臨床治療兒童SP感染應首選青霉素加霉抑制劑的復合藥物或三代頭孢菌素。SP血清學分型：肺炎鏈球菌的血清分型可以為肺炎鏈球菌疫苗研究提供可靠依據(jù)，也是一種流行病學調(diào)查手段。肺炎鏈球菌的抗原成分較多，有菌體核蛋白、菌體種屬特異性抗原、莢膜多糖抗原等。SP血清學分型莢膜多糖抗原：亦稱型特異性抗原，存在于肺炎鏈球菌的莢膜中，由大量多聚體組成，能溶于水，有型特異性，故稱之為可溶性特異性物質(zhì)（SSS）。不同菌株所含莢膜多糖不同，故可用凝集、沉淀和莢膜腫脹試驗，進行肺炎鏈球菌分型。目前至少可將有莢膜的肺炎鏈球菌分成83個血清型。SP血清學

16、分型：莢膜腫脹試驗乳膠凝集試驗兩種試劑均購自丹麥我們實驗室采用莢膜腫脹試驗SP血清學分型步驟：1 細菌復蘇：將肺炎鏈球菌凍沉管從-70冰箱取出，挑取3-5l菌液接種于普通羊血培養(yǎng)基，35、5%CO2培養(yǎng)18-24小時，挑取單個菌落做次代培養(yǎng)。2 配制PBS溶液，并分裝小試管，每管約，用亞甲藍粉配制的亞甲藍試劑。SP血清學分型步驟：3 用接種環(huán)挑取經(jīng)次代培養(yǎng)后的肺炎鏈球菌菌落，放入小試管中，制成菌懸液約麥氏單位濃度。4 用接種環(huán)挑取約10l菌懸液放入載玻片上，再挑取同量的診斷血清（10l）放入載玻片上，并與菌懸液攪拌混勻。SP血清學分型步驟：5 再加入一環(huán)的亞甲藍試劑放入載玻片上與抗血清混勻一分

17、鐘，或蓋上蓋玻片，在顯微鏡下是否有莢膜或凝集出現(xiàn)。6 出現(xiàn)凝集或莢膜腫脹的抗血清型即為該肺炎鏈球菌的血清型。常見的血清型：常引起人類疾病的血清型20多種，最常見的血清型有：6B、9V、14、19A、19F、23F。國內(nèi)兒童流行的主要是：6A、6B、23F、19F、14、4、不定型。肺炎鏈球菌血清型流行趨勢肺炎鏈球菌的血清型分布隨國家和年齡組的變化不大，歐洲國家和美國有著相似的血清型分布，美國的常見血清型依次為6B、19F、23F、14、18C，荷蘭常見的血清型分布依次為19F 、6B、6A、9V、23F。亞洲的情況略有不同，韓國以15、14、6B、19F較普遍，而印度以6、14、19、15型較

18、多見。國內(nèi)兒童的血清型流行情況：地區(qū)標本 對象常見血清型北京痰、肺泡灌洗液、胸積液5歲以下肺炎住院兒童6A、23F、6B、19F、14、不能分型上海同上同上6A、6B、19F、23F廣州（本院）同上同上6A、23F、19F、15B、4、6B、不能分型深圳同上同上23F、19F、15B、4、19A、15B7價疫苗和13價疫苗比較7價疫苗： 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F。13價疫苗： 以上7價+1, 3, 5, 6A, 7F, 19A。疫苗涵蓋（100）地區(qū)7價疫苗13價疫苗北京3570上海7889廣州9797深圳8793結論廣州地區(qū)肺炎住院兒童感染SP對大環(huán)內(nèi)酯類藥物

19、紅霉素和林可酰胺類藥物克林霉素的耐藥情況嚴重，對阿莫西林、三代頭孢菌素等-內(nèi)酰胺類耐藥性較低，臨床治療兒童SP感染所致肺炎應首選阿莫西林、三代頭孢菌素。結論廣州地區(qū)致兒童肺炎的肺炎鏈球菌90%以上包涵在7加疫苗內(nèi)，要預防肺炎鏈球菌感染所致肺炎，采用7價疫苗可以達到很好的效果。（七）流感嗜血桿菌培養(yǎng)技術前 言 流感嗜血桿菌(aemophilus influenzae, Hi)，俗稱流感桿菌。1892年流感世界大流行時，波蘭細菌學家Pfeiffer首先從流感患者鼻咽部分離出一種革蘭氏陰性小桿菌，當時認為此菌便是流感的病原體，由此而得名。 流感嗜血桿菌的致病性HI主要引起人類急性化膿性感染，是急性咽

20、炎、喉炎、支氣管炎、急性鼻竇炎、中耳炎、生殖道感染及產(chǎn)后菌血癥的主要致病菌之一，尤其是社區(qū)獲得性肺炎的重要病原菌，還可以引起化膿腦膜炎、敗血癥、新生兒膿毒血癥等侵襲性感染，也可繼發(fā)于流感、麻疹、百日咳、肺結核等呼吸道感染。毒力因子：莢膜、菌毛、IgA1蛋白酶、血素（Haemocin）其中PRP莢膜是主要的毒力因子。標本接種處理痰、咽拭子、血（增菌后）、分泌物、腦脊液等標本劃線接種于流感嗜血桿菌選擇性培養(yǎng)基，放入5CO2培養(yǎng)箱3537孵育1824h,菌落細小，可延長培養(yǎng)時間至48小時。培養(yǎng)特性營養(yǎng)要求比較特別，需要、因子存在及510%的CO2氣體，最適生長溫度37。培養(yǎng)基采用哥倫比亞瓊脂加5%馬

21、血或兔血制成巧克力瓊脂，加入去甲萬古霉素注射液或桿菌肽作為抑制劑，終濃度分別為6mg/300mL 、76mg/250mL。采用綿羊血做巧克力時，需加入添加劑（OXOID公司產(chǎn)品，劑量按產(chǎn)品說明書）。 流感嗜血桿菌的純培養(yǎng)形態(tài)未加添加劑的平板上，菌落細小，無色透明，邊緣整齊，露滴狀。加添加劑的平板上菌落較大，灰白色，濕潤，邊緣整齊。HI染色形態(tài)特征流感嗜血桿菌為革蘭氏陰性細小桿菌，從病灶中分離的菌株多呈球桿狀或雙球狀，有時可呈短鏈；在陳舊培養(yǎng)物中成多形態(tài)性，有長桿狀和絲狀；無芽孢、無鞭毛。純培養(yǎng)物鏡下形態(tài)HI鏡下為革蘭氏陰性短小桿菌，多形態(tài)性 鑒定方法X、V因子需求試驗：取無色透明，邊緣整齊，露

22、滴狀菌落在哥倫比亞瓊脂平板上均勻密劃線，在劃線上貼X、V因子紙片，兩紙片間距為2022mm。經(jīng) 5CO2培養(yǎng)箱，3537孵育1824h，在兩紙片中央出現(xiàn)細小菌落生長現(xiàn)象為陽性。衛(wèi)星試驗：取無色透明，邊緣整齊，露滴狀菌落在普通血平板上均勻密劃線陽性，在劃線上點種金黃色葡萄球菌，經(jīng) 5CO2培養(yǎng)箱，3537孵育1824h，在金葡菌落周圍有菌落生長，近端菌落大，遠端菌落越來越小，即為陽性X、V因子需求試驗或衛(wèi)星試驗陽性即可鑒定為Hi。流感嗜血桿菌藥敏試驗：K-B法和Etest法，培養(yǎng)基采用專用流感嗜血桿菌藥敏培養(yǎng)基（Heamophilus test medium base HTM）。HI耐藥機制:H

23、I對氨芐西林的耐藥機制與-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生密切相關， Hi產(chǎn)生的內(nèi)酰胺酶主要是由質(zhì)粒介導的TEM-1型酶,其次為ROB-1型酶。早在1994年Tenover等研究表明對于編碼TEM-1酶的耐藥基因主要位于質(zhì)粒pBR322上或轉(zhuǎn)座子A上,而編碼ROB-1酶的耐藥基因位于的pROB質(zhì)粒上。HI耐藥機制:相關研究顯示頭孢洛克耐藥的產(chǎn)酶菌株中ROB-1占66.7%，TEM-1占33.3%，并且研究中ROB-1對頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢克肟和亞胺培南的敏感性與TEM相似。HI耐藥機制:-內(nèi)酰胺酶陰性的耐藥菌株(Bata-lactamase-negative and ampicillin-resistanc

24、e ,BLNAR)在 1980 年首次被報道 ,其不產(chǎn)酶耐藥機制主要是由于菌株細胞壁上一種或多種青霉素結合蛋白(BPB)發(fā)生改變 ,引起青霉素結合蛋白與靶位親和力的降低 ,其次是由于外膜蛋白改變導致耐藥。國外研究情況:Scriver報道氨芐西林耐藥的HI 93產(chǎn)TEM-1型-內(nèi)酰胺酶，只有7產(chǎn)生 ROB-1型-內(nèi)酰胺酶，沒有一株菌同時產(chǎn)生兩種酶，兩種酶對-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥表型是不同的。Karlowsky等研究發(fā)現(xiàn)對頭孢克洛耐藥的產(chǎn)酶HI 66.7%產(chǎn)生TEM-1型-內(nèi)酰胺酶，產(chǎn)生ROB-1型-內(nèi)酰胺酶。 國外研究情況:Kim IS, Ki CS等研究證實，韓國流行的菌株攜帶TEM-1型-內(nèi)酰胺酶耐藥株的BLNAR株和的-內(nèi)酰胺酶陽性的阿莫西林/克拉維酸耐