南開大學(xué)—細(xì)胞生物學(xué)學(xué)習(xí)資源ppt課件

1、第十三章 細(xì)胞的衰老 與凋亡. 人類自出生總要經(jīng)過生長、發(fā)育、成熟、衰老直至死亡的幾個階段，這是生命的必然規(guī)律。 有機(jī)體是由無數(shù)個細(xì)胞組成，因此，在討論衰老與死亡時離不開細(xì)胞，對多細(xì)胞生物而言，細(xì)胞的衰老死亡和機(jī)體的衰老死亡是兩個概念。細(xì)胞的衰老死亡并不等于機(jī)體的衰老死亡，由于在有機(jī)體發(fā)育的不同階段，機(jī)體內(nèi)總是有細(xì)胞在不斷衰老與死亡。但細(xì)胞的衰老與機(jī)體的衰老卻又是親密相關(guān)的，大多數(shù)機(jī)體細(xì)胞都要經(jīng)未分化、分化到衰老直至死亡的歷程。因此，機(jī)體的衰老是以細(xì)胞總體的衰老為根底的。細(xì)胞是生命活動的根本單位，對細(xì)胞衰老過程的研討必然為老年學(xué)，甚至為腫瘤生物學(xué)的研討提供根據(jù)。.第一節(jié) 細(xì)胞衰老 細(xì)胞衰老ce

2、ll senescence)也稱細(xì)胞老化cell aging ),普通指細(xì)胞在形狀與生化成分上的改動，進(jìn)而發(fā)生生理功能妨礙的景象。這是一個緩慢行進(jìn)，隨細(xì)胞年齡增高而加劇的過程?，F(xiàn)代人類面臨著三種衰老：第一種是生理性衰老，這是一切生物的普遍規(guī)律。第二是病理性衰老，使衰老景象提早發(fā)生，這種衰老又稱為早衰。第三種是心思性衰老，是由于各種緣由，所產(chǎn)生未老先衰的心思形狀而影響機(jī)體的整體功能。 . 對多細(xì)胞生物而言，細(xì)胞的衰老和死亡是兩個不同的概念，機(jī)體的衰老并不等于一切細(xì)胞衰老，但細(xì)胞的衰老是同機(jī)體的衰老嚴(yán)密相關(guān)。正常人的成纖維細(xì)胞，在體外培育條件下，即使條件適宜，其分裂次數(shù)也是有限的，并最終停頓分裂而

3、死亡。. Hayflick界限 1961年Hayflick等報道，體外培育的人成纖維細(xì)胞具有增殖分裂的極限。他利用來自胚胎和成體的成纖維細(xì)胞進(jìn)展體外培育，發(fā)現(xiàn)胚胎的成纖維細(xì)胞分裂傳代50 次后開場衰退和死亡，而來自成年組織的成纖維細(xì)胞只能培育15-30代就開場死亡。.體外培育的年輕和老的人成纖維細(xì)胞的顯微形狀只分裂了幾代的年輕成纖維細(xì)胞，呈現(xiàn)薄層、細(xì)長的形狀分別了50次的老的成纖維細(xì)胞，開場衰退，并很快死亡.細(xì)胞體外衰老實(shí)驗 Hayflick等還發(fā)現(xiàn)，動物體細(xì)胞在體外可傳代的次數(shù)與物種的壽命有關(guān)。例如壽命為3年的小鼠，其培育細(xì)胞在體外的傳代次數(shù)只需12次；而龜?shù)膲勖蛇_(dá)200年，細(xì)胞可以傳14

4、0代。 胎兒肺成纖維細(xì)胞可在體外條件下傳代50次，而成人肺成纖維細(xì)胞只能傳代20次，可見細(xì)胞的增殖才干與供體的年齡有關(guān)。.早老癥(HayflickGuilford綜合癥)及Werner氏綜合癥患者的成纖維細(xì)胞在體外只能傳代24次，其DNA合成亦較少，且細(xì)胞外表不具有正常成纖維細(xì)胞所具有的HLA人白細(xì)胞抗原抗原標(biāo)志。.早老癥兒童與正常兒童的比較左邊是正常安康的9歲兒童，右邊是一個患早老癥的8歲兒童.Hayflick的任務(wù)闡明：細(xì)胞，至少是培育的細(xì)胞，不是不死的，而是有一定壽命的；他們的增殖才干不是無限的，而是有一定的界限，這就是著名的Hayflick界限。細(xì)胞衰老的決議 Hayflick為了確定

5、培育的二倍體細(xì)胞的衰老是細(xì)胞本身決議的還是由于培育環(huán)境的惡化呵斥的。他又設(shè)計了巧妙的實(shí)驗。.將取自老年男性細(xì)胞(無巴氏小體和年輕女性個體細(xì)胞(間期可見巴氏小體)進(jìn)展單獨(dú)或混合培育，結(jié)果混合培育中的兩類細(xì)胞的倍增次數(shù)與各自單獨(dú)培育時一樣。即在同一培育基中，當(dāng)年輕的細(xì)胞旺盛增殖時的同時，年老的細(xì)胞就停頓生長了。結(jié)果闡明:決議細(xì)胞衰老的要素在細(xì)胞內(nèi)部，而不是外部的環(huán)境。.年輕的細(xì)胞質(zhì)與年老的完好細(xì)胞交融時，得到的雜種細(xì)胞不能分裂；而年老的細(xì)胞質(zhì)與年輕的完好細(xì)胞交融時，雜種細(xì)胞的分裂才干與年輕細(xì)胞幾乎一樣。結(jié)果闡明:是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決議了細(xì)胞衰老的表達(dá)。至此，Hayflick界限為寬廣的研討者所接

6、受，以為適用于很多種類型的細(xì)胞，對于這些細(xì)胞來說，衰老是不可防止的，衰老的緣由在于細(xì)胞本身。為了更進(jìn)一步的探求體外培育的二倍體細(xì)胞衰老的控制機(jī)理，他們又作了一個實(shí)驗，就是用細(xì)胞松弛素B處置細(xì)胞，然后離心除去細(xì)胞核，得到胞質(zhì)體，在用胞質(zhì)體與完好細(xì)胞進(jìn)展雜交察看雜種細(xì)胞衰老的表達(dá)。.細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老 在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的景象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生。正常情況下終生堅持分裂的細(xì)胞，其分裂才干能否隨著有機(jī)體年齡的增高而下降？它們會不會衰老？ 經(jīng)過研討發(fā)現(xiàn)，終生堅持分裂的小鼠上皮細(xì)胞，隨著年齡的增高，細(xì)胞周期長度明顯延伸，究其緣由，衰老動物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其緣由主要

7、主要是G1期明顯延伸，分裂速度減慢，而S期的長度變化不大。 .衰老個體內(nèi)的環(huán)境要素影響了細(xì)胞的增殖和衰老當(dāng)用近交系小鼠進(jìn)展系列皮膚移植實(shí)驗時即當(dāng)F1變老時，移植到F2身上，依次進(jìn)展延續(xù)移植，發(fā)現(xiàn)移植的皮膚可生活7-8年，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越其原來供體的壽命，這闡明衰老個體內(nèi)的環(huán)境要素影響了上皮細(xì)胞的增殖和衰老。 .骨髓干細(xì)胞移植實(shí)驗闡明隨著年齡的添加，干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢 另外，假設(shè)將老年動物進(jìn)展強(qiáng)輻射處置，破壞其免疫干細(xì)胞，然后植入年輕動物的骨髓干細(xì)胞，可察看到年老受體動物細(xì)胞免疫功能復(fù)壯。而假設(shè)移植的骨髓干細(xì)胞是來自年老的動物，那么免疫反響就依然堅持在較低的程度上，不會復(fù)壯。其關(guān)鍵在于供體與受體的年

8、齡組合。如此得出的結(jié)論是：老年動物干細(xì)胞的免疫缺陷只是在老年受體中才表達(dá)。老年動物體內(nèi)似乎存在有阻抑細(xì)胞或阻抑因子，抑制了免疫反響。.衰老細(xì)胞構(gòu)造的變化細(xì)胞在衰老過程中大致有以下主要特征。細(xì)胞核構(gòu)造的衰老變化中最明顯的是核膜的內(nèi)折和染色質(zhì)固縮化；染色體端粒縮短。糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量減少；致密體的生成;線粒體的數(shù)量減少，而體積增大;與衰老關(guān)系嚴(yán)密的是線粒體DNA突變主要是缺失突變，線粒體DNA突變隨年齡增大,并與衰老呈正相關(guān)。.蛋白質(zhì)合成速率降低，緣由是由于核糖體的效率和準(zhǔn)確性降低以及蛋白質(zhì)合成的延伸因子的數(shù)量和活性降低所致。細(xì)胞質(zhì)膜的粘性添加，流動性降低。膜系統(tǒng)通常處于凝膠相或固相；磷脂含量逐漸下

9、降。細(xì)胞的間隙銜接明顯減少，組成間隙銜接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小。. 細(xì)胞衰老的機(jī)理 細(xì)胞衰老是一個非常復(fù)雜的生理過程，許多學(xué)者在這方面作過廣泛的研討。近幾十年來，有關(guān)細(xì)胞衰老的機(jī)制，提出了許多假說，但這些假說只是從不同側(cè)面和深度探求細(xì)胞衰老的緣由，各自雖都有一定的科學(xué)根據(jù)，但大都不能解釋衰老的全部機(jī)理。.(一遺傳程序論 該學(xué)說以為衰老是遺傳的程序化過程，衰老是特定基因控制的。 1.DNA修復(fù)才干下降 表現(xiàn)為不同物種的DNA修復(fù)才干與物種各自的平均壽命呈正相關(guān)，即高壽命的物種比低壽命的物種具有更大的DNA修復(fù)才干；同一物種內(nèi)，個體的DNA修復(fù)才干與其所處的年齡呈負(fù)相關(guān)，即高齡個體的DNA修復(fù)才干小

10、于低齡個體。以為，這種DNA修復(fù)才干下降是由于基因因受損而表達(dá)異常，細(xì)胞功能失常，衰老逐漸構(gòu)成。并以為修復(fù)才干是生物體長期進(jìn)化的結(jié)果，由遺傳要素決議。.2.端粒喪失說Herley等人對染色體端粒進(jìn)展研討發(fā)現(xiàn)，每個端粒都是由250-1500個TTAGGG反復(fù)順序組成，是由端粒酶催化合成的。在正常體細(xì)胞中無故粒酶活性，不論何時進(jìn)展細(xì)胞分裂，總有5-20個堿基對片段喪失，染色體將逐漸縮短，這樣還有多少可利用的端粒堿基對數(shù)量，似乎就能預(yù)示細(xì)胞還能分裂多久，就象細(xì)胞的衰老鐘一樣，端粒記錄著細(xì)胞的年齡并預(yù)言它的死亡。他們還發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞可產(chǎn)生端粒酶，合成端粒片段，以取代那些喪失的片段。Herley也提示，分裂

11、著的細(xì)胞中端粒的不斷喪失可促進(jìn)動脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和糖尿病的發(fā)生。.3、衰老基因?qū)W說 統(tǒng)計學(xué)資料闡明，子女的壽命與雙親的壽命有關(guān)，各種動物都有相當(dāng)恒定的平均壽命和最高壽命，成人早衰癥病人平均39歲時出現(xiàn)衰老，47歲生命終了，嬰幼兒早衰癥的小孩在1歲時出現(xiàn)明顯的衰老，1218歲即過早夭折。由此來看物種的壽命主要取決于遺傳物質(zhì)，DNA鏈上能夠存在一些“長壽基因或“衰老基因來決議個體的壽限。 研討闡明,當(dāng)細(xì)胞衰老時，一些衰老相關(guān)基因SAG表達(dá)特別活潑，其表達(dá)程度大大高于年輕細(xì)胞，已在人1號染色體、4號染色體及染色體上發(fā)現(xiàn)SAG。. 在對線蟲的研討中，發(fā)現(xiàn)基因確可影響衰老及壽限，Caen

12、rhabditis elegans的平均壽命僅3.5天，該蟲age-1 單基因突變，可提高平均壽命65%，提高最大壽命110%，age-1突變型有較強(qiáng)的抗氧化酶活性，對H2O2、農(nóng)藥、紫外線和高溫的耐受性均高于野生型。 在對早老綜合癥的研討中，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)解旋酶存在突變，該酶基因位于號染色體短臂，稱為Wrn基因。也有很多例子不符合甚至反對基因程序論，最突出的例子是飲食對蜜蜂的影響，蜂王吃王漿可活六年之久，而工蜂3-6個月，蜂王漿可是蜜蜂的壽命提高了20倍。他們的壽命不同不是由于昆蟲遺傳基因不同，他們的基因組是一樣的，只是由于飲食的不同。.二自在基實(shí)際 (free-radical theory) 自

13、在基指帶有未配對電子的粒子，由于帶有單數(shù)電子，所以極不穩(wěn)定，具有高度的化學(xué)反響性，很容易和周圍的分子發(fā)生反響，從而生成新的自在基。自在基種類繁多，其中以超氧陰離子自在基(O2 -)、羥自在基(OH)等活性氧簇自在基(reactive oxygen species,ROS)的研討最為深化。.氧自在基的損傷作用 研討闡明，自在基對生物體內(nèi)大分子產(chǎn)生極大的危害作用，攻擊的主要目的是質(zhì)膜、細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)、核內(nèi)的DNA以及胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。使質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸氧化；使蛋白質(zhì)中的羧基氧化呵斥蛋白質(zhì)交聯(lián)、變性、酶鈍化；使糖類化合物降解；使DNA鏈斷裂、交聯(lián)、堿基切除等，抑制蛋白質(zhì)、核苷酸和脂肪酸的生物合成。.細(xì)

14、胞內(nèi)去除過多的自在基的機(jī)制經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)部本身隔離，使產(chǎn)生自在基的物質(zhì)或位點(diǎn)與細(xì)胞其它組分分開；維護(hù)性酶：主要有超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)，兩者協(xié)同起維護(hù)性作用。其它抗氧化物分子，如維生素E和維生素C，它們都是自在基反響的有效終止劑。 隨著年齡的增長，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自在基以及防御自在基的系統(tǒng)之間的平衡被突破，自在基的累積增多，去除效率下降，同時伴隨著衰老的發(fā)生。.關(guān)于人類的衰老和壽命問題 人類壽命有無極限？極限是多少？抗衰老，求長壽，古往今來，人之常情，時至今日，更為人們所關(guān)注。研討闡明：哺乳動物自然壽命為生長發(fā)育期的57倍，借此推論，人類完成生長發(fā)育約在2022周歲，自然壽命應(yīng)是

15、100150歲。哺乳動物的自然壽命為性成熟的810倍。海弗里克Hayflick：人體細(xì)胞可進(jìn)展50次左右有絲分裂，每次細(xì)胞周期為24年，這樣推論，人的壽命應(yīng)在120歲左右。1. 遺傳與人類壽命：先天性，父輩主宰。父、母享有高壽，其子女往往也是高壽者。2. 壽命與性別有關(guān)：人壽保險公司統(tǒng)計闡明，性動物性動物，女人男人，為什么？眾說紛紜。.3. 環(huán)境與人類壽命：后天要素多樣錯綜復(fù)雜。體魄、環(huán)境、心思、社會、營養(yǎng)、疾病等。其中營養(yǎng)及膂力活動較為重要。4. 職業(yè)與人類壽命： 職業(yè)作為一種重要的社會要素，對人類壽命有一定的影響。日本統(tǒng)計，從事管理任務(wù)人員，平均壽命最長，依次為國家機(jī)關(guān)任務(wù)人員、專業(yè)技術(shù)人

16、員、商業(yè)任務(wù)人員、農(nóng)業(yè)任務(wù)人員、普通消費(fèi)工人、膂力勞動者、礦工。. 總得說來，近20年來，細(xì)胞衰老的研討獲得了長足的提高，但分開真正提示細(xì)胞衰老的本質(zhì)，還要走很長的路。一旦揭開了細(xì)胞衰老的，那么延緩衰老，延伸壽命將成為能夠，但辯證唯物主義通知我們，真正的長生不老是不能夠的。我們研討了解細(xì)胞衰老死亡規(guī)律，目的并不是為了防止死亡，而是要延緩細(xì)胞衰老的到來。 我們謳歌生命，也不用詛咒死亡，有生必有死，無死亦無生，我們不贊成死亡，但長生不死是進(jìn)化和開展的敵人。但愿我們每個人都能較長時間生活在這個愉快的世界，為人類的提高與文明做更多的奉獻(xiàn)。.第二節(jié) 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡cell apoptosis是借用古

17、希臘語，表示細(xì)胞象秋天的樹葉一樣凋落的死亡方式。1972年Kerr 最先提出這一概念，他發(fā)現(xiàn)結(jié)扎大鼠肝的左、中葉門靜脈后，其周圍細(xì)胞發(fā)生缺血性壞死，但由肝動脈供應(yīng)區(qū)的本質(zhì)細(xì)胞仍存活，只是范圍逐漸減少，其間一些細(xì)胞不斷轉(zhuǎn)變成細(xì)胞質(zhì)小塊，不伴有炎癥，后在正常鼠肝中也偶爾見到這一景象。. 在細(xì)胞凋亡一詞出現(xiàn)之前，胚胎學(xué)家已察看到動物發(fā)育過程中存在著細(xì)胞程序性死亡programmed death，PCD景象，近年來PCD和細(xì)胞凋亡常被做為同義詞運(yùn)用，但兩者本質(zhì)上是有差別的 。首先，PCD是一個功能性概念，描畫在一個多細(xì)胞生物體中，某些細(xì)胞的死亡是個體發(fā)育中一個預(yù)定的，并遭到嚴(yán)厲控制的正常組成部分 ，而

18、凋亡是一個形狀學(xué)概念，指與細(xì)胞壞死不同的遭到基因控制的細(xì)胞死亡方式；其次，PCD的最終結(jié)果是細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞凋亡并非都是程序化的。.2002年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎獲得者2002年10月7日英國人悉尼布雷諾爾、美國人羅伯特霍維茨和英國人約翰蘇爾斯頓，因在器官發(fā)育的遺傳調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡方面的研討獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎。.線蟲Caenorhabditis elegans 是研討個體發(fā)育和細(xì)胞程序性死亡的理想資料。其生命周期短，細(xì)胞數(shù)量少，有1031個-131個= 959(cells)神經(jīng)系統(tǒng)由302個細(xì)胞組成。這些細(xì)胞來自于407個前體細(xì)胞。這些前體細(xì)胞中有131個發(fā)生了程序死亡。.控制線蟲細(xì)

19、胞凋亡的基因主要有3個Ced-3、Ced-4和Ced-9，Ced-3和 Ced-4的作用是誘發(fā)凋亡。在缺乏Ced-3、Ced-4的突變體中不發(fā)生凋亡。有多余細(xì)胞存在。Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。使凋亡不能發(fā)生、Ced-9功能缺乏導(dǎo)致胚胎因細(xì)胞過度凋亡而死亡。.概念： 細(xì)胞凋亡是一個自動的由基因決議的自動終了生命的過程，也經(jīng)常被稱為細(xì)胞程序死亡programmed cell death， PCD。凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。.一、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義 在發(fā)育過程中和成熟組織中，細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)量是驚人的。安康人體內(nèi)，每小時約有10億個細(xì)胞凋亡。經(jīng)過凋亡，堅持機(jī)體的自穩(wěn)平衡，使有機(jī)體

20、得以去除不再需求的細(xì)胞，而不引起炎癥反映。. 鼠發(fā)育過程中足的成形過程 發(fā)育過程中手和足的構(gòu)成過程就伴隨著細(xì)胞的凋亡。胚胎時期，他們呈鏟狀，以后指或趾之間的細(xì)胞凋亡，才逐漸發(fā)育為成形的手和足。. 蝌蚪尾的消逝當(dāng)蝌蚪變態(tài)成蛙時，蝌蚪尾內(nèi)的的細(xì)胞發(fā)生編程性細(xì)胞死亡，其結(jié)果是尾消逝。變態(tài)期間出現(xiàn)的全部變化包括尾內(nèi)編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)都是被血液中胸腺激素含量升高所促進(jìn)的。. 脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育過程中，約有50%的細(xì)胞凋亡，經(jīng)過細(xì)胞凋亡來調(diào)理神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量，使之與需求神經(jīng)支配的靶細(xì)胞的數(shù)量相順應(yīng)。胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生了過量的神經(jīng)細(xì)胞，它們競爭靶細(xì)胞所分泌的生存因子，只需接受了

21、足夠量的生存因子的神經(jīng)細(xì)胞才干存活。.細(xì)胞調(diào)亡的生物學(xué)意義： 生物發(fā)育過程中及成體組織中正常的細(xì)胞凋亡有助于保證細(xì)胞只在需求它們的時候和需求它們活的地方存活。這對于多細(xì)胞生物個體發(fā)育的正常進(jìn)展，自穩(wěn)平衡的堅持以及抵御 外界各種要素 的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用。.二、細(xì)胞凋亡的形狀學(xué)和生物化學(xué)特征 壞死細(xì)胞 凋亡細(xì)胞.細(xì)胞壞死 是細(xì)胞遭到急性強(qiáng)力損傷時立刻出現(xiàn)的早期反響。包括胞膜直接破壞，大量水進(jìn)入細(xì)胞，線粒體外膜腫脹而密度添加。核染色質(zhì)呈絮狀，蛋白質(zhì)合成減慢。如及時去除損傷要素，以上早期反響尚可逆轉(zhuǎn)。假設(shè)損傷外因繼續(xù)存在，那么發(fā)生不可逆的變化。Ca2+升高、引起一系列變化，如細(xì)胞骨架破壞，

22、溶酶體釋放，pH下降，最后細(xì)胞膜和細(xì)胞器破裂，DNA降解，細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起周圍組織炎癥反響.細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別是：染色質(zhì)聚集、分塊、位于核膜上，胞質(zhì)凝縮，最后核斷裂，細(xì)胞經(jīng)過出芽的方式構(gòu)成許多凋亡小體；凋亡小體內(nèi)有構(gòu)造完好的細(xì)胞器，還有凝縮的染色體，可被臨近細(xì)胞吞噬消化，因一直有膜封鎖，沒有內(nèi)溶物釋放，故不會引起炎癥；線粒體無變化，溶酶體活性不添加；內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖譜呈梯狀；凋亡通常是生理性變化，而細(xì)胞壞死是病理性變化。.細(xì)胞凋亡的形狀學(xué)特征細(xì)胞質(zhì)緩慢收縮染色質(zhì)包裝和分別，細(xì)胞質(zhì)凝集核片段化發(fā)芽、起泡細(xì)胞裂成小片成為凋亡小體凋亡小體吞噬細(xì)胞吞噬.細(xì)胞凋亡的生化特征細(xì)

23、胞凋亡的最主要特征是DNA發(fā)生核小體間的斷裂，結(jié)果產(chǎn)生含有不同數(shù)量核小體單位的片段，在進(jìn)展瓊脂糖凝膠電泳時，構(gòu)成了特征性的梯狀條帶(DNA ladders)，其大小為180200bp的整數(shù)倍。到目前為止，梯狀條帶依然是鑒定細(xì)胞凋亡最可靠的方法。 .誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子物理性因子，包括射線紫外線， 射線等，較溫暖的溫度刺激如熱激，冷激等化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA 和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長因子，腫瘤壞死因子TNF，抗Fas/Apo-1/CD95抗體等.細(xì)胞凋亡的檢測形狀學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡察看運(yùn)用各種染色法可察看到凋亡細(xì)胞的各種形狀學(xué)特征，有些染料如臺盼藍(lán)(t

24、rypan blue)為活細(xì)胞排斥，但可使死細(xì)胞著色。DAPI是常用的一種與DNA結(jié)合的熒光染料。借助DAPI染色，可以察看到細(xì)胞核的形狀變化。Giemsa染色法可以察看到染色質(zhì)固縮、趨邊、凋亡小體的構(gòu)成等形狀。此外，運(yùn)用透視和掃描電鏡那么可察看凋亡細(xì)胞核的形狀、構(gòu)造變化如染色質(zhì)因縮、凋亡小體的構(gòu)成、細(xì)胞發(fā)泡等景象。有時也有用兩種染料進(jìn)展復(fù)染，以便更可靠地確定細(xì)胞凋亡的變化。例如用吖啶橙(AO)和溴乙錠(EB)進(jìn)展復(fù)染，AO只進(jìn)入活細(xì)胞，正常的細(xì)胞核及處于凋亡早期的細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色；EB只能進(jìn)入死細(xì)胞，將死細(xì)胞及凋亡晚期細(xì)胞的核染成橙紅色。.DNA電泳：細(xì)胞發(fā)生凋亡時，DNA發(fā)生特征性的核小體間

25、的斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，但都是180-200bp的整數(shù)倍。凋亡細(xì)胞中提取的DNA在進(jìn)展常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴乙錠進(jìn)展染色時，這些大小不同的DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶。絕大多數(shù)凋亡細(xì)胞中DNA的斷裂都表現(xiàn)出這種特征 .TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)志法TUNEL測定法(是terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) mediated dUTP nickend labeling的縮寫)，意指末端脫氧核苷酸移換酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)志測定法。這一方法能對DNA分子中3-OH斷裂缺口進(jìn)展原位標(biāo)志。凋亡細(xì)胞的核DNA中產(chǎn)生的3-OH末端，

26、可借助一種可觀測的標(biāo)志物，如熒光素進(jìn)展原位標(biāo)志，并用熒光顯微鏡進(jìn)展察看。.彗星電泳法comet assay彗星電泳法(comet assay)的原理是將單個細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處置后，再在電場中進(jìn)展短時間的電泳，并用熒光染料染色，凋亡細(xì)胞中構(gòu)成的DNA降解片段，在電場中泳動速度較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案；而正常的無DNA斷裂的核在泳動時堅持圓球形，這是一種快速簡便的凋亡檢測法。.流式細(xì)胞分析最常用來分析細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞技術(shù)是根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和喪失，采用碘化丙錠使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時又能察看細(xì)胞的周期形狀。.三、細(xì)胞凋亡的分子調(diào)

27、控機(jī)理線蟲(C.elegans)凋亡研討發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即Caspase1.Caspase家族與凋亡Caspase家族 Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteine aspartic acic specific protease，即Caspase這種高度的特異性在蛋白酶中是很少見的。由于這種特異性，使caspase可以高度選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，這種

28、切割只發(fā)生在少數(shù)(通常只需1個)位點(diǎn)上，主要是在構(gòu)造域間的位點(diǎn)上，切割的結(jié)果或是活化某種蛋白，或是使某種蛋白失活，但從不完全降解一種蛋白質(zhì)。. caspase的研討源于線蟲(C.elegans)細(xì)胞程序化死亡的研討。研討發(fā)現(xiàn)有11個基因與線蟲PCD有關(guān)，其中ced3和ced4基因是決議細(xì)胞凋亡所必需的，ced9基因抑制PCD。線蟲細(xì)胞程序化死亡的研討促進(jìn)了其他動物特別是哺乳類動物中細(xì)胞凋亡的研討。人們發(fā)現(xiàn)哺乳類細(xì)胞中存在著Ced3的同源物ICE(interleukin 1 converting enzyme)，Ced4的哺乳類同源物是Apaf1(即一種細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子apoptosis

29、protease activating factor)，而Ced9的哺乳類對應(yīng)物是BCL2. 現(xiàn)已確定至少存在11種caspase： 這些caspases中，caspase 1、 11、4被以為不直接參與凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，它們主要參與白介素前體的活化；而caspase 2、8、9、 10參與細(xì)胞凋亡的起始；參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行的那么是caspase 3、6、 7，其中caspase 3和7具有相近的底物和抑制劑特異性，它們降解PARP、DFF-45 (DNA fragmentation factor 45)，導(dǎo)致DNA修復(fù)的抑制并啟動DNA的降解。而caspase 6的底物是lamin A和kera

30、tin 18，它們的降解導(dǎo)致核纖層和細(xì)胞骨架的崩解。.caspase 超家族成員及其相應(yīng)底物.Caspase活化 Caspase本身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)裂解活化或本身活化，即在兩個亞基的銜接區(qū)的天冬氨酸位點(diǎn)進(jìn)展切割而產(chǎn)生有兩個亞基組成的異二聚體。 目前以為細(xì)胞凋亡的起始者Caspase 2、8、9、10和執(zhí)行者Caspase 3、6、7之間存在著上下游關(guān)系，即起始者活化執(zhí)行者。. 凋亡的起始者Caspase 2、8、10的活化要求以下成員參與： (1)配體/受體對，如FasL/Fas受體. (2)銜接器或接頭蛋白FADD (3)

31、修飾子蛋白 (4) Caspase 2、8、10的酶原。 當(dāng)Fas受體為其天然配體FasL所啟動時，就構(gòu)成了Fas受體、銜接器蛋白FADD和Caspase 2、8、10的酶原組成的死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物。.胞外信號分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞外表信號分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptor protein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反響，使細(xì)胞凋亡. 下游Caspases活化后，作用于底物，裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核構(gòu)成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放

32、，降解DNA構(gòu)成DNA Ladder;裂解參與細(xì)胞銜接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞伸展、零落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識別并吞噬。.Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的構(gòu)造域；Bcl-2家族成員的基因中，經(jīng)常含有三個保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3。.BCL-2家族成員.二、細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理一、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因?qū)Σ溉閯游锛?xì)胞凋亡的基因凋控過程目前還不非常清楚，研討闡明與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基都參于對細(xì)胞凋亡的凋控。

33、其中研討較多的有bcl-2 c-myc、p53、Ice、Fas/APO-1等。1、myc 在許多人類惡性腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有c-myc的過度表達(dá)，它能促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制分化。c-myc還參于細(xì)胞調(diào)亡的控制。在凋亡細(xì)胞中c-myc也是高表達(dá)。c-myc對增殖和凋亡的調(diào)理是一樣的。作為轉(zhuǎn)錄凋控因子，一方面激活那些控制細(xì)胞增殖的基因，另一方面也激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，給細(xì)胞兩種選擇：增殖或凋亡。當(dāng)生長因子存在，bcl-2基因表達(dá)時，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之細(xì)胞凋亡。.2、bcl-2 即：細(xì)胞凋亡抑制基因，稱號來源于B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/Leukemia-2，bcl-2)，

34、最早由Tsujimoto1985從伴有14、18染色體易位的淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在正常人體內(nèi)位于18號染色體，在患者易位于14號染色體。bcl-2是目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系親密的原癌基因之一，可以編碼 bcl-226KD和 bcl-222KD兩種蛋白質(zhì)，是膜的整合蛋白，主要存在于線粒體外膜、核膜及部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，它很少與其他生化機(jī)制已清楚的蛋白同源。bcl-2蛋白在正常組織本身穩(wěn)定方面起重要作用， bcl-2多出如今胸腺髓質(zhì)細(xì)胞、記憶B淋巴細(xì)胞、及壽命長的干細(xì)胞群里，如皮膚、結(jié)腸、前列腺和子宮內(nèi)膜中，但很少出如今分化末期的上皮細(xì)胞中。.bc1-2的功能相當(dāng)于線蟲中的ced9，bc1-2家族包括bcl-

35、2、bax、bad、bcl-x等。bax基因是bcl-2基因家族的一員，其產(chǎn)物是一種與bcl-2同源的相關(guān)蛋白，能拮抗后者的生物學(xué)活性。bax的主要作用是加速細(xì)胞凋亡，并與bcl-2一同調(diào)理細(xì)胞凋亡。bcl-2家族的成員通常以二聚體的方式發(fā)揚(yáng)作用，bcl-2/bcl-2，bcl-2/bax和bcl-2/bcl-xL抑制細(xì)胞凋亡，而bax/bax，bax/bad和bcl-2/bax-xs促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bad也屬bcl-2基因家族 ，是bcl-2/bcl-xL相關(guān)死亡促進(jìn)因子，作為bcl-2/bcl-xL異二聚體伴分子而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。bcl-x經(jīng)過剪切可構(gòu)成bcl-xl和blc-xs兩個產(chǎn)物。bc

36、l-xl與bcl-2同源，抑制細(xì)胞凋亡，而bcl-xs作用類似bax，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。.3、fas fas又稱作APO-1，屬TNF受體和NGF受體家族。1993年人白細(xì)胞分型國際會議一致命名為CD95。fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及皮膚角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞等等。Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。.4、ICE蛋白酶家族ICE蛋白酶參與Fas和TNFR1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，ICE與線蟲細(xì)胞凋亡基因ced-3同源，迄今已發(fā)現(xiàn)了11個同源基因，1996年后這些家族成員統(tǒng)稱為Caspase，能選

37、擇性地切割蛋白質(zhì)使其失活或激活。ced-4在哺乳動物中的同源體為Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)， Apaf-1具有激活Caspase3 (CPP32)的作用，而這一過程又需求其他兩個蛋白質(zhì)因子的參與：細(xì)胞色素c(Apaf-2)、Apaf-3。.5、p53 是一種抑癌基因，其生物學(xué)功能是在細(xì)胞周期中監(jiān)視DNA的完好性。如有損傷，那么抑制細(xì)胞增殖。直到DNA修復(fù)完成。假設(shè)DNA不能被修復(fù)，那么誘導(dǎo)其調(diào)亡，研討發(fā)現(xiàn)喪失P53功能的小鼠胸腺細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的調(diào)亡反響和正常細(xì)胞一樣，而對輻射誘導(dǎo)的調(diào)亡不敏感。.二、Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fas具有三個半胱氨酸豐富的膜外區(qū)和一個稱為死亡構(gòu)造域Death domain，DD，圖15-9胞內(nèi)區(qū)，CD95的配體CD