2免疫磁珠在ELISA中的應(yīng)用及方案設(shè)計(jì)ppt課件

1、HRP標(biāo)志單抗建立Elisa夾心法測(cè)定相應(yīng)抗原含量 匯報(bào)人：閆斯楠 時(shí)間：13.7.6一、CEA引見大腸癌組織可產(chǎn)生一種糖蛋白，作為抗原引起患者的免疫反響。此種抗原稱為癌胚抗原carcino-embryonic antigen CEA，可廣泛存在于內(nèi)胚葉來源的消化系統(tǒng)癌，也存在于正常胚胎的消化管組織中，在正常人血清中也可有微量存在。 癌胚抗原是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對(duì)大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判別、病情開展、監(jiān)測(cè)和預(yù)后估計(jì)是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物。二、方案設(shè)計(jì)常規(guī)夾心法CEA抗體1-抗原-CEA抗體2-二抗HRP標(biāo)志本實(shí)驗(yàn)夾心法CEA抗體1-抗原-CEA抗體2HR

2、P標(biāo)志該方案是直接法與夾心法的有效結(jié)合，兼具兩者的優(yōu)點(diǎn)。為目前市面上Elisa檢測(cè)試劑盒的通用發(fā)法。三、主要技術(shù)方法雙抗夾心法ElisaHRP標(biāo)志CEA單抗2SephadexG-25層析法1. ElisaA.實(shí)驗(yàn)步驟：1.抗原預(yù)包被。用包被緩沖液將抗原稀釋濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，每孔參與200微升，37孵育1小時(shí)后，4放置16-18小時(shí)。2.洗滌。倒盡板孔中液體，加滿洗滌緩沖液，靜止3分鐘后倒掉。反復(fù)3次，最后一次盡量拍干板孔中剩余液體。3.加封鎖緩沖液每孔200微升，37放置1小時(shí)。4.同2步洗滌。5.加被測(cè)血清100微升做梯度稀釋，并作陽性、陰性及空白對(duì)照。37放置1小時(shí)或者4過夜。6.同2步洗

3、滌。7.加二抗。50微升每孔參與適宜濃度的二抗，37攝氏度放置1小時(shí)。8.同2步一樣洗滌，并多反復(fù)一次，最后一次反復(fù)后一定要排干一切水分，否那么會(huì)有假陽性出現(xiàn)。9.顯色。每孔參與底物溶液100微升，室溫暗處放置10-15分鐘，然后用終止液終止顯色。10.酶標(biāo)儀讀數(shù)。B.需求配制的試劑1.包被緩沖液：0.05M pH9.6碳酸緩沖液，4保管 Na2CO3 0.15g NaHCO3 0.293g 稀釋至100ml2.洗滌緩沖液：0.01M pH7.4 PBS-Tween-20，室溫保管 NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO412H2O 2.9g 或者Na2HPO4 1.15g

4、Tween-20 0.5ml(用前暫時(shí)參與) 稀釋至1000ml3.封鎖緩沖液：在洗滌緩沖液中參與5%脫脂奶粉或者10%BSA或者0.5%雞卵清蛋 白。用時(shí)現(xiàn)配4.稀釋緩沖液：在洗滌緩沖液中參與0.1%BSA。用時(shí)現(xiàn)配5.顯色終止液：2M H2SO4，室溫保管 蒸餾水178.3ml，逐滴參與濃硫酸21.7ml，并邊參與邊混勻。6.底物緩沖液：pH5.0磷酸棗檸檬酸，4保管 Na2HPO4 7.298g 檸檬酸 4.669g 加水至1000ml7.底物溶液： TMBS底物運(yùn)用液用時(shí)現(xiàn)配，450nm顯色 TMBS1mg/ml無水乙醇 1.0ml 底物緩沖液 10ml 1%H2O2 25微升 2.

5、HRP標(biāo)志CEA單抗2戊二醛二步法和過碘酸鈉法.戊二醛二步法A.原理：戊二醛為一種雙功能試劑，經(jīng)過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共 價(jià)結(jié)合，構(gòu)成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。B.標(biāo)志步驟：(1)稱取HRP25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。(2)反響后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml1分鐘，搜集棕色流出液。如體積大于5ml，那么以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。(3)將待標(biāo)志的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴參與酶溶液中。(4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3小時(shí)。(5)加0

6、.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。(6)在攪拌下逐滴參與等體積飽和硫酸銨，置41小時(shí)。(7)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保管。C. 需求配制的試劑：(1)0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。(2)1

7、.25戊二醛液：取25戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。(3)1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。(4)0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。(5)0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。(6)PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。(7)萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。 (8)純化的特異性抗體或抗Ig抗體購買。(9)HRP(RZ3.0)購買。D.優(yōu)缺陷本法標(biāo)志步驟比較簡(jiǎn)單，反復(fù)性好。缺陷是酶的利用率低，普通只需24的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。.過碘酸鈉法A.原理：HRP經(jīng)NaIO氧化后構(gòu)

8、成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，構(gòu)成斯夫氏堿，后者可進(jìn)一步用NaBH(或乙醇胺)復(fù)原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)志抗體。B.標(biāo)志步驟:(1)稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。(2)于上液中參與0.2ml新配的0.1M NaIO溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。(3)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4過夜。(4)加20l 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的PH升高到9.09.5，然后立刻參與10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光悄然攪拌2小時(shí)。(5)加0.1ml新配的4mgml NaBH液，混勻，再置42小時(shí)。(

9、6)將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4 PBS透析，4過夜。(6)在攪拌下逐滴參與等體積飽和硫酸銨，置41小時(shí)。(7)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保管。C.需求配制的試劑(1)0.1M NaIO：稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠)溶于蒸餾水10ml中。(2)1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:0.2M NaAc (1.3

10、61克50ml) 3.7ml0.2M HAc (0.601ml50ml) 6.3ml加蒸餾水至2,000ml。(3)0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:NaCO 0.32克NaHCO 0.586克加蒸餾水至50ml再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。(4)NaBH溶液(4mgml):臨用時(shí)稱取NaBH4mg溶于1ml蒸餾水中。(5)其它的試劑及器材可參見戊二醛標(biāo)志法。D.優(yōu)缺陷本法所獲酶標(biāo)志抗體的產(chǎn)率高，將近70的HRP和Ig結(jié)合，99的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無艱苦損失，是目前最常用的方法。3. SephadexG-25層析A.分別原理：當(dāng)混合樣液加到凝膠柱上

11、，隨著洗脫劑而經(jīng)過凝膠柱時(shí)，分子大小不同的物質(zhì)遭到不同的阻滯作用。顆粒接近或大于網(wǎng)眼的分子，不能進(jìn)入凝膠的網(wǎng)眼中，在重力作用下它們隨著溶劑在凝膠顆粒之間沿較短流程向下流動(dòng)，遭到的阻滯作用小，挪動(dòng)速度快，先出層析柱此景象叫作被排阻。被排阻的最小分子量稱為該規(guī)格凝膠的排阻極限；而顆粒小于網(wǎng)眼的分子可滲入凝膠網(wǎng)眼之中，它們被洗脫時(shí)不斷地從一個(gè)網(wǎng)眼穿到另一個(gè)網(wǎng)眼，逐層分散，阻滯作用大，流程長(zhǎng)，挪動(dòng)速度慢，因以后出層析柱。在層析柱的出口處，我們用多個(gè)試管分步搜集洗脫液，就可將混合物中各組分彼此分別。當(dāng)我們從生物組織中用鹽析法提取蛋白質(zhì)后，常需求進(jìn)展蛋白質(zhì)的脫鹽任務(wù)，我們可采用層析介質(zhì)為葡聚糖凝膠G-25

12、，用適當(dāng)?shù)南疵搫┻M(jìn)展洗脫，經(jīng)凝膠層析，就可以將大分子蛋白質(zhì)與小分子鹽類分別。B.試劑的配制1.葡聚糖凝膠-25溶脹凝膠方法：按每個(gè)層析柱約4g的量稱取葡聚糖凝膠G-25于燒杯中，加過量蒸餾水于沸水浴中溶脹2小時(shí)或在室溫下溶脹6小時(shí)以上。用傾瀉法除去上層漂浮的細(xì)碎凝膠，反復(fù)34次。操作中防止猛烈攪拌，防止破壞其交聯(lián)構(gòu)造。2.BaCl2溶液1%3.考馬斯亮藍(lán)G-250稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再參與85%的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL。暗處存放。4.脲6mol/L5.洗脫劑 常規(guī)PBSC.操作步驟1.層析柱的預(yù)備(1)清洗：每組取一支層析柱，用

13、清水沖洗干凈。假設(shè)玻璃柱較臟，應(yīng)卸去塑料安裝，先入洗液中浸泡2小時(shí)。(2)安裝與檢查：檢查出口安裝中尼龍綢或燒結(jié)濾板能否完好干凈。安裝層析柱，讓其垂直固定于滴定臺(tái)架上。對(duì)準(zhǔn)出口處，放一只250mL燒杯。向?qū)游鲋鶅?nèi)灌洗脫劑，翻開出口螺旋夾，檢查有無滲漏、出口乳膠管能否通暢等情況。(3)排氣泡：堅(jiān)持柱內(nèi)一定的水位，用手指彈擊柱壁，部分氣泡會(huì)從溶液中上浮排出。出口處的小氣泡易停留在螺旋夾附近的乳膠管內(nèi)，要想法排盡，否那么會(huì)影響分別結(jié)果，排氣終了，保管柱內(nèi)12cm高水位，關(guān)緊螺旋夾。(4)標(biāo)志高度：在距頂端810cm處做一標(biāo)志，作為衡量灌裝層析介質(zhì)床體高度1517cm的根據(jù)。2.裝柱每組用50mL燒杯

14、取溶脹的凝膠懸漿2530mL，靜置片刻，察看凝膠沉淀與水的體積之比，約為1:1即可，否那么應(yīng)作調(diào)整。悄然攪勻杯中凝膠，用玻璃棒引流入柱，翻開出水口，并不斷地向柱內(nèi)補(bǔ)充凝膠，直到凝膠沉淀高度位于標(biāo)志上方約2cm為止，凝膠柱內(nèi)假設(shè)有氣泡和斷層或柱床外表干水和歪斜，都將影響分別效果。必要時(shí)，需倒出凝膠，重新裝柱。3.平衡取15mL洗脫劑，用滴管沿柱內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)著漸漸流下，不可激動(dòng)膠平面，翻開出水口，經(jīng)洗脫液的流動(dòng)，一方面清洗內(nèi)壁，另一方面使膠床收緊。洗脫平衡終了，膠床上方保管約4cm高水位，封鎖出水口。此時(shí)，膠床高度15cm為宜。4.預(yù)備搜集取6只干凈的刻度試管除凈試管內(nèi)殘留的水，16編號(hào)，并在試管2m

15、L處作一標(biāo)志，插入試管架上，為搜集洗脫樣品作好預(yù)備。5.上樣與搜集翻開出口排水，當(dāng)膠床與上方水層的彎月面相切時(shí)，封鎖出口，用滴管將0.2mL混合樣液沿柱內(nèi)壁漸漸參與，勿激動(dòng)膠面。上樣終了，翻開出水口，開場(chǎng)搜集一號(hào)管。每管搜集洗脫液2mL。當(dāng)樣液進(jìn)入膠床，其彎月面與膠平面相切時(shí)，暫停排液，用滴管將洗脫劑沿柱內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)著參與1cm高水位，然后排液，至其彎月面與膠平面相切，再漸漸注入35cm高的洗脫劑。6.洗脫不斷向柱內(nèi)加洗脫劑，堅(jiān)持膠床上水位35cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至搜集到6號(hào)管達(dá)2mL時(shí)，封鎖出口。7.鑒定另取6只干凈試管，按搜集順序?qū)⑾疵撘阂环譃槎?，即每?mL，依次在試管架上排成

16、二排。第一排每管加2滴BaCl2，根據(jù)白色沉淀多少，判別SO42-在各管中的濃度。第二排每管加1mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，根據(jù)藍(lán)色情況，判別蛋白質(zhì)在各管中的濃度。將結(jié)果記錄于下表中。假設(shè)鑒定的第6號(hào)管中，仍有樣品，闡明洗脫和搜集不夠，需添加7號(hào)、8號(hào)試管繼續(xù)洗脫與搜集，同上法鑒定其蛋白質(zhì)和鹽濃度情況。管號(hào)項(xiàng)目1234567891011白色沉淀量藍(lán)色深淺8.再生鑒定終了，翻開出水口，繼續(xù)用倍床體積洗脫劑洗脫，洗脫后封鎖出口，以備下次運(yùn)用。四、實(shí)驗(yàn)所需購買資料、試劑材料、試劑訂購公司價(jià)格預(yù)計(jì)使用量賴氨酸金泰公司（長(zhǎng)春）124元/100g100gHRP（辣根過氧化物酶）金泰公司（長(zhǎng)春）250元/

17、100mg20mgCEA抗原（L1C00207）上海領(lǐng)潮科技有限公司待詢（1mg/mL）1mgCEA IgG1（單抗貨號(hào)L1C00205）上海領(lǐng)潮科技有限公司待詢1mgCEA IgG1（多抗貨號(hào)L1C00202）上海領(lǐng)潮科技有限公司待詢5mgNaIO金泰公司（長(zhǎng)春）80元/100g500mgNaBH金泰公司（長(zhǎng)春）90元/100g500mgSephadex G-25層析柱(2cm50cm/1cm25cm)杭州三特醫(yī)藥化工有限公司450元-650元/個(gè)1個(gè)Sephadex G-25鄭州勤實(shí)科技有限公司300元/25g5g13.7.21日過碘酸鈉法標(biāo)志HRP于鼠單抗標(biāo)志終了，結(jié)果如下：利用BioT

18、ec多功能微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)標(biāo)志物的OD280nm及OD403nmOD280nm=0.674OD403nm=0.438IgG量mg/ml=OD280nm-OD403nm*0.3*0.62=0.336412酶量mg/ml=OD403nm*0.4=0.1752克分子比值E/P=酶量*4/IgG量=2.08315 即2.08315個(gè)HRP分子結(jié)合在一個(gè)抗體分子上。酶結(jié)合率=酶量*體積/抗體=52.08% 標(biāo)志率0.6經(jīng)過多次ELISA驗(yàn)證HRP標(biāo)志勝利的單抗的可用性0.2780.2321.7691.9381.4681.4891.0041.1110.4010.3361：500稀釋包被抗原0.2680.2

19、211.6691.8381.3681.3320.9860.9420.3010.3361：2000稀釋包被抗原0.2790.2431.65517711.2641.4750.7650.8050.2890.2951：4000稀釋包被抗原陰性對(duì)照原濃度單抗1:50稀釋單抗1:100稀釋單抗1:200稀釋單抗HRP標(biāo)志單抗效價(jià)測(cè)定間接法：抗原包被+HRP標(biāo)志的鼠單抗+TMB及終止液顯色由以上數(shù)據(jù)可看出，HRP標(biāo)志的單抗效價(jià)為最高1:100，但由于ELISA陽性值在1以上同時(shí)不能過大為最正確選擇，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇1:50稀釋酶標(biāo)單抗，這個(gè)效價(jià)為HRP標(biāo)志前的單抗效價(jià)的50%，即本方法標(biāo)志單抗導(dǎo)致單抗效價(jià)降

20、低50%。運(yùn)用HRP酶標(biāo)單抗構(gòu)建測(cè)定抗原羊肚菌菌絲含量的規(guī)范曲線抗原捕獲量測(cè)定雙抗夾心法：兔多抗包被+梯度濃度抗原+HPR標(biāo)志鼠單抗+TMB及終止液顯色抗原濃度（ng/ml)025.0450.0875.12100.16125.20150.24175.28200.32平行對(duì)照(OD450nm)0.2160.4320.6890.8761.0021.1891.3511.5061.5240.2310.4250.7010.8431.0241.2041.3871.5231.517平均值0.2240.4290.6950.8601.0131.1971.3691.5151.521免疫磁珠在ELISA中的運(yùn)用及方

21、案設(shè)計(jì) 匯報(bào)人 閆斯楠 日期 2021.9.1目錄1.免疫磁珠技術(shù)簡(jiǎn)介2.免疫磁珠技術(shù)的運(yùn)用及優(yōu)缺陷3.免疫磁珠與ELISA聯(lián)用的方案設(shè)計(jì)1.免疫磁珠技術(shù)簡(jiǎn)介1.1 免疫磁珠的構(gòu)造 免疫磁珠IMB，也稱免疫磁性微球，是一種均勻、具有超順磁性及維護(hù)性殼的球形小粒子，根本上有載體微球和免疫配基結(jié)合而成。其中心為順磁性粒子，中心外層包裹一層高分子料，最外層是免疫配基。免疫磁性微球構(gòu)造免疫磁珠載體微球載體微球磁性物質(zhì)高分子層功能基金屬小顆粒Fe2O3、Fe3O4如聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸、酶類、多糖淀粉、纖維素、葡聚糖、果膠等、球蛋白和牛血潔白蛋白等如氨基、羧基、羥基，使其表現(xiàn)具有

22、疏水-親水、非極性-極性、帶正電荷-帶負(fù)電荷等不同的物理性質(zhì)免疫配基免疫配基經(jīng)過生物高分子的功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體微球上構(gòu)成免疫磁珠。由于載體微球制備資料和方法不同，其表現(xiàn)出的物理性質(zhì)也不同，從而可結(jié)合不同的免疫配基，如抗原、抗體、凝集素、DNA和RNA等。配基必需具有生物專注性的特點(diǎn)，而且載體微球與配基結(jié)合要不影響或改動(dòng)配基原有的生物學(xué)特性，保證磁珠的特殊識(shí)別功能。1.2 免疫磁珠的性質(zhì)由于免疫磁珠的大小和外形具有均一性，從而可使靶物質(zhì)迅速和有效地結(jié)合到磁珠上，也可使生成的新復(fù)合物在磁場(chǎng)中具有一樣的磁呼應(yīng)性，且行為一致磁珠的球形構(gòu)造可消除與不規(guī)那么外形粒子有關(guān)的特異性結(jié)合順磁性可使磁珠置于磁場(chǎng)時(shí)顯示其磁性，并做定向挪動(dòng)，從磁場(chǎng)移出時(shí)磁性消除，磁珠分散，由此可方便地進(jìn)展分別和磁性導(dǎo)向維護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕免疫配基可特異性地結(jié)合反響體系中相應(yīng)的抗原、抗體、核酸等生物活性物質(zhì)1.3 免疫磁珠技術(shù)免疫磁珠IMB技術(shù)：是一種以特異的抗原抗體反響為根底的免疫學(xué)檢測(cè)和分別技術(shù)。它是以抗體包被的磁珠為載體，經(jīng)過抗體與反響介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合，構(gòu)成抗原-抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場(chǎng)的作用下發(fā)生定向挪動(dòng)，從而到達(dá)分