第七章分子生物學(xué)其它實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、PAGE PAGE 117第七章 分子生物學(xué)其它實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)一 M13克隆和DNA序列分析一、原理和用途DNA的序列分析是DNA分子克隆研究中最重要的方法之一，對于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片段的操作方面，都有著十分廣泛的實(shí)用價(jià)值。根據(jù)DNA序列，可以得知限制性酶切位點(diǎn)；可以了解蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和上、下游調(diào)控序列，進(jìn)而研究編碼基因的表達(dá)；可以確定基因誘變后特異的堿基變化；在疾病基因診斷中，可提示疾病的分子缺陷，并確認(rèn)某個(gè)位置的堿基突變，從而找出疾病發(fā)生的機(jī)制。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和Gilbert（197

2、7）發(fā)明的化學(xué)修飾法。這兩種方法在原理上差異很大，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生A、T、C、 G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得DNA序列。目前應(yīng)用廣泛的是M13噬菌體克隆-雙脫氧核苷酸（ddNTP）的DNA測序法。M13噬菌體克隆-雙脫氧核苷酸（ddNTP）測序法的基本原理是：M13噬菌體是一種單鏈DNA噬菌體，但它在感染宿主（大腸桿菌）后，在菌體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成為雙鏈并繁殖，又以單鏈形式透出菌體，再度感染新的宿主菌。把一段待測DNA用遺傳工程方法插入雙鏈的M13復(fù)制型DNA中，經(jīng)過培養(yǎng)擴(kuò)增，在培養(yǎng)物的上清液中

3、可以提取到單鏈的M13噬菌體的DNA。該單鏈DNA已含有插入待測DNA的序列，作為單鏈模板。在待測DNA的3端人工合成一段引物，在DNA聚合酶I作用下，復(fù)制鏈延長。2，3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）摻入到核苷酸生長末端，取代了脫氧核苷（dNTP）之后，由于ddNTP沒有3-OH基團(tuán)，所以核苷酸鏈就不再能夠繼續(xù)延長（終止了鏈的合成），這種復(fù)制延長的終止是隨機(jī)的，于是形成分子量、長度、大小不等的片段。然后再電泳分離，自顯影，讀圖分析堿基序列。例如在同一個(gè)反應(yīng)試管中，加入同一種DNA合成的引物和模板，DNA聚合酶，ddTTP，dTTP，以及其它3種脫氧核苷三磷酸 （dATP、dGTP和dCTP）

4、，其中dATP是帶32P放射性標(biāo)記的，那么經(jīng)過適當(dāng)?shù)臏赜螅瑢?huì)產(chǎn)生出不同長度的DNA片段混合物。它們?nèi)季哂型瑯拥?-末端，并在3末端的ddTTP處終止。將這種混合物，加到變性的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，就可以獲得一系列全都以 3-末端ddTTP為終止殘基的DNA片段的電泳譜帶模式。使用其它核苷酸的抑制物，如 ddATP，ddCTP，ddGTP，并分別在不同反應(yīng)試管中溫育，然后連同第一個(gè)ddTTP反應(yīng)，平行加到同一變性凝膠上作電泳分離，最后再通過放射自顯影技術(shù)，檢測單鏈DNA片段的放射性條帶。結(jié)果可以從放射性X光片上，直接讀出DNA的核苷酸順序。由于M13噬菌體克隆-雙脫氧核苷酸（dd

5、NTP）測序法采用的是DNA分子克隆的方法，即將不同限制酶消化切割的DNA限制片段，隨機(jī)地克隆到一種合適的載體分子上。使用這樣的克隆程序的本身，就可以保證所有來自同一個(gè)重組體克隆的后代，都含有一種同源的插入序列。另一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)是，序列測定反應(yīng)中所必須的引物序列是M13mp載體上多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的已知序列（正向引物和負(fù)向引物），所有的待測定的DNA片段，都可以共用一種引物，此引物稱做“通用引物”（universal primer），這樣就避免了合成和分離各種不同引物的許多麻煩。DNA堿基序列測定的方法還有很多，近年來還應(yīng)用熒光標(biāo)記代替了同位素標(biāo)記，它是用4種不同最大吸收峰的熒光物質(zhì)標(biāo)記4種不同堿基

6、，這樣就可用儀器代替人工讀圖譜，再經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理，序列測定可完全自動(dòng)化，效率大為提高，這樣連成一體的儀器稱為全自動(dòng)測序儀。二、實(shí)驗(yàn)材料外源DNA和M13噬菌體載體。三、溶液與緩沖液M13mp系列載體E.coli JML01及感受態(tài)細(xì)胞TE緩沖液T4 DNA連接酶及緩沖液DATPSOB培養(yǎng)基：100 mL中含2.0 g Tryptone，0.5 g Yeast extract，0.05 g NaCl，1.5瓊脂，混勻后加入KCl 0.186 g（pH 7.0）。100 mmol/L IPTG：24 mg IPTG溶于l mL ddH2O。2 X-gal（M/V）：溶于二甲基甲酰胺。2YT培養(yǎng)基：

7、100 mL中含1.6 g 胰蛋白胨，1.0 g 酵母粉，0.5 g NaCl，1.5瓊脂 （pH 7.0）。0.7YT上層瓊脂：YT液體培養(yǎng)基中入0.7瓊脂。LB培養(yǎng)基：100 mL中含1.0 g胰蛋白胨，0.5 g酵母粉，1.0 g NaCl，1.5瓊脂（pH 7.0）。PEG3 mol/L NaAcM13引物：互補(bǔ)于M13克隆位點(diǎn)3端DNA單鏈的人工合成的17個(gè)堿基的寡核苷酸片段。-32PdATP。DNA聚合酶I（Klenow片段）。10%過硫酸胺TEMED尿素按表71加入4種dNTP底物混合物。表71 四種測序反應(yīng)管中4種dNTP加入量混合物dATP（mol/L）dCTP（mol/L）

8、dGTP（mol/L）dTTP（mol/L）XA1.96245245245XC1.9416322322XG1.9432216322XT1.94322322164種ddNTP：0.125 mmol/L ddATP0.5 mmol/L ddCTP0.5 mmol/L ddGTP1.0 mmol/L ddTTP上樣液：0.1%二甲基苯藍(lán)0.1溴酚藍(lán)95甲酰胺10 mmol/L EDTA40（W/V）丙烯酰胺: N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（19:1）：丙烯酰胺 38 gN，N-亞甲基雙丙烯酰胺2 g溶于ddH2O定容至 l00 mL。5TBE：Tris 54.0 g Na2EDTA2H2O 0.93 g

9、硼酸 27.5 g加ddH2O至 800 mL用硼酸調(diào)pH至8.0（約加2.5 g）用ddH2O定容至1 L。四、儀器設(shè)備及耗材恒溫?fù)u床，臺式高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養(yǎng)箱，電泳儀無菌，工作臺，微量移液器，吸頭，EP管。五、實(shí)驗(yàn)方法1外源DNA在M13噬菌體載體的克?。?）將適量的M13載體DNA與待克隆的外源DNA片段混合，兩種DNA的體積合計(jì)不得超過7.5 L；不足時(shí)，可加TE（pH 8.0）將體積補(bǔ)足至7.5 L。加入1 L l0T4 DNA連接酶緩沖液和1 L 10 mmol/L ATP?；靹蚝笕〕? L放于另一個(gè)含有9 L TE（pH 8.0）的管中，貯存

10、于4備用。注意：10 L連接反應(yīng)液中應(yīng)含M13 DNA 20 ng（0.004 pmolL），待測插入片段取20 ng100 ng（0.004 pmolL0.02 pmolL），這種組合可得到適量的重組體，適于大多數(shù)克隆實(shí)驗(yàn)。同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)對照反應(yīng)，其中：同等量的載體DNA，無外源DNA；同等量的載體DNA和適量的對照DNA，后者應(yīng)在以往的實(shí)驗(yàn)中曾成功地克隆于M13噬菌體（例如用識別四核苷酸序列并可產(chǎn)生合適粘端的限制酶消化的噬菌體DNA）。（2）在步驟（1）的每個(gè)反應(yīng)中各加入0.5 L的T4 DNA連接酶，略加振蕩，于16溫育46 h。（3）從70冰箱中取出一份凍存的E.coli JML01感受

11、態(tài)細(xì)菌（每管100 L），于室溫融化，然后冰浴10 min。（4）吸取5 L連接反應(yīng)液，加入到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，立即置冰浴中45 min。（5）42熱激90 s，立即將管放回冰浴之中，2 min 后加入175 L SOB培養(yǎng)液，輕輕振蕩混勻。（6）將上述混合培養(yǎng)物涂布在預(yù)先用20 L IPTG(100 mmol/L)和100 L X-gal（20 mg/mL）的LB瓊脂平板上。（7）將平皿倒置，于37培養(yǎng)812 h，觀察白色噬菌斑。2制備重組M13單鏈DNA模板（1）挑取白色單菌落，接種于5 mL 2YT液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1比例稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。（2）取2 mL

12、培養(yǎng)液加入10 mL培養(yǎng)管中，再加入單個(gè)噬菌斑，于37振蕩培養(yǎng)58 h。（3）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入1.5 mL Eppendorf管中，10 000 r/min離心10 min。（4）將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL Eppendor管中，10 000 r/min再離心10 min。（5）吸取1.2 mL上清液，加入到300 L PEG溶液中，振蕩混勻，室溫或于4靜置15 min。（6）10 000 r/min離心15 min（沉淀M13顆粒），吸棄上清液，再離心2 min，棄上清液。（7）加入200 L TE緩沖液，振蕩，分散病毒顆粒。（8）加入200 L平衡酚，混勻，12 000 r/min離心5 m

13、in。（9）吸取180 L上清液，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），混勻，同上抽提1次。（10）吸取160 L上清液，加入1/10 體積的3 mol/L NaAc、2.5 體積無水乙醇，于-70放置30 min，沉淀單鏈DNA。 （11）10 000 r/min離心15 min，棄去上清液，沉淀用70乙醇洗1次，離心5 min，吸去上清液，再離心2 min，吸去殘余上清液，真空抽干沉淀。（12）加入10 L TE溶解沉淀，備用。3測序反應(yīng)（1）取4支1.5 mL的Eppendorf管，標(biāo)記A、C、G、T，分別加入以下試劑，備用。A管：1 L XA、1 L 0.125 mmol/L

14、 ddATP，C管：1 L XC、1 L 0.5 mmol/L ddCTP，G管：1 L XG、1 L 0.5 mmol/L ddGTP，T管：1 L XT、1 L 1.0 mmol/L ddTTP。（2）于另一個(gè)1.5 mL Eppendorf管中加入4 L重組M13單鏈DNA模板、2 L L引物、 1 L l0聚合酶反應(yīng)緩沖液，ddH20補(bǔ)至總體積12.4 L，混勻。置5565保溫10 min，室溫放置緩慢冷卻，使引物與模板退火。（3）加入l L -32pdATP、1 L大腸桿菌DNA聚合酶I（Klenow片段）、瞬時(shí)離心混勻。 （4）各取3 L分別加入A、C、G、T管中，瞬時(shí)離心混勻。（

15、5）30水浴保溫15 min，各加入1 L 0.5 mol/L dATP，瞬時(shí)離心混勻，再于30水浴保溫15 min。（6）各管加入上樣液4 L，混勻，于95變性3 min，速置冰中備用4測序凝膠板的制備、核苷酸鏈的電泳分離及放射自顯影（1）電泳用玻璃板處理確定凝膠接觸面（制膠面），做上標(biāo)記。 制膠面用洗液處理，水沖凈，洗潔凈擦洗，水徹底沖凈，豎起涼干。將凹槽玻璃板制膠面硅化（第一次使用的玻璃板需硅化2次），自然干燥。（2）制膠模將玻璃板平放于實(shí)驗(yàn)臺上，玻璃板間左右兩側(cè)邊緣夾放0.4 mm厚的邊條。用膠帶封住兩側(cè)及底邊，夾子夾緊，30度水平夾角傾斜放置。（3）配制6聚丙烯酰胺凝膠溶液取12 m

16、L 40（W/V）丙烯酰胺:N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（19:1），37 g尿素、16 mL 5TBE、適量ddH2O，微加熱溶解后定容80 mL。真空抽氣10 min。加入300 L 10過硫酸胺、20 L TEMED，混勻。（4）灌膠混勻后，立即緩緩平穩(wěn)地將溶液灌入膠膜中，不能出現(xiàn)氣泡。將鯊魚齒梳平端插入凹槽膠中深約0.51.0 cm。膠凝固后，除去下端封邊的膠帶，將膠板安置在垂直板電泳槽上，上、下槽內(nèi)加入TBE緩沖液。小心將鯊魚齒梳拔出，用TBE緩沖液洗槽，可加入1滴溴酚藍(lán)觀察膠面是否平整。觀察后，更換槽內(nèi)緩沖液，將梳子反過來插入，齒尖正好與膠面接觸，不得深入膠內(nèi)。（5） 預(yù)電泳：2 00

17、0V電壓，預(yù)電泳1 h。（6） 上樣。原序列：5-ATGGTCATAGCTGTTTC-3反應(yīng) G A T C ATGGTCATAGCTGTTTC ATGGTCATAGCTGTTT ATGGTCATAGCTGTT ATGGTCATAGCTGT ATGGTCATAGCTG ATGGTCATAGCT ATGGTCATAGC ATGGTCATAG ATGGTCATA ATGGTCAT ATGGTCA ATGGTC ATGGT ATGG ATG AT A-圖7-1 M13克隆DNA序列分析讀片示意圖（7） 電泳：用移液器小吸頭將核苷酸序列測定反應(yīng)液，按ACGT的次序把4管內(nèi)的產(chǎn)物加到聚丙烯酰胺-尿素凝膠

18、板點(diǎn)入鯊魚齒梳齒間，可分兩次上樣，第一次上樣3.5 L，2 000 V電壓電泳2 h后，第二次將剩余樣品全部上樣，3 000 V電壓電泳67 h。（8） 加X光片：取下膠板，掀起帶凹槽玻璃板，膠上鋪一層保鮮膜，去除氣泡，于暗室中壓片，-20曝光過夜（暗盒上最好壓上重物，以便使X-光片與膠貼緊）。（9） X光片的顯影、定影：將曝光完畢后的X-光片在暗室置于水中濕潤，然后置于顯影液中顯影，直至條帶清晰顯示為止。用水淋洗片刻后置于定影液中定影15 min以上，取出干燥。（10）讀片：從第二次上樣的底部找到插入片段與載體連接處的限制性酶切序列（此順序是已知的），以此為起點(diǎn)，從下往上讀就是新合成鏈5向3

19、的堿基序列（見圖7-1），其互補(bǔ)鏈就是原插入M13的待測DNA 3至5的堿基序列。每次可讀出200300個(gè)核苷酸序列。六、作業(yè)與思考題序列分析過程中的終止效應(yīng)是如何產(chǎn)生的？如何根據(jù)放射自顯影X-光片上的條帶確定測序的核苷酸序列?實(shí)驗(yàn)二 Western印跡分析（I）一、原理和用途W(wǎng)estern印跡分析（Western blotting）是將蛋白質(zhì)經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后用特異性抗體進(jìn)行特異酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA）檢測的免疫學(xué)方法。它是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異蛋白質(zhì)檢測方法，具有很高的靈敏度，能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析水平。粗蛋白提取

20、物中，小于50 ng的抗原可以測出，在較純的制劑中，可測出15 ng抗原。其原理是：轉(zhuǎn)化的外源基因正常表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中含有一定量的目的蛋白。從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)胺分子大小分離，將分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相膜上，膜在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉非特異性位點(diǎn)。然后加入特異抗體（一抗），印跡上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗專一結(jié)合的二抗，最后通過二抗上標(biāo)記化合物的性質(zhì)進(jìn)行檢出。根據(jù)檢出結(jié)果，可得知被檢細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)與否、濃度大小及大致的分子量。在基因工程中，Western印跡

21、分析是非常有用的技術(shù)，特別對轉(zhuǎn)基因高等生物的研究中，可用于檢測（1）外源基因在轉(zhuǎn)基因個(gè)體中的表達(dá)活性；（2）外源基因在轉(zhuǎn)基因個(gè)體中表達(dá)的器官組織特異性；（3）外源基因在轉(zhuǎn)基因個(gè)體中的表達(dá)調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)基因植物的基因表達(dá)檢測為例，介紹Western印跡分析的基本方法。二、實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)化植物相同器官或部位的組織材料。三、溶液與緩沖液蛋白提取緩沖液：25 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）10 mmol/L KCl20 mmol/L MgCl2l mmol/L DTTl mmol/L PMSF（現(xiàn)加）100丙酮溶液（含0.09-巰基乙醇）。樣品緩沖液：50 mmol/L Tris

22、HCl（pH 6.8）2SDS10甘油5-巰基乙醇0.1溴酚蘭30單體貯液：稱取29.2 g丙烯酰胺（Acr），0.8 g甲叉雙丙烯酰胺（Bis），ddH2O定容至100 mL，4保存。10過硫酸銨：一般現(xiàn)配現(xiàn)用。稱1 g過硫酸銨，ddH2O定容至10 mL。濃縮膠緩沖液：Tris 3.03 gddH20 45 mL10SDS 2 mL用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，ddH2O定容至 50 mL，復(fù)調(diào)pH至6.8。4分離膠緩沖液：1.5 mol/L TrisHCl0.4SDS，pH 8.84濃縮膠緩沖液：0.5 mol/L TrisHCl0.4SDS，pH 6.810SDS：稱取5 g SDS，加雙蒸

23、水至50 mL。TE MED （N,N,N,N-四甲基乙二胺）。10電極緩沖液：甘氨酸 144 gTris 30 g10SDS 100 mL加蒸餾水至 1000 mL固定液：95乙醇 131 mL冰乙酸 25 mL加蒸餾水至 250 mL浸泡液：95乙醇 79 mL醋酸鈉 17 g25戊二醛 1.2 5 mL硫代硫酸鈉 0.5 g加蒸餾水至250 mL。銀染液：AgNO3 0.25 g甲醛 50 L加蒸餾水定容至250 mL。顯色液：碳酸鈉 6.25 g甲醛 25 L加蒸餾水定容至250 mL脫色液：乙醇 250 mL冰乙酸 80 mL加蒸餾水定容至1000 mL考馬斯亮藍(lán)染液：0.29 g考

24、馬斯亮藍(lán)R-250溶解在250 mL脫色液中。在使用前邊攪拌邊加熱至60。第一抗體：用被檢蛋白質(zhì)制備的兔抗血清。第二抗體：用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG。轉(zhuǎn)移緩沖液：380 mmol/L甘氨酸50 mmol/L Tris0.1SDS20甲醇加水至1000 mL封閉液：含3牛血清白蛋白（BSA）的TNT緩沖掖。TNT緩沖液：10 mmol/l TrisHCl（pH 8.0），150 mmol/L NaCl0.05 Tween20DAB顯色液：10 mmol/L TrisHCl（pH 7.6）0.3CoCl20.6二氨基聯(lián)苯胺（DAB）30H2O2。堿性磷酸酶緩沖液：100 mmol/L NaCl

25、50 mmol/L MgCl2100 mmol/L TrisHC1（pH 9.5）NBT/BCIP顯色液：堿性磷酸酶緩沖液10 mL，加0.075氯化硝基四氮唑藍(lán)（75 mg NBT溶于1 mL二甲基甲酰胺）33 L，0.0755-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（50 mg BCIP溶于1 mL二甲基甲酰胺）11 L。四、儀器設(shè)備及耗材高速低溫離心機(jī)，電泳儀，垂直平板電泳槽，搖床，洗脫儀，轉(zhuǎn)移電泳槽，硝酸纖維素膜（NC膜），其它：離心管、Tip頭、一次性PE手套。五、實(shí)驗(yàn)方法1植物可溶性蛋白的提取（4下進(jìn)行）分別從轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)化植物相同器官或部位剪取2 g材料，用蒸餾水洗凈，投到置4冰浴的研缽中；分

26、別加入2倍體積的4下存放的蛋白提取液，研磨至勻漿；10 000 r/min離心，取上清液；加入5倍體積的冷丙酮（含0.09的-硫基乙醇），置20 1 h；12 000 r/min離心，收集沉淀；冰凍干燥機(jī)干燥成粉末保存；使用時(shí)，用樣品緩沖液溶解蛋白，取待測蛋白溶液l mL，適當(dāng)稀釋，在波長260 nm和280 nm下測吸光值，然后利用下列公式估計(jì)蛋白含量：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）1.45A280-0.74A260。2SDS分離蛋白質(zhì)制膠：根據(jù)待檢蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，確定需配制度凝膠濃度（表72）。按表73配制相應(yīng)濃度的膠。表72 丙烯酰胺濃度與被分離蛋白質(zhì)的關(guān)系（SDS）丙烯酰胺濃度分離蛋白質(zhì)（

27、Da）5.00.572.121057.53.69.410410.01.66.810415.01.24.3104表73 SDS分離膠的配方貯 液分離膠中丙烯酰胺終濃度（）5.07.510.012.015.030單體貯液(mL)2.503.755.006.007.504分離膠緩沖液(mL)3.753.753.753.753.75H2O(mL)8.757.506.255.253.7510過硫酸銨（L）200200200200200TEMED（L）1010101010在配制凝膠時(shí)，將水、30單體貯液混合完全后，真空脫氣5min，然后加入過硫酸銨和TEMED，充分混合后，緩慢地倒入已經(jīng)固定在夾心垂直平板

28、電泳槽兩片玻璃的窄縫中，并注意在本操作過程中不能產(chǎn)生任何氣泡。然后盡快地在分離膠的上面輕輕地覆蓋一層水，在室溫下靜置1530 min。當(dāng)凝膠完全聚合后，則在水相和凝膠的交界處有一明顯的亮線。除去上層水相，并用濾紙條吸干，再灌以濃縮膠。濃縮膠的配方如表74。灌制好濃縮膠后，立即插上樣品梳子。凝固后將電極緩沖液倒入電泳槽，并使負(fù)極槽液面高于短玻璃片，正極槽液面可稍低，輕輕將梳子拔出。表74 SDS濃縮膠的配方貯 液取用體積（mL）30單體貯液0.6504濃縮膠緩沖液1.250H203.05010過硫酸銨100TEMED10（2）點(diǎn)樣將轉(zhuǎn)基因植物蛋白質(zhì)提取液、非轉(zhuǎn)化植物蛋白質(zhì)提取液、負(fù)對照樣品、正對

29、照樣品及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品分別與載樣緩沖液等體積混合，使用前100加熱35min，每孔上樣量一般為210 g，蛋白液的濃度一般為l mg/mL。記錄樣品順序。（3）電泳：先以1015 mA穩(wěn)流電泳，待溴酚藍(lán)指示線（藍(lán)色）到達(dá)濃縮膠和分離膠界面時(shí)，改為2030 mA穩(wěn)流電泳。電泳結(jié)束后，溴酚藍(lán)泳動(dòng)至接近凝膠邊緣時(shí)停止電泳。3轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)（1）電泳結(jié)束后，取出膠，置轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30 min。（2）剪取硝酸纖維素膜，于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。（3）將轉(zhuǎn)移裝置中的海綿置轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。（4）將膜鋪在膠上，排出氣泡。用兩塊3 MM濾紙將膠和膜夾好，再夾上海綿，放入電轉(zhuǎn)移槽中。注意膜的一面靠正極（見圖72

30、）。（5）電泳槽中加入轉(zhuǎn)移緩沖液，60 V、40下轉(zhuǎn)移2.5 h。（6）取下膠和膜，倒扣于濾紙上，用鉛筆在膜上描出膠上點(diǎn)樣孔位置，揭去膠，從膜上剪下分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)樣品的泳道條帶，置氨基黑中染色，照相。4封閉（1）將轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜置TNT緩沖液中沖洗23次。（2）轉(zhuǎn)入含1BSA的TNT緩沖液中，37封閉30 min，其間輕輕搖動(dòng)。5免疫反應(yīng)（1）將封閉后的膜置TNT緩沖液中漂洗23次，每次510 min。（2）加入用TNT稀釋的第一抗體10 mL，37輕輕搖動(dòng)1 h。（3）將結(jié)合了第一抗體的硝酸纖維膜，置TNT緩沖液中洗三次，每次510 min。（4）取1 L第二抗體，用TNT緩沖液稀釋至8

31、mL。（5）膜置NTN液中，加入稀釋好的二抗，37輕輕搖動(dòng)1 h。6酶顯色反應(yīng)（1）將硝酸纖維膜用TNT緩沖液洗三次，每次510 min。（2）將膜放入NBT/BCIP顯色液中，晃動(dòng)染色至條帶顯現(xiàn)清楚為止。（3）將膜置蒸餾水中漂洗，取出晾干。（4）照相。注意：在進(jìn)行Western-blotting檢測時(shí)，若出現(xiàn)單一條帶的強(qiáng)信號是最好的結(jié)果，若出現(xiàn)二條以上的帶，可能有兩種原因：若這些帶彼此靠得很近，則可能是由于切取抗原時(shí)切取了兩條以上的帶。若除一條強(qiáng)信號帶外，遠(yuǎn)離此帶還有一條信號較弱的帶，這往往是由于免疫交叉反應(yīng)引起。若產(chǎn)生交叉反應(yīng)的帶較弱（這是通常出現(xiàn)的情況），則可以通過調(diào)整用于雜交反應(yīng)的抗血

32、清濃度以除去這反應(yīng)。必須摸索抗血清的適當(dāng)濃度使它能與目的抗原反應(yīng)而交叉反應(yīng)降低到無法檢測的水平，這對以后篩選基因以及基因功能的研究非常重要。若出現(xiàn)第一種情況，抗血清就不能使用了。六、作業(yè)與思考題試述Western印跡分析的原理和用途。在進(jìn)行Western-blotting檢測時(shí)，若雜交出二條帶，可能是什么原因引起？在進(jìn)行Western-blotting檢測時(shí)應(yīng)如何調(diào)整抗血清的濃度？實(shí)驗(yàn)二 Western雜交分析（II）一、原理和用途W(wǎng)estern雜交又叫蛋白印跡試驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)原理與前面所述相同，即是將SDS的高分離能力與抗原抗體反應(yīng)特異性相結(jié)合的一種蛋白質(zhì)分析方法，主要用于蛋白多肽及其分子量的測

33、定和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后加工修飾（如糖基化）的分析。該方法不僅具有很高的分辨能力，而且具有很強(qiáng)的特異性和敏感性，但操作過程較為復(fù)雜，技術(shù)要求也較高。Western雜交的操作步驟也與Southern雜交或Northern雜交相似，所不同的是分析對象為蛋白質(zhì)而不是核酸，分離膠多為聚丙烯酰胺凝膠，所用探針為特異性抗體，轉(zhuǎn)印膜一般為硝酸纖維素膜。由于SDS分離后的蛋白質(zhì)為變性蛋白，所以應(yīng)選用針對線性抗原決定簇的抗體。電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移也有多種方法。濕轉(zhuǎn)印法是將濾紙和專用海綿包裹后的凝膠和硝酸纖維素膜置于盛有轉(zhuǎn)移緩沖液的電泳槽中，凝膠面對著陰極，硝酸纖維素膜對著陽性，利用較大電流使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素

34、膜上。該方法不僅需要較多的轉(zhuǎn)移緩沖液，而且轉(zhuǎn)移所需要的時(shí)間較長。本實(shí)驗(yàn)以動(dòng)物提取的蛋白為材料，練習(xí)的是目前最常使用、操作簡單、經(jīng)濟(jì)快捷的半干轉(zhuǎn)移法。二、實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物蛋白提取液。三、溶液與緩沖液轉(zhuǎn)移緩沖液25 mmol/L Tris192 mmol/L 甘氨酸20 甲醇pH 8.3(現(xiàn)用現(xiàn)配)考馬氏亮藍(lán)染色液：90 mL 乙醇90 mL H2O10 mL 乙酸0.25 g 考馬斯亮藍(lán)R-250PBS緩沖液（10PBS）：0.2 mol/L K2HPO40.2 mol/L KH2PO45 mol/L NaCpH 7.45，用時(shí)稀釋10倍使用。10%小牛血清/PBS5封閉液：PBS3%牛血清白蛋白6

35、洗滌液：PBS1% Tween-207抗體稀釋液8鼠源特異性抗體9抗鼠IgG的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體10DAB顯色液：四、儀器設(shè)備及耗材硝酸纖維素膜，厚濾紙，半干轉(zhuǎn)移槽，轉(zhuǎn)移用電泳儀，水平旋轉(zhuǎn)臺。五、實(shí)驗(yàn)方法將SDS后的凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡2060 min。剪取與凝膠同樣大小的一張硝酸纖維素膜和兩張厚濾紙，并將其在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕。將厚濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、厚濾紙依次疊放在半干轉(zhuǎn)移槽的陰極板上，并用玻璃棒趕去每層之間的氣泡，蓋好陽極板。根據(jù)凝膠大小和厚度或儀器說明書設(shè)定電壓和轉(zhuǎn)移時(shí)間，小膠一般為1015 V 3015 min，大膠一般為1525 V 3060 min。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將硝酸纖

36、維素膜轉(zhuǎn)移到裝有10%小牛血清/PBS的塑料盒中，4封閉過夜或37封閉2 h。凝膠可用考馬氏亮藍(lán)染色液染色，以便檢查蛋白質(zhì)是否轉(zhuǎn)移完全。吸棄塑料盒中的封閉液，加入適當(dāng)稀釋的特異抗體，用量以完全覆蓋硝酸纖維素膜為度，室溫孵育1 h。在室溫下和水平轉(zhuǎn)臺上，用大量的洗滌液將硝酸纖維素膜洗滌6次，每次5 min。吸去洗滌液，加入適當(dāng)稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG，用量以完全覆蓋硝酸纖維素膜為度，室溫孵育1 h。再次洗滌硝酸纖維素膜（同步驟7）。洗滌結(jié)束后，吸去洗滌液，加入DAB顯色液，在室溫和避光條件下顯色至出現(xiàn)清晰條帶為止，所需時(shí)間由信號強(qiáng)弱確定，一般在530 h之間。顯色結(jié)束后，用去離子水漂

37、洗硝酸纖維素膜，終止顯色反應(yīng)。顯色后的硝酸纖維素膜可立即進(jìn)行拍照，或晾干后在塑料袋中保存。六、作業(yè)與思考題1試比較Western雜交與核酸雜交的異同點(diǎn)。2試分析影響雜交信號強(qiáng)弱和特異性的主要因素。實(shí)驗(yàn)三 mRNA的體外翻譯一、原理和用途從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取的或通過克隆化DNA在體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，在無細(xì)胞提取液中能被翻譯合成蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可用于免疫沉淀試驗(yàn)或進(jìn)行生物學(xué)活性測定。現(xiàn)在商品化翻譯藥盒已經(jīng)有廠家出售。合成mRNA在麥胚提取物、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物以及被注射的蛙卵母細(xì)胞中都能有效地翻譯成蛋白質(zhì)。為了合成足夠量的mRNA用于體外翻譯，需要做到以下幾點(diǎn)：(1)將編碼mRNA的雙鏈DNA

38、按適當(dāng)?shù)姆较蚩寺∮趲в惺删w啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體中；(2)利用切點(diǎn)位于模板序列下游的限制酶使重組質(zhì)粒線狀化；(3)對模板序列進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，所用聚合酶是由噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶，它可以特異性識別克隆在質(zhì)粒上的啟動(dòng)子。合成mRNA的5和3末端的結(jié)構(gòu)可影響其穩(wěn)定性及翻譯效率。所有天然真核細(xì)胞mRNA和許多病毒mRNA的5末端都含有一個(gè)7一甲基鳥苷殘基，它以三磷酸根為橋聯(lián)結(jié)于mRNA本體。此外，mRNA的第一個(gè)(有時(shí)還有第二個(gè))核苷酸是甲基化的。mRNA 5端的這種加帽結(jié)構(gòu)可提高麥胚提取物系統(tǒng)的蛋白質(zhì)合成量，并可改善天然mRNA和注射進(jìn)入活細(xì)胞中的mRNA的穩(wěn)定性。加帽mRNA可以通過在轉(zhuǎn)

39、錄反應(yīng)中加入帽結(jié)構(gòu)的類似物(例如GpppG或它的甲基化衍生生物)而在體外得以合成。如果類似物的摩爾數(shù)超過rGTP，則可以用它來起始由噬菌體啟動(dòng)子控制的RNA合成。然而，一旦RNA開始合成，帽結(jié)構(gòu)的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)(帶有兩個(gè)裸露的3，羥基)可確保用于加帽的核苷酸不再發(fā)生摻入。絕大多數(shù)真核細(xì)胞和病毒mRNA的3，末端有一poly(A)尾，但其作用仍不夠清楚。已表明這一poly(A)段可提高某些mRNA的穩(wěn)定性，但在另一些情況下卻又似乎無足輕重。研究得最為透徹的例子是，加Po1y(A)可以改善注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞的mRNA的長期穩(wěn)定性，但對短期(12天)實(shí)驗(yàn)中mRNA翻譯效果的影響卻微不足道。mRNA

40、3末端的結(jié)構(gòu)通常是由使模板線狀化時(shí)所用的限制酶所決定的，但是用于mRNA體外合成的許多模板來自cDNA，在近3末端帶有poly（dA：dT）段,這樣的poly(A)仍然可以使合成mRNA得以穩(wěn)定。二、實(shí)驗(yàn)材料兔子，克隆或提取的DNA。三、溶液與緩沖液1. 適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶2. 酚:氯仿：把酚和氯仿等體積混合后用0.1 mol/L TrisHCl (pH 7.6)抽提幾次以平衡這種混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0.01 mol/L TrisHCl (pH 7.6)液層，保存于4。注意：酚腐蝕性極強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套及防護(hù)鏡，穿防護(hù)服。所有操作均應(yīng)在化學(xué)通風(fēng)櫥中進(jìn)行。與

41、酚接觸過的皮膚部位應(yīng)用大量的水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。100%乙醇，70乙醇5 mol/L 乙酸氨瓊脂糖無RNA酶的TE，pH 7.610 mmol/L TrisHCl，pH 7.61 mmol/L EDTA， pH 8.010蛋白酶K緩沖液500 mmol/L NaCl50 mmol/L EDTA， pH 8.0100 mmol/L TrisHCl，pH 8.05% SDS蛋白酶K液：用水配成濃度為20 mg/mL的貯存液保存。100 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）2.5 mg/mL牛血清白蛋白5 mmol/L rATP、rUTP、rCTP，500 mol/L rGTP10轉(zhuǎn)錄

42、緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)加）400 mmol/L TrisHCl (當(dāng)溫度為37時(shí)，pH值為 7.5) 60 mmol/L MgCl220 mmol/L 鹽酸亞精胺50 mmol/L NaCI無DNA的RNA酶將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10 mmol/L TrisHCl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/mL的濃度，于100加熱15 min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于20。15帽類似物 (5 mmol/L GF，PPG或其甲基化衍生物) 。16由噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶17無RNA酶的DNA酶18無RNA酶的水191.2%乙酰苯肼溶液：（用1 mo

43、l/L HEPES(pH 7.0)中和至pH 7.5）20. 血液收集溶液：140mmol/L NaCl1.5mmol/L 乙酸鎂5.0mmol/L KCl0.001% 肝素21100 mmol/L CaCl222200 mmol/L EGTA (pH 7.0)23 小球菌核酸酶：150 000U/mL，保存于50 mmol/L 甘氨酸（pH 9.2）、5 mmol/L CaCl2溶液中。24I型磷酸激酸激酶：40 mg/mL，保存于50甘油中。25氯高鐵紅血素儲存液：5 mg/mL，溶于乙二醇，可按下法制備：（1）在400 L 0.2 mol/L KOH中溶解30 mg氯高鐵紅血素(分子量為

44、625D)，少量分次緩慢添加，各次之間應(yīng)予振蕩。注意：取用KOH溶液時(shí)務(wù)必小心，應(yīng)戴手套和面具。（2）加入水600 L，1 mol/L TrisHCl (pH 7.8) 100 L。如有必要，加入0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至7.8。（3）加入4.8 mL乙二醇，振蕩混合。（4）于4，5000 g離心5 min，去除不溶性沉淀。（5）用10 mmol/L KCN 1100稀釋氯高鐵紅血素，測定500 nm波長下的吸光度，推算其濃度（1 mmol/L氯高鐵紅血素溶液吸光值為11.1）。以41的乙二醇水溶液將氯高鐵紅血素的濃度調(diào)節(jié)為5 mg/mL。26翻譯反應(yīng)混合液：100 mmol/L

45、亞精胺 200 L800 mmol/L 磷酸肌酸 400 L5 mmol/L 氨基酸(不含甲硫氨酸) 200 L1 mol/L 二硫蘇糖醇（DTT） 80 L500 mmol/L HEPES (pH 7.4) 1600 L水 720 L分裝為50100 L小份，貯存于-70或液氮中。5 mmol/L氨基酸(不含甲硫氨酸)是含有除甲硫氨酸外所有氨基酸的溶液，濃度為5 mmol/L。以35S甲硫氨酸對體外合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行放射性標(biāo)記時(shí)使用這一溶液；如果以其他放射性標(biāo)記氨基酸來標(biāo)記蛋白質(zhì)，則要使用相應(yīng)的非標(biāo)記氨基酸混合液。2710三氯乙酸28胰核糖核酸酶（100 g/mL溶于50 mmol/L EDT

46、A (pH 8.0)中）。292SDS凝膠加樣緩沖液100 mmol/L TrisHCl (pH 6.8)200 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）4% 十二烷基磺酸鈉（SDS (電泳級)）0.2 溴酚藍(lán)20 甘油不含二硫蘇糖醇的2SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，應(yīng)用時(shí)取1 mol/L二硫蘇糖醇貯存液，現(xiàn)用現(xiàn)加于上述緩沖液中。301mol/L二硫蘇糖醇貯存液：0.01mol/L 乙酸鈉（pH 5.2） 20 mLDTT 3.09 g過濾除菌后分裝成1mL小份貯存于20。四、儀器設(shè)備及耗材電泳儀，水平電泳槽，水浴搖床，化學(xué)通風(fēng)櫥，微量加樣槍，試管，容量瓶，高速低溫離心機(jī)，冰箱，超低溫冰箱，液氮

47、罐，吸頭，超凈工作臺。注射器，刀片，干酪包布，紫外分光光度計(jì)。五、實(shí)驗(yàn)方法1 模板DNA的純化（1）用一種適當(dāng)?shù)南拗泼高M(jìn)行消化，制備2 pmol 的模板DNA。用瓊脂糖凝膠電泳分析已消化的小量DNA樣品(100 ng)。如有必要，可增加限制酶用量并繼續(xù)溫育直至DNA消化完全。（2）如有必要，可用T4噬菌體DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I Klecnow片段在4種dNTP存在下消除3突出端。（3）通過酚：氯仿抽提及乙醇沉淀來純化DNA模板。用無RNA酶的TE (pH 7.6)重新溶解DNA，使其濃度為1 g/L。注意：經(jīng)RNA酶處理的小量制備DNA樣品 (由于其中的模板DNA受到RNA酶污染

48、)，此時(shí)可按下列方法對DNA進(jìn)行純化： 加入0.1倍體積的10蛋白酶K緩沖液； 加入0.1倍體積的5%SDS； 加入蛋白酶K至終濃度為100 g/mL，于37溫育1 h； 用酚：氯法抽提，并用乙醇沉淀以純化DNA； 用無RNA酶的TE (pH 7.6)重新溶解DNA，使其濃度為1 g/L。2 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄（1）于室溫依次混合以下各成分： 模板DNA (體積不超過5 L) 15 g100 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT) 5.0 L牛血清白蛋白(2.5 mg/mL) 2.5 L5 mmol/L rATP、rUTP、rCTP各 2.5 L500 mol/L rGTP 2.5 L帽類似物(5

49、mmol/L GF，PPG或其甲基化衍生物) 5.0 L10轉(zhuǎn)錄緩沖液 5.0 L胎盤RNA酶抑制劑(10 U/mL) 2.5 L由噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶(1015 U/L) 3.0 L酌情加入10 Ci的32PrGTP (比活度400 Ci/mmol)加無RNA酶的水至 50 L（2）輕敲管外壁使內(nèi)容物混合，盡力避免產(chǎn)生氣泡(有時(shí)不容易做到這一點(diǎn)，因?yàn)橛墒删w編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶商品中含有去污劑作為穩(wěn)定劑)。如有必要可略加離心以消除氣泡。（3）于37溫育1 h (T3和T7噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶)。（4）溫育1 h后，再追加聚合酶1次(3040 U)繼續(xù)

50、溫育1 h，這樣通?？商岣逺NA的獲得率。（5）加入1 L無RNA酶的DNA酶(1 mg/mL)，混勻后于37將反應(yīng)混合液溫育15 min。（6）加入100 L無RNA酶的水，用酚：氯仿抽提以純化RNA產(chǎn)物。（7）把水相轉(zhuǎn)移到另一管中，加入20 L 5 mol/L乙酸銨溶液，混勻后加入250 L乙醇，于-20放置30 min，然后用微量離心機(jī)于4，12000 g 離心10 min，收集RNA沉淀物，重新溶解于100 L無RNA酶的水中，再以酚：氯仿抽提。（8）把水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)管中，加入20 L 5 mol/L乙酸銨溶液，混勻后加入250 L100%乙醇。在-20放置30 min，然后于4，1

51、2000g離心10 min。小心地盡可能吸凈乙醇液，然后敞開管蓋放在實(shí)驗(yàn)桌上自然蒸發(fā)以去除肉眼可見的殘液，加入適量的70乙醇，保存于-70。（9） 需用RNA時(shí)，取出少量溶于乙醇的RNA溶液，加入0.1體積的5 mol/L乙酸銨，混勻后置于-20至少15 min，用微量離心機(jī)于4，12000g離心10 min，棄去乙醇液，氣干后，用無RNA酶的水溶解RNA至濃度估計(jì)為2 g/L。并用紫外分光光度計(jì)測定濃度。（每1 g的模板DNA通?？珊铣?10 g的RNA）。（10）應(yīng)通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳，用已知分子量的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)參照物檢查所合成RNA的大小。3兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液的制備（

52、1）為獲得貧血家兔的血液，挑選體重23 kg的家兔6只，根據(jù)以下的程序皮下注射乙酰苯肼溶液。第一天注射 2.0 mL第二天注射 1.6 mL第三天注射 1.2 mL第四天注射 1.6 mL第五天注射 2.0 mL(2) 在第7和第8天按以下方法采血：先用酒精棉球擦拭家兔耳朵，然后用一新刀片在耳長中段的耳中靜脈做一切口。每只家兔可采集50 mL血液，收集于經(jīng)冷卻的50 mL血液收集溶液中。在第七和第八天取血應(yīng)謹(jǐn)慎而不要過于貪婪，到第九天可用戊巴比妥或芬太尼（fentanyl）麻醉動(dòng)物后作心臟穿刺放血，約可采集150 mL血液，收集于100 mL上述鹽溶液中。（3）用干酪包布過濾血液，然后于4以2

53、000 g離心5 min，吸出淡黃色的白細(xì)胞表層(淡黃色表層是由密度不均一白細(xì)胞形成的寬沉積帶)，用上述鹽溶液(不含肝素)洗滌沉積的網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞3次，最后一次離心應(yīng)以5000 g進(jìn)行。（4）測量沉積細(xì)胞的體積，與等體積的預(yù)冷滅菌雙蒸水混合，于0進(jìn)行裂解，1 min后再于4以20000 g將裂解液離心20 min。（5）在100份的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中加入1份氯高鐵血紅素和2份CaCl2溶液，混勻。（6）加入0.05份小球菌核酸酶(150000 U/mL)，混合后于20溫育15 min，然后置冰水浴中冷卻。（7）加入1份200 mmol/L的EGTA (pH 7.0)并混勻。（8）加入0.4份磷酸肌酸激酶(40 mg/mL)并混勻，把經(jīng)過處理的細(xì)胞裂解液分裝為250500 L/份，保存于-70或液氮中。注意：1上述處理過程破壞了內(nèi)源性的mRNA，因此，網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液的翻譯活性完全取決于所加入的外源mRNA。小球菌核酸酶只在鈣離子存在時(shí)有活性，加入EGTA后其消化反應(yīng)則終止。EGTA或滅活小球菌核酸酶的存在并不影響隨后的翻譯反應(yīng)。2在網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中應(yīng)含有氯高鐵血紅素，它是一種起始因子eIF-