分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)ppt課件

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn).目 錄實(shí)驗(yàn)一、植物染色體DNA的提取及純度鑒定實(shí)驗(yàn)二、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)三、瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)四、的限制性酶切實(shí)驗(yàn)五、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及外源DNA的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)六、PCR基因擴(kuò)增技術(shù).實(shí)驗(yàn)一、植物染色體DNA的提取 及純度鑒定.一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆照婧酥参锘蚪M染色體DNA的一種提取方法學(xué)習(xí)運(yùn)用紫外分光光度法鑒定DNA的純度，估計(jì)相對含量。.二、實(shí)驗(yàn)原理用低溫機(jī)械研磨和高濃度、SDS等破壞細(xì)胞壁及膜，使蛋白變性使DNA與蛋白分別，用一定濃度的溶液將DNA提取出來，用高濃度乙醇沉淀DNA，氯仿/異戊醇等去除雜質(zhì)，RN ase降解核酸，得到純度較高的DNA樣品。根據(jù)核酸與

2、蛋白質(zhì)分別在OD260和OD280有吸收峰分別測定之，比較OD260/OD280比值在1.8附近程度估計(jì)純度，根據(jù)閱歷公式計(jì)算DNA含量。.三、實(shí)驗(yàn)資料與試劑物品1.資料香椿Toona sinensis黃花苗.2、試劑提取緩沖液預(yù)冷SSCRNase液.3、儀器設(shè)備高速冷凍離心機(jī)8-316制冰機(jī)8-312紫外可見分光計(jì)8-316冰箱-86度在8-312，-20度，4度在8-312水浴鍋電子天平玻璃儀器等.四、實(shí)驗(yàn)操作流程采摘芽苗，洗凈剪小段，擦干外表水分放-86度冰箱凍30分鐘以上冰浴研磨勻漿分次加提取液以下見講義.五、結(jié)果與處置純度含量.思索題：影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的要素有哪些，要得到高純度的DNA

3、需求在實(shí)驗(yàn)中留意哪些問題？.實(shí)驗(yàn)二、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取.目的與要求 經(jīng)過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測定，學(xué)慣用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，了解用分光光度計(jì)測定DNA含量的方法。.2. 相關(guān)知識及原理質(zhì)粒(Plasmid) ：獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子。存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。.DNA超螺旋構(gòu)造.常用的質(zhì)粒載體是經(jīng)過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的。pUC18, pUC19(500700.細(xì)菌質(zhì)粒: 細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從1Kb-200Kb，它們復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制本身基因組DNA

4、的同一組酶系。 .嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)厲控制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個(gè)細(xì)胞中只需一份或幾份拷貝；松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有10-200份拷貝，假設(shè)用一定的藥物處置抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處置才干到達(dá)更高拷貝數(shù)。質(zhì)粒類型：.載體(Vector)：用于攜帶重組DNA，并且可以使外源DNA一同復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒(運(yùn)載工具)。具備的條件：易于鑒定；在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制；易于挑選；易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。.InsertEcoRIXhoI1.9kb.抗性

5、基因Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)啟始復(fù)制子ori, Origin of replication)；多克隆位點(diǎn)(MSC, Multiple cloning site or polylinker)；標(biāo)志基因(Marker gene, such as LacZ gene)。載體的構(gòu)造：.Ampr抗性基因Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶-內(nèi)酰胺酶可特異地切割A(yù)mp的-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌才干.二、實(shí)驗(yàn)原理 堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染

6、色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差別來分別它們，在堿性PH，DNA變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎一切純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對較小和共價(jià)閉合環(huán)狀這兩個(gè)特性。由于操作緣由提取的質(zhì)?？捎腥N構(gòu)造：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。 .DNA 是具有一定構(gòu)造的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性。.SDS是一種陰離子外表活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白量變性，所以SDS處置細(xì)菌細(xì)胞后

7、，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來。釋放出來的DNA遇到強(qiáng)堿性NaOH環(huán)境，就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性，而基因組DNA，由于分子宏大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA那么與細(xì)胞碎片一同沉淀到離心管的底部。經(jīng)過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來。.細(xì)菌裂解的方法： 堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,普通用于質(zhì)粒大量提取。.提純的思緒質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質(zhì)：蛋白基因組DNA脂類及小分

8、子雜質(zhì)RNA .測定DNA濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計(jì)法測定DNA的紫外光吸收值；第二種方法是測定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光的強(qiáng)度來計(jì)算核酸的含量。另外還有一種用于粗略檢測DNA濃度的方法是經(jīng)過凝膠電泳，與規(guī)范分子量相比較。DNA濃度的測定：.紫外光吸收法：由于組成核酸的堿基(G,A,T,C在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以經(jīng)過測定260nm的吸收峰即可對DNA進(jìn)展定量。但有時(shí)也會(huì)由于所處溶液的pH值不同而導(dǎo)致吸光系數(shù)的不同。因此，普通在中性pH值左右的環(huán)境中進(jìn)展測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。.3. 資料與試劑資料:含有質(zhì)粒大腸桿菌JM83+。.三、實(shí)驗(yàn)儀器、資料與試劑 一儀器：

9、恒溫培育箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋二資料：含有質(zhì)粒的大腸桿菌JM83+、LB液體培育基三試劑： 溶液I作用：分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II作用：細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白量變性。溶液III作用：酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白SDS線性DNA沉淀，K可中和DNA.溶液1GET緩沖液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液3乙酸鉀溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2OTE緩沖液或水+ 20g/

10、ml RNase : 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70乙醇.平衡酚：氯仿：異戊醇25：24：1作用：氯仿可使蛋白量變性并有助于液相與有機(jī)相的分別。平衡酚pH7.8酸性下DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大，可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫注：用時(shí)取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引起灼傷。無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA.四、實(shí)驗(yàn)步驟接含質(zhì)粒的單菌落于3ml LB Amp+液體培育基中370C，190rpm振蕩培育過夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、離心2min，棄

11、上清，搜集菌體100uL溶液I懸浮菌體充分振蕩，室溫或冰浴10min參與200uL溶液II悄然混勻，冰上靜置5min裂解菌體.參與150uL溶液III悄然混勻，冰上靜置15min質(zhì)粒DNA復(fù)性12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加等體積的酚：氯仿：異戊醇振蕩混勻12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管可省略上清加等體積的氯仿：異戊醇振蕩混勻12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加2倍體積的無水乙醇充分混勻，冰浴 30min.12000rpm，離心15min沉淀用75%乙醇1mL洗滌兩次振蕩混勻、離心12000rpm，離心10min沉

12、淀超凈臺(tái)中風(fēng)干沉淀用20uL RTE溶解，-200C保管.留意： 用移液器操作時(shí)，每一步都要格外小心，特別是在參與溶液II 和III后，一定不要猛烈振蕩，以免切碎DNA(包括質(zhì)粒DNA和基因組DNA)！.培育細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗生素的液體培育基，37培育1216小時(shí);取液體培育液1.5-2ml于Eppendorf管中，10000r/min離心1min，去掉上清液，參與100l溶液1(GET) ，充分混勻放置3-5分鐘;參與200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS變性液，加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上放置5min;質(zhì)粒小量提取的方法手工提?。?參與

13、150 l乙酸鉀溶液(溶液II)，加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置5min;用冷凍高速離心機(jī)，10000r/min離心7min，上清移入另一干凈離心管，并加1ml 100乙醇混勻，12000r/min離心5min，棄去上清液;沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次， 12000r/min離心5min，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然枯燥;參與30-50l含有20g/ml RNase的滅菌蒸餾水或TE 緩沖液溶解提取物，室溫放置15-30min，使DNA充分溶解(有時(shí)需求酚:氯仿抽提);將分別出的質(zhì)粒DNA置于-20保管備用。.B. 用分光光度計(jì)法定量DNA取2l提取的質(zhì)粒DNA，

14、參與98l蒸餾水對待測DNA樣品做1:50(或更高倍數(shù)的稀釋);蒸餾水作為空白,在波長260nm、280nm處調(diào)理紫外分光光度計(jì)讀數(shù)至零。.參與DNA稀釋液，測定260nm 及280nm的吸收值。260nm 讀數(shù)用于計(jì)算樣品中核酸的濃度，OD260值為1相當(dāng)于約50g /ml雙鏈DNA，33g /ml單鏈?？筛鶕?jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)的比值OD260/OD280估計(jì)核酸的純度。普通DNA的純品，其比值為1.8，低于此值闡明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染。.記錄OD值，經(jīng)過計(jì)算確定DNA濃度或純度，公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數(shù)以上濃度單位為g /ml.實(shí)驗(yàn)三、瓊脂糖

15、凝膠電泳.一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕?jīng)過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。.二、實(shí)驗(yàn)原理 DNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。核酸為兩性分子，在PH3.5時(shí)，整個(gè)分子帶正電； PH8左右時(shí)，堿基幾乎不解離，整個(gè)分子帶負(fù)電。 在堿性環(huán)境下，一樣堿基數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈負(fù)電荷，能以同樣的速度向正極方向挪動(dòng)。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)展分別。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小?？梢苑謩e相對分子質(zhì)量一樣，但構(gòu)型不同的DNA分子。共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNAcccDNA直線DNALDNA，2條鏈發(fā)生斷裂開環(huán)的雙鏈

16、環(huán)狀DNAocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂。 .三、儀器、資料與試劑 一 儀器二資料1.自已提取的質(zhì)粒DNA2.相對分子質(zhì)量規(guī)范品三試劑 15 TBE儲(chǔ)液(PH8.0)運(yùn)用時(shí)稀釋 10倍成0.5TBE 1TBE也可。 2凝膠加樣緩沖液0.2%溴酚藍(lán)，50%蔗糖 3. 瓊脂糖 4.10mg/ml溴化乙錠溶液EB，4保管。用時(shí)稀釋成5ug/ml的EB。 .四、實(shí)驗(yàn)操作步驟 瓊脂糖凝膠的制備配制濃度按照所提質(zhì)粒的大小來確定.凝膠板的制備 加樣加樣體積在1030ul電泳 染色結(jié)果察看 .C. 凝膠電泳檢測DNA的濃度0.8%的瓊脂糖凝膠，100V,40分鐘。NEB 規(guī)范分子量片段(1kb DNA Ladde

17、r).1 kb DNA Ladder雖然不能對DNA質(zhì)量進(jìn)展準(zhǔn)確定量分析，但可以經(jīng)過與相近的條帶進(jìn)展比較估算出大約的數(shù)據(jù)。每條帶大約的量如下按0.5g上樣量計(jì)。應(yīng)按13條帶計(jì)算，由于3kb的量是其它片段量的近三倍： 片段堿基對質(zhì)量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*0.5kb 的條帶由500bp和517bp組成，這樣即使在低分子量區(qū)域條帶的強(qiáng)度也比較均一。 .相關(guān)知識電泳：泳動(dòng)速度決

18、議于？ 瓊脂糖凝膠天然瓊脂Agar是一種多聚糖，主要由瓊脂糖Agarose ，約占80及瓊脂膠Agaropectin組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲景象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分別效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)展平板電泳。 .核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系瓊脂糖濃度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0線狀DNA大小/kb 5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3.核酸構(gòu)型與瓊脂

19、糖凝膠電泳分別的關(guān)系 不同構(gòu)型DNA的挪動(dòng)速度次序?yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)超螺旋DNAcccDNA直線DNALDNA，2條鏈發(fā)生斷裂開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNAocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂。 .影響遷移率的要素DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓 普通5V/cm、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成。.常用染料EB:溴化乙錠 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴鹽EthidiumBromide，EB，EB能插入DNA分子堿基對之間，導(dǎo)致EB與DNA結(jié)合。DNA吸收的260nm的紫外光傳送給EB，或者結(jié)合的EB本身在300和360吸收的射線，均可在可見光區(qū)以590波長發(fā)射出來，呈橙紅色

20、。EB染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡便，快速，室溫下15-20min；不會(huì)使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出；可以加到樣品中可膠中。EB是誘變劑，運(yùn)用時(shí)一定要戴手套。 EB廢液要經(jīng)過處置才干丟棄。SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，參與樣 品中，價(jià)錢較昂貴。.五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論根據(jù)察看結(jié)果，繪圖。分析自提質(zhì)粒的情況。 .實(shí)驗(yàn)四、的限制性酶切 .一實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘昂怂嵯拗菩詢?nèi)切酶是一類能識別雙鏈中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等動(dòng)物的免疫系統(tǒng)， 用于抗擊外來的侵襲。限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生的片段端為，端為。.限制酶的類型根

21、據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及能否具有修飾酶活性可分為、型三大類。類和類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴ATP的限制性內(nèi)切酶活性。 類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識別位點(diǎn)，且沒有特定的切割位點(diǎn)，酶對其識別位點(diǎn)進(jìn)展隨機(jī)切割，很難構(gòu)成穩(wěn)定的特異性切割末端。類限制性內(nèi)切酶在識別位點(diǎn)上切割，然后從底物上解離下來。故類和類酶在基因工程中根本不用。.型酶型酶就是通常指的限制性內(nèi)切酶. 它們能識別雙鏈的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)展切割，產(chǎn)生特異的片段； 型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反響的輔助因子，識別順序普通為個(gè)堿基對的反轉(zhuǎn)反復(fù)順序； 型內(nèi)切酶切割雙鏈產(chǎn)生種不同的切口端突出；端突出

22、和平末端。 正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)進(jìn)展改造，從而極大地推進(jìn)了分子生物學(xué)的興隆和開展。.酶切反響中應(yīng)留意以下幾個(gè)問題：內(nèi)切酶：不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染； 留意內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)及構(gòu)成的粘性末端；內(nèi)切酶的用量 根據(jù)內(nèi)切酶單位和用量而定，通常 1u指在適當(dāng)條件下，1小時(shí)內(nèi)完全酶解ug特定底物所需求的限制性內(nèi)切酶量，運(yùn)用中普通以ug DNA對u酶短時(shí)間為宜。同時(shí)內(nèi)切酶體積不能超越反響體系，因內(nèi)切酶中含甘油，體系中甘油超越會(huì)抑制內(nèi)切酶活力；運(yùn)用時(shí)防止操作中對內(nèi)切酶的污染。.：作為內(nèi)切酶底物，應(yīng)該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、

23、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高鹽濃度、酒精等，這些要素的存在均不同程度影響限制性內(nèi)切酶的活力。這種抑制可經(jīng)過：添加酶作用單位數(shù)1020U/ug DNA、增大反響體積以稀釋能夠的抑制劑或延伸反響時(shí)間加以抑制。.反響緩沖液：反響緩沖液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+組成，其中Mg2+為內(nèi)切酶輔基；TrisHCl維持反響體系pH值在7.2-7.6之間；NaCl濃度不同構(gòu)成種級別的離子強(qiáng)度：低鹽10mM NaCl)中鹽50mM NaCl高鹽100mM NaCl 不同的內(nèi)切酶選擇特定的反響緩沖液。.酶解溫度與時(shí)間：大多數(shù)限制酶反響溫度為，如EcoR, Hind, BamH, Pst等，也有如B

24、cl需在下進(jìn)展反響，反響時(shí)間根據(jù)酶的單位與用量之比來定，原那么是酶：=：小時(shí)即可，充分酶解。.二、實(shí)驗(yàn)試劑限制性內(nèi)切酶和質(zhì)粒buffer:50mM Tris HCl pH7.5100mM NaCl10mM MgCl2無菌水.三實(shí)驗(yàn)方法按下表分別參與各試劑留意限制性內(nèi)切酶最后參與且在冰上操作于Eppendorf管中。DNA 10buffer 2l無菌水 20l內(nèi)切酶 2總體積： 25l. 將反響體系充分混勻，并于臺(tái)式離心機(jī)上短暫離心。Eppendorf管封上封口膜于水管中反響1小時(shí)。反響終了后參與4l的10XLoading buffer以終止反響?；靹蚝?.8瓊脂糖凝膠上60伏電泳小時(shí)。紫外透射

25、儀上檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果。.四結(jié)果與分析記錄紫外透射儀上察看到的結(jié)果。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的成因。問題與討論：在整個(gè)酶切反響過程中應(yīng)留意哪些問題？如何選擇和限制性內(nèi)切酶的用量？反響體系中為何內(nèi)切酶用量不能超越整個(gè)反響體系的？.實(shí)驗(yàn)五、 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 及外源DNA的轉(zhuǎn)化.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研討中的意義。2.學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法。3.學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞并挑選轉(zhuǎn)化體的方法。 .實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化( Transformation )是將異源 DNA 分子引入另一細(xì)胞品系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研討

26、的根本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 .轉(zhuǎn)化中的受體細(xì)胞 轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞普通是限制性修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，常用 RM 符號表示。 .轉(zhuǎn)化方法：電擊法、 CaCl2、 RuCl等化學(xué)試劑法感受態(tài)細(xì)胞處置后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能允許外源 DNA 分子經(jīng)過時(shí)細(xì)胞的形狀。轉(zhuǎn)化細(xì)胞(轉(zhuǎn)化子)：帶有異源 DNA 分子的受體細(xì)胞( Transformant )。 實(shí)驗(yàn)原理.實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)以 E.coli JM83- 菌株為受體細(xì)胞，用 CaCl2 處置受體菌使其處于為感受態(tài)，然后與 質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。 因質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，因此使接受了該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨

27、芐青霉的特性，用 Apr符號表示。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞經(jīng)過順應(yīng)稀釋，在含氨芐青霉素的平板培育基上培育，只需轉(zhuǎn)化體才干存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞那么因無抵抗氨芐青霉素的才干而死亡。 .抗Amp宿主細(xì)菌含Amp培育基.影響轉(zhuǎn)化率的要素 細(xì)胞生長形狀和密度。 轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量和濃度。 試劑的質(zhì)量。 防止雜菌和其它外源 DNA 的污染。 .實(shí)驗(yàn)儀器 .實(shí)驗(yàn)試劑 大腸桿菌JM83- LB培育基， 0.1mol/LCaCl2溶液預(yù)冷 氨芐青霉素 JM83+質(zhì)粒 .實(shí)驗(yàn)步驟 菌株活化 感受態(tài)細(xì)胞制備 外源DNA的轉(zhuǎn)化.實(shí)驗(yàn)步驟 菌株活化1用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌JM83-，在LB培育基平

28、板外表劃線，于37培育16小時(shí)2挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到35mlLB培育基中，于37培育35小時(shí)3將培育液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培育基中培育23小時(shí)，到OD6000.30.4.實(shí)驗(yàn)步驟 感受態(tài)細(xì)胞制備4將培育液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，在冰上放置1530min54000rpm離心5min,棄上清6參與0.8ml預(yù)冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀，冰上預(yù)冷10min74000rpm離心5 min,棄上清8參與0.2ml預(yù)冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀，即可運(yùn)用。也可參與總體積15的甘油 在70長期保管.實(shí)驗(yàn)步驟 轉(zhuǎn)化9、取目的DNA參與大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，于冰上放置30min1

29、0、于42水浴90S11、冰上放置2min12、參與800lLB液體培育基于37培育1小時(shí)13、將培育液均勻涂布在含Amp+的培育基平板上14、將平板放置于37恒溫培育箱中培育12-14個(gè)小時(shí)，然后察看結(jié)果.對照組 對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水替代DNA溶液,其它操作與上面一樣。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。 對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水替代DNA溶液,但涂板時(shí)只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。.轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)每個(gè)培育皿中的菌落數(shù)。 轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公

30、式如下： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)稀釋倍數(shù)轉(zhuǎn)化反響原液總體積涂板菌液體積 轉(zhuǎn)化頻率轉(zhuǎn)化子數(shù)每mg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化子總數(shù)質(zhì)粒DNA參與量(mg) 感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)對照組菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積涂板菌液體積 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率轉(zhuǎn)化子總數(shù)感受態(tài)細(xì)胞總數(shù) .實(shí)驗(yàn)結(jié)果.實(shí)驗(yàn)報(bào)告寫明實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)原理、儀器、資料與試劑詳細(xì)列出實(shí)驗(yàn)步驟；畫出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表示圖并做分析，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。.實(shí)驗(yàn)六 PCR基因擴(kuò)增技術(shù).實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕?jīng)過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反響的根本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。.實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒错?polymerase chain reaction,PCR)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。在待擴(kuò)增的DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火