多奈哌齊和美金剛與千金子活性P-糖蛋白調(diào)控劑聯(lián)用的藥代動

1、應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報 Chin J Appl Environ Biol Doi: 10.19675/ki.1006-687x.2021.01022收稿日期 Received: 2021-01-11 接受日期 Accepted: 2021-04-06國家自然科學(xué)基金項目（21672205）、中國科學(xué)西部之光基金項目（2017XBZG_XBQNXZ_A1_006）、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性生物資源服務(wù)網(wǎng)絡(luò)項目（ZSTH-002）資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (21672205), the Western Li

2、ght Foundation of Chinese Academy of Sciences (2017XBZG_XBQNXZ_A1_006) and the Project of Strategic Biological Resources Service Network Program of Chinese Academy of Sciences (ZSTH-002)*通訊作者 Corresponding author (E-mail: HYPERLINK mailto:jiaowei jiaowei, HYPERLINK mailto: )多奈哌齊和美金剛與千金子活性P-糖蛋白調(diào)控劑聯(lián)用的

3、藥代動力學(xué)陳泳潔1,2 李 攀1,2 向 玲2,3 楊春梅2,3 張 帆1* 焦 威2*1川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 南充 637800 2中國科學(xué)院成都生物研究所天然產(chǎn)物研究中心 成都 610041 3中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049摘 要 利用UPLC-MS/MS方法，建立大鼠血漿中千金子活性P-糖蛋白調(diào)控劑(Euphorbia factor L2（1）和3,5-dibenzoyl-15-hydroxylathyrol（2）)作用下多奈哌齊和美金剛的檢測方法，進而考察兩種P-糖蛋白調(diào)控劑對阿爾茲海默癥藥物的藥代動力學(xué)影響。采用Agilent C-18（50 mm 2.1 mm, 1.8 m），以乙

4、腈：水（5 mmol/L乙酸銨，0.2甲酸）= 70:30為流動相，流速為0.2 mL/min，金剛烷胺為內(nèi)標(biāo)定量。通過優(yōu)化制備條件，質(zhì)譜參數(shù)，色譜參數(shù)，建立UPLC-MS/MS檢測方法。將36只大鼠隨機分為6組，僅灌胃給藥多奈哌齊或美金剛組，先灌胃給藥多奈哌齊或美金剛聯(lián)合靜脈注射1或2組，采用UPLC-MS/MS方法檢測大鼠血藥濃度并計算藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，多奈哌齊和美金剛分別在范圍0.5-250 ng/mL，1.0-250 ng/mL中線性關(guān)系良好，方法學(xué)驗證結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)。藥代動力學(xué)研究表明：多奈哌齊和美金剛在大鼠體內(nèi)代謝受到P-糖蛋白調(diào)控劑影響?；衔?降低多奈哌齊的Cmax、Tm

5、ax、AUC(0-t)和t1/2的均值，升高CL/F，升高美金剛的Cmax、Tmax、AUC(0-t)和t1/2的均值，降低CL/F。化合物2使多奈哌齊和美金剛的Tmax均值和AUC(0-t)都升高，Cmax都降低。上述結(jié)果為以P-糖蛋白調(diào)控劑為主要二次代謝產(chǎn)物，特別是以Lathyrane型二萜類似物為主要成分的藥用植物與阿爾茨海默癥藥物相互作用的藥代動力學(xué)研究提供了參考和方法基礎(chǔ)。關(guān)鍵字 千金子；P-糖蛋白調(diào)控劑；多奈哌齊；美金剛；UPLC-MS/MS；藥代動力學(xué)The pharmacokinetic study of donepezil and memantine in combinati

6、on with the active P-glycoprotein modulator of Euphorbia lathyrisCHEN Yongjie1,2, LI Pan1,2, XIANG Ling2,3, YANG Chunmei2,3, ZHANG Fan1* & JIAO Wei2*1School of Pharmacy, Institute of Materia Medica, North Sichuan Medical College, Nanchong 637800, China2 Natural Products Research Centre, Chengdu Inst

7、itute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China3University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, ChinaAbstract This study aimed to established a UPLC-MS/MS method for the determination of donepezil and memantine in rat blood samples under the action of P-gp modulators

8、(Euphorbia factor L2 (1) and 3,5-dibenzoyl-15-hydroxylathyrol (2), and the pharmacokinetics of drugs for Alzheimers disease under the action of P-glycoprotein modulators was investigated. The analytes and the internal standard were separated with Agilent C-18 (50 mm 2.1 mm, 1.8 m) by acetonitrile: w

9、ater (5 mmol/L ammonium acetate, 0.2% formic acid) = 70:30 as the mobile phase. The flow rate was 0.2 mL/min. Amantadine was used as internal standard. The UPLC-MS/MS detection method was established by optimizing the preparation conditions, mass spectrometry parameters and chromatographic parameter

10、s. Thirty-six rats were randomly divided into six groups. The control group was intragastrically administrated with donepezil or memantine. The experimental group was intragastrically administrated with donepezil or memantine first, and then intravenously administrated with 1 or 2. The blood concent

11、ration of rats was measured by UPLC-MS/MS method and the pharmacokinetic parameters were calculated. Results showed that The calibration curves were linear in the range of 0.5-250 ng/mL and 1.0-250 ng/mL for donepezil and memantine. Methodological verification results meet the standards. The metabol

12、ism of donepezil and memantine in rats is affected by P-glycoprotein modulators. The pharmacokinetic study showed that the mean values of Cmax, Tmax, AUC(0-t) and t1/2 of donepezil were all decreased by compound 1, and CL/F was increased. However, for memantine, mean values of Cmax, Tmax, AUC(0-t) a

13、nd t1/2 were all increased, and CL/F was decreased. The almost consistent trends of donepezil and memantine were showed by compound 2. The mean values of Tmax and AUC(0-t) were all increased by compound 2, and Cmax was decreased. The results provide a reference and methodological basis for the pharm

14、acokinetic study of the interaction between medicinal plants of P-gp regulators as the main secondary metabolites with Alzheimers drugs, especially medicinal plants with lathyrane diterpene analogues as the main components.Keywords Euphorbia lathyris; P-gp modulators; donepezil; memantine; UPLC-MS/M

15、S; pharmacokinetic千金子是我國傳統(tǒng)中藥，用于治療水腫、腹水、便秘，閉經(jīng)和疥瘡等 REF _Ref13352 r h * MERGEFORMAT 1，其主要二次代謝產(chǎn)物為Lathyrane型二萜，在種油中約占3%-5% REF _Ref13381 r h * MERGEFORMAT 2。我們前期研究驗證，千金子Lathyrane型二萜可以有效調(diào)控P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）過表達引起的腫瘤多藥耐藥 REF _Ref13401 r h * MERGEFORMAT 3, REF _Ref13404 r h * MERGEFORMAT 4。其中，Euphor

16、bia factor L2（1）和3,5-dibenzoyl-15-hydroxylathyrol（2）（圖1）顯示出高活性，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)比維拉帕米高4.4和4.8倍。P-gp是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-bindinging cassette transporters, ABC transporters）家族成員之一，作為一種能量依賴性外排泵，消耗ATP主動排出有害外源性分子。在血腦屏障中，P-gp作為最重要的轉(zhuǎn)運蛋白 REF _Ref13646 r h * MERGEFORMAT 5, REF _Ref13652 r h * MERGEFORMAT 6，影響藥物的吸收、排泄和生物利用度，限制

17、外源性分子通過血腦屏障，保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)。阿爾茨海默癥（Alzheimer disease, AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。研究表明AD的發(fā)病機制與P-gp表達和功能降低有關(guān) REF _Ref13711 r h * MERGEFORMAT 7，參與清除腦內(nèi)-淀粉樣蛋白（amyloid-, A） REF _Ref13754 r h * MERGEFORMAT 8。此外，P-gp抑制劑還作為檢測AD患者P-gp功能障礙的示蹤劑 REF _Ref13799 r h * MERGEFORMAT 9。目前，阿爾茨海默癥治療藥物主要是以多奈哌齊為代表的乙酰膽堿酯酶抑制劑和以美金剛為代表的N-甲基-D

18、-天冬氨酸受體拮抗劑（圖1） REF _Ref13842 r h * MERGEFORMAT 10。多奈哌齊是P-gp的底物，P-gp是決定多奈哌齊在大腦和血液間分布和影響外排的重要因素 REF _Ref13874 r h * MERGEFORMAT 11。然而，美金剛不是P-gp的底物。P-gp與AD之間存在諸多相關(guān)性，P-gp調(diào)控劑對AD藥物的影響需進一步研究，但目前尚無P-gp調(diào)控劑對AD藥物代謝影響的研究。所以本研究的目的是利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）快速檢測方法進行條件優(yōu)化，建立大鼠血漿中千金子活性P-糖蛋白調(diào)控劑與多奈哌齊及美金剛的藥代動力學(xué)相互作用，探討P

19、-糖蛋白調(diào)控劑對多奈哌齊和美金剛在大鼠體內(nèi)代謝的影響，為P-gp調(diào)控劑與AD藥物間的相關(guān)性提供數(shù)據(jù)支持。圖 1 Euphorbia factor L2（1），3,5-dibenzoyl-15-hydroxylathyrol（2），多奈哌齊（3），美金剛（4）和金剛烷胺（5）的化合物結(jié)構(gòu)。Fig. 1 Chemical structures of Euphorbia factor L2 (1), 3,5-dibenzoyl-15-hydroxylathyrol (2), donepezil (3), memantine (4), and amantadine (5). 1 材料和方法1.1 化學(xué)

20、試劑和藥品鹽酸多奈哌齊，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；HPLC級甲醇和LC-MS級乙腈，Thermofisher科學(xué)有限公司；鹽酸美金剛、金剛烷胺（內(nèi)標(biāo)，IS）、乙酸銨、氨水、乙酸乙酯和甲酸，阿拉丁生化科技有限公司；二甲基亞砜和聚氧乙烯蓖麻油（PH，6.0-8.0），Sigma-Aldrich公司；純水，Milli-Q系統(tǒng)制備。從大戟科植物千金子中提取出Euphorbia factor L2（1）和Euphorbia factor L3。首先，將千金子（5 kg）粉碎，用乙醇/丙酮（5：1）在室溫下多次浸泡提取，濃縮提取液得到油狀浸膏。然后，將浸膏用柱色譜法分離，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫

21、，依次得到5個組分。其中組分2和組分3反復(fù)純化，得到Euphorbia factor L2（1）（0.36 g）和Euphorbia factor L3（7.3 g）。在室溫下，Euphorbia factor L3（5 g, 9.6 mmol）在含有5% NaOH的甲醇（100 ml）溶劑中，攪拌反應(yīng)24 h。采用柱色譜法（石油醚/乙酸乙酯 = 4：1）進行純化，得到2.93 g千金子二萜類化合物，白色粉末，收率92%。在0 、氮氣保護下，將千金子二萜類化合物（80 mg, 0.24 mmol）溶于CH2Cl2（5 mL）溶劑中依次加入DMAP（4 mg, 0.03 mmol）、Et3N（1

22、07 L, 0.77 mmol）和苯甲酸酐（224 mg, 0.99 mmol）。反應(yīng)從0 逐漸升至室溫，攪拌24 h。用柱色譜法（石油醚/乙酸乙酯 = 14：1）純化，得到白色無定形粉末2（70 mg, 產(chǎn)率66%）（圖2）。圖 2 化合物2的合成。Fig. 2 Synthesis of compound 2.1.2 動 物雄性Sprague-Dawley大鼠（250-300 g）由四川達碩實驗動物中心提供。在標(biāo)準(zhǔn)控制條件下飼養(yǎng)，溫度為22 2 、相對濕度為50 10%。在實驗前一周，所有動物均可自由獲取實驗室標(biāo)準(zhǔn)食物和水，在實驗前12小時禁止進食和自由取水。以二甲基亞砜（10 L）、聚氧乙

23、烯蓖麻油（60 L）和生理鹽水（930 L）為溶劑，將化合物1和2制備成2 mg/mL溶液，將多奈哌齊和美金剛用生理鹽水制備成0.6 mg/ml溶液。實驗分為6組（每組6只）：多奈哌齊組；多奈哌齊 + 化合物1組；多奈哌齊 + 化合物2組；美金剛組；美金剛 + 化合物1組；美金剛 + 化合物2組。每只大鼠均灌胃給藥多奈哌齊（3 mg/kg）或美金剛（3 mg/kg），然后靜脈注射劑量為10 mg/kg的1或2。對照組只灌胃3 mg/kg的多奈哌齊或美金剛。分別于給藥后0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、8、12、24、48 h，經(jīng)大鼠眼底靜脈叢采血，血液采集至肝素鈉抗凝的EP管中，充分

24、搖勻。3000 rpm離心10 min后取出血漿，于-20 冷凍保存。所有動物實驗均通過成都生物研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)。方法學(xué)驗證嚴(yán)格按照美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）的Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry規(guī)范進行 REF _Ref13956 r h * MERGEFORMAT 12。1.3 儀器和分析條件Agilent超高效液相色譜、Mass Hunter軟件（B.07.00）、Agilent 1290泵（型號G4204A）、Agilent 1290自動進樣器

25、（型號G4226A）、三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（型號G6460C）、C-18柱色譜（50 2.1 mm, 1.8 m）(安捷倫公司）。流動相為乙腈：水（5 mmol/L乙酸銨，0.2%甲酸） = 70:30，柱溫30 ，流速0.2 mL/min。自動進樣器的溫度維持在4 ，進樣體積為1 L。質(zhì)譜儀采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式。參數(shù)優(yōu)化為：氣體溫度，350 ；噴霧器，25.0 psi；MS1加熱器，100 ；MS2加熱器，100 ；駐留時間，200 ms。掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進行定量，定量分析的離子對MRM躍遷如下，多奈哌齊m/z為380.291.1、美金剛m/z為180.2

26、163.1、內(nèi)標(biāo)m/z為152.1135.1（圖3 (A)-(C)），Euphorbia factor L2（1）m/z為665.2105.0、3,5-dibenzoyl-15-hydroxylathyrol（2）m/z為565.2105.0（圖4 (D)-(E)）。裂解電壓、碰撞池能量和加速器電壓參數(shù)優(yōu)化如下：多奈哌齊分別為175 V，45 eV，7 V，美金剛為100 V，13 eV，7 V，內(nèi)標(biāo)為105 V，15 eV，7 V。圖 3 多奈哌齊（A），美金剛（B）和金剛烷胺（C）的化學(xué)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖及其裂解模式。Fig. 3 Chemical structures and prod

27、uct ion mass spectra of donepezil (A), memantine (B) and amantadine (C) in positive mode and their proposed fragmentation patterns.圖 4 在正離子模式下Euphorbia factor L2（D）和3,5-dibenzoyl-15-hydroxylathyrol（E）的化學(xué)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。Fig. 4 Chemical structures and product ion mass spectra of Euphorbia factor L2 (D), an

28、d 3,5-dibenzoyl-15-hydroxylathyrol (E) in positive mode.1.4 樣品制備將血漿樣品進行液液萃取方法的優(yōu)化，最大程度地降低基質(zhì)效應(yīng)。待測血漿樣本在室溫下解凍后，精密吸取50 L，加入甲醇10 L和750 ng/mL金剛烷胺內(nèi)標(biāo)溶液10 L，渦旋10 min。然后，加入0.1氨水100 L，并用1200 L乙酸乙酯進行萃取。渦旋15 min后，12000 rpm，4 下離心10 min，分離上清液，并用氮氣吹干。將干燥的提取物重新溶解于100 L流動相中，并轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，LC-MS/MS自動進樣量為1 L。2 結(jié)果2.1 方法驗證該分析方法

29、完全按照FDA的生物分析方法驗證指南進行，分別對專屬性，準(zhǔn)確性，精密度，回收率，基質(zhì)效應(yīng)和在不同條件下的穩(wěn)定性進行了驗證。2.1.1 線性關(guān)系、靈敏度、特異性和殘留 使用空白血漿樣品（不含分析物和內(nèi)標(biāo)的血漿樣品），零濃度樣品（只含內(nèi)標(biāo)的血漿樣品）和6種非零濃度標(biāo)準(zhǔn)品（含分析物和內(nèi)標(biāo)的血漿樣品）制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，多奈哌齊的校準(zhǔn)標(biāo)樣濃度為0.5、2、5、10、50、100、250 ng/mL，美金剛的校準(zhǔn)標(biāo)樣濃度1、2、5、10、50、100、250 ng/mL，適用于后續(xù)藥代動力學(xué)研究濃度范圍。在“1.3”條件下進行分析，記錄色譜圖，以分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，分析物的濃度為橫坐標(biāo)，用加權(quán)（1

30、/x2）最小二乘法計算多奈哌齊和美金剛的線性。多奈哌齊和美金剛分別在0.5-250 ng/mL和1.0-250 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。所有驗證批次的相關(guān)指數(shù)（r2）均大于0.9957。通過對6個不同批次的定量下線（LLOQ）樣品進行分析，確定靈敏度。在多奈哌齊（0.5 ng/mL）和美金剛（1.0 ng/mL）的LLOQ水平下，分析物峰的信噪比（S/N）約為空白血漿的10倍（圖5）。多奈哌齊、美金剛和內(nèi)標(biāo)在色譜中的保留時間（RT）內(nèi)均未見明顯干擾峰（圖5）。在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度樣品后進行空白血漿檢測時，在色譜區(qū)域內(nèi)未觀察到分析物的峰。因此，殘留效應(yīng)可忽略不計。圖 5 大鼠血漿中多奈哌齊

31、、美金剛和金剛烷胺（IS）的LC-MS/MS色譜圖。（A）空白血漿；（B）LLOQ水平血漿；（C）2 h后血漿樣品。Fig. 5 Representative LC-MS/MS chromatograms of donepezil, memantine, and amantadine (IS) in rat plasma. (A) blank plasma; (B) plasma at the LLOQ level; (C) 2 h past dose plasma sample.2.1.2 精密度和準(zhǔn)確度 按“1.4”項下方法制備不同濃度（LLOQ，LQC（低濃度），MQC（中濃度）和HQC

32、（高濃度）的血漿樣本各6份，按照“1.3”項下條件進行分析，計算批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。同法分別配制3批樣品及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，連續(xù)測試2天，計算批間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。由表1可知，批間、批內(nèi)精密度均小于15，準(zhǔn)確度在85-115以內(nèi)。表 1 多奈哌齊和美金剛在大鼠血漿中分析的精密度和準(zhǔn)確度（N = 6）a,bTable 1 Precision and accuracy for the analysis of donepezil and memantine in rat plasma (N = 6)a,b 多奈哌齊 Donepezil (/ng mL-1)美金剛 Memantine (/ng

33、mL-1)LLOQLQCMQCHQCLLOQLQCMQCHQC0.51.0125.0180.01.02.5125.0180.0日內(nèi) Intraday (N = 6)Mean SD0.479 0.0531.038 0.041133.567 5.721183.105 6.6021.029 0.1002.5772 0.187127.383 4.268180.090 2.2662精密度 Precision (RSD/%)11.063.954.283.619.727.263.351.48準(zhǔn)確度 Accuracy (Nominal/%)95.80103.80106.85101.73102.90103.09

34、101.91100.05日間 Interday (N = 18)Mean SD0.472 0.0451.009 0.063135.855 8.306187.926 9.2580.987 0.0932.635 0.177134.528 6.469181.169 7.033精密度 Precision (RSD/%)9.536.246.114.939.426.714.943.88準(zhǔn)確度 Accuracy(Nominal/%）94.40100.90108.68104.4098.70105.40107.62100.65aRSD/% = 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 100%；bNominal/% = 實測濃度/加標(biāo)濃度

35、 100%。aRSD/% = relative standard deviation 100%; bNominal/% = measured concentration/spiked concentration 100%.2.1.3 回收率 取大鼠血漿，按“1.4”項下方法制備LQC、MQC和HQC濃度的血漿樣本（N = 6），考察提取前后回收率，結(jié)果見表2。由表2可知，RSD均小于15%，回收率良好。表 2 多奈哌齊和美金剛的萃取回收率（N = 6）aTable 2 Extraction recovery of donepezil and memantine (N = 6)a多奈哌齊 Don

36、epezil (/ng mL-1)美金剛 Memantine (/ng mL-1)LQCMQCHQCLQCMQCHQC1.0125.0180.02.5125.0180.0Mean SD/%96.89 8.8586.84 2.4091.33 1.55104.33 3.3399.47 5.81105.42 2.39RSD/%9.132.761.703.195.842.272.1.4 基質(zhì)效應(yīng) 取空白溶液加入分析物，配制成LQC、MQC和HQC濃度的無基質(zhì)樣本（N = 6），取大鼠空白血漿萃取后加入分析物，配制成LQC、MQC和HQC濃度的基質(zhì)樣本（N = 6），基質(zhì)因子（MF）是基質(zhì)樣本的峰面積與

37、無基質(zhì)樣本的峰面積之比。內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子是通過目標(biāo)分析物的基質(zhì)因子與內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子的比值。采用內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子（MFs）考察基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3。由表3可知，內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子均在0.8-1.2之內(nèi)，RSD均小于15，因此化合物的基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計。表 3 多奈哌齊和美金剛在3個QC水平的基質(zhì)效應(yīng)（N = 6）a,bTable 3 Matrix effect of donepezil donepezil and memantine at three QC levels (N = 6)a,b多奈哌齊 Donepezil (/ng mL-1)美金剛 Memantine (/ng mL-1)LQ

38、CMQCHQCLQCMQCHQC1.0125.0180.02.5125.0180.0IS-normalized MF% SD1.138 0.02091.107 0.01711.005 0.02661.097 0.04820.992 0.02431.051 0.0327RSD/%1.841.542.654.392.453.11bIS-normalized MF：內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子。bIS-normalized MF: internal standard-normalized matrix factor.2.1.5 穩(wěn)定性 按“1.4”項下方法配制3個濃度血漿樣品（LQC，MQC和HQC），每個濃

39、度平行配制3份，評估條件包括長期穩(wěn)定性（-20 保存30天），凍融穩(wěn)定性（-20 凍融3次），室溫穩(wěn)定性（室溫25 ，24 h），干燥提取物穩(wěn)定性（室溫25 ，24 h），進樣器穩(wěn)定性（4 ，24 h），結(jié)果見表4。由表4可知，Nominal均在85%-115%之間，多奈哌齊和美金剛在大鼠血漿中的各種穩(wěn)定性研究條件中均保持穩(wěn)定。表 4 在不同貯存條件下多奈哌齊和美金剛在大鼠血漿中的穩(wěn)定性（N = 3）aTable 4 Stability of donepezil and memantine in rat plasma under various storage conditions (N =

40、3)a多奈哌齊 Donepezil (/ng mL-1)美金剛 Memantine (/ng mL-1)LQCMQCHQCLQCMQCHQC1.0125.0180.02.5125.0180.0長期穩(wěn)定性 Long-term stability (-20 , 30 days)Mean SD0.94 0.10126.80 8.28167.60 8.312.63 0.14126.30 1.79166.23 3.47Nominal/%94.0101.4493.11105.2101.0492.353次凍融穩(wěn)定性 Three freeze-thaw cycles stability (-20 )Mean

41、SD1.00 0.09130.33 5.99168.32 4.002.48 0.23128.74 2.73172.11 8.93Nominal/%100.0104.2693.5199.2102.9995.62室溫穩(wěn)定性 Bench-top stability (25 , 24 h)Mean SD1.04 0.07122.94 3.13181.9 7.882.65 0.07120.33 2.19185.94 3.90Nominal/%104.098.35101.06106.096.26103.3干燥提取物穩(wěn)定性Dry extract stability (25 , 24 h)Mean SD0.9

42、6 0.06124.28 6.60157.91 2.592.51 0.07123.12 4.30154.32 1.65Nominal/%96.099.4287.73100.498.5085.73進樣器穩(wěn)定性 Autosampler stability (4 , 24 h)Mean SD0.98 0.07123.22 8.48177.64 18.452.27 0.09122.06 3.67168.1 2.71Nominal/%98.098.5898.6990.897.6593.392.2 大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究經(jīng)驗證的UPLC-MS/MS方法成功地用于大鼠灌胃給藥多奈哌齊或美金剛并靜脈注射1或

43、2后大鼠血漿中的藥代動力學(xué)研究。平均血藥濃度-時間曲線（圖6）和多奈哌齊和美金剛的藥代動力學(xué)參數(shù)（表5）通過使用非房室統(tǒng)計模型DAS 3.2.8進行計算，包括最大血藥濃度（Cmax）；最大血藥濃度時間（Tmax）；零到無限時間的血藥濃度-時間曲線下面積（AUC(0-)）；零到t時間的血藥濃度-時間曲線下面積（AUC(0-t)）；半衰期（t1/2）；清除率（Cl/F）。圖 6 SD大鼠灌胃多奈哌齊（3 mg/kg）或美金剛（3 mg/kg），靜脈注射化合物1（10 mg/kg）或化合物2（10 mg/kg）后，多奈哌齊（A）和美金剛（B）的平均血藥濃度-時間曲線圖（N = 6）。Fig. 6 T

44、he mean plasma concentration-time profiles of donepezil (A) and memantine (B) after intragastrically administrated with donepezil (3 mg/kg) or memantine (3 mg/kg) and intravenously administrated with compound 1 (10 mg/kg) or 2 (10 mg/kg) for SD rats (N = 6).表 5 灌胃多奈哌齊（3 mg/kg）或美金剛（3 mg/kg），并靜脈注射化合物1

45、（10 mg/kg）或化合物2（10 mg/kg）后，多奈哌齊和美金剛在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)（mean SD, N = 6）Table 5 Pharmacokinetic parameters of donepezil and memantine in rats (mean SD, N = 6) after intragastrically administrated with donepezil (3 mg/kg) or memantine (3 mg/kg) and intravenously administrated with compound 1 (10 mg/kg) or 2 (1

46、0 mg/kg)多奈哌齊 Donepezil美金剛 Memantine參數(shù) Parameter+ 1+ 2+ 1+ 2Cmax/ng mL-148.40 19.0339.23 17.946.89 37.4084.18 25.5592.80 12.2565.37 19.57Tmax/h1.00 0.500.96 0.511.92 1.010.79 0.100.88 0.141.96 1.58AUC(0-)/ng h-1 mL163.66 42.77133.13 39.78213.06 83.01368.90 64.79420.96 81.08363.82 58.18AUC(0-t)/ng h-1

47、 mL-1159.40 38.54133.09 39.76209.07 83.94366.84 65.78417.00 79.54357.86 57.37t1/2/h4.05 2.781.72 0.513.88 1.203.06 1.003.10 1.623.50 1.91(CL/F)/L h-1 kg-119.12 3.6824.22 6.9315.81 5.598.37 1.687.39 1.668.42 1.333 討 論3.1 方法優(yōu)化3.1.1 色譜條件優(yōu)化 在靈敏度和峰形的基礎(chǔ)上優(yōu)化流動相體系，分別考察乙腈：水（5 mmol/L乙酸銨，0.2甲酸）和甲醇：水（5 mmol/L乙酸銨

48、，0.2甲酸）流動相體系。結(jié)果表明：乙腈體系明顯提高基線。進一步考察有機相與水相比例，包括60/40、70/30、80/20、90/10（v/v），結(jié)果表明：溶劑體積比為70/30時峰形最優(yōu)。故選擇流動相為乙腈：水（5 mmol/L乙酸銨，0.2甲酸） = 70：30（v/v），流速為0.2 mL/min。在不同柱溫下，結(jié)果不受影響。3.1.2 ESI-MS/MS條件優(yōu)化 依據(jù)我們之前的研究和相關(guān)文獻 REF _Ref68626350 r h * MERGEFORMAT 13- REF _Ref68680668 r h * MERGEFORMAT 15，目標(biāo)檢測樣品和Lathyrane型二萜，

49、在正離子模式下顯著特征峰，在負(fù)離子模式下特征峰不顯著，所以本實驗中確定以正離子模式作為檢測方法。取化合物1、2，多奈哌齊，美金剛和內(nèi)標(biāo)金剛烷胺供試品溶液，在電噴霧正離子模式下進行掃描。在全掃描模式下分別得到化合物1、2，多奈哌齊，美金剛和內(nèi)標(biāo)金剛烷胺的母離子峰，依次為m/z 665.2，565.2，380.2，180.2，152.1。在產(chǎn)物離子模式得到碎片離子峰，依次為m/z 105.0，105.0，91.1，163.1，135.1。進一步優(yōu)化各分析物的參數(shù)，裂解電壓、碰撞池能量和加速器電壓參數(shù)優(yōu)化如下：多奈哌齊為175 V，45 eV，7 V，美金剛為100 V，13 eV，7 V，內(nèi)標(biāo)為1

50、05 V，15 eV，7 V，可得到最佳信噪比（S/N）。3.1.3 樣品制備的優(yōu)化 初步嘗試蛋白質(zhì)沉淀方法，分析物的基質(zhì)因子小于0.5，無法滿足實驗需要。進而考察液液萃取的優(yōu)化方法，比較乙酸乙酯和叔丁基甲基醚（TBME）的萃取回收率，兩者均達到95以上，但乙酸乙酯的平均萃取回收率和基質(zhì)效應(yīng)值更好。根據(jù)萃取回收率和基質(zhì)效應(yīng)調(diào)整乙酸乙酯的體積和萃取次數(shù)，最終確定乙酸乙酯體積為1200 L。對不同濃度和體積的氨水進行比較，100 L的0.1氨水，其基質(zhì)效應(yīng)和回收率均最優(yōu)。3.1.4 兩種P-gp調(diào)控劑對多奈哌齊和美金剛的藥代動力學(xué)效應(yīng) 如表5所示，在給藥1和2后，多奈哌齊和美金剛在SD大鼠體內(nèi)的藥

51、代動力學(xué)特征具有較高的個體間差異。多奈哌齊和美金剛在化合物1的作用下趨勢相反，與對照組相比，化合物1降低多奈哌齊的Cmax、Tmax、AUC(0-t)和t1/2的均值，升高CL/F，而美金剛Cmax、Tmax、AUC(0-t)和t1/2的均值升高，CL/F降低。多奈哌齊和美金剛在化合物2的作用下的變化趨勢基本一致，化合物2使兩個調(diào)控劑的Tmax均值和AUC(0-t)均升高，Cmax降低。多奈哌齊是P-gp的底物，而美金剛不是其底物，這可能是兩者在化合物1或2的作用下藥代動力學(xué)特性表現(xiàn)出不同的趨勢的主要原因。本課題組已驗證千金子中Lathyrane型二萜類是具有較強逆轉(zhuǎn)活性的P-gp調(diào)控劑 RE

52、F _Ref13401 r h * MERGEFORMAT 3，這一結(jié)果為以P-gp調(diào)控劑為主要二次代謝產(chǎn)物，特別是以Lathyrane型二萜類似物為主要成分的藥用植物與阿爾茨海默癥藥物相互作用的藥代動力學(xué)研究提供了參考和方法基礎(chǔ)。在阿爾茨海默癥患者服用多奈哌齊與美金剛過程中，聯(lián)用含有P-gp調(diào)控劑的藥用植物，將可能影響其體內(nèi)的藥物代謝，是一個需要引起關(guān)注的問題。4 結(jié) 論本研究建立了天然活性P-糖蛋白調(diào)控劑（Euphorbia factor L2（1）和衍生物（3,5-dibenzoyl-15-hydroxylathyrol（2）影響下，多奈哌齊和美金剛的UPLC-MS/MS分析方法。經(jīng)實驗

53、條件的優(yōu)化和詳細(xì)方法學(xué)驗證，多奈哌齊和美金剛線性范圍為0.5-250 ng/mL、1.0-250 ng/mL，該方法專屬性，準(zhǔn)確度，精密度，回收率，基質(zhì)效應(yīng)，殘留及穩(wěn)定性良好。本方法成功應(yīng)用于藥代動力學(xué)研究，化合物1和2對兩種阿爾茨海默癥藥物的影響呈現(xiàn)不同趨勢，其中化合物1降低多奈哌齊的Cmax、Tmax、AUC(0-t)和t1/2的均值，升高CL/F，升高美金剛的Cmax、Tmax、AUC(0-t)和t1/2的均值，降低CL/F。化合物2使多奈哌齊和美金剛的Tmax均值和AUC(0-t)都升高，Cmax都降低。結(jié)果表明多奈哌齊和美金剛在大鼠體內(nèi)代謝受到P-糖蛋白調(diào)控劑的影響，且呈現(xiàn)不同的趨勢

54、，詳細(xì)機制仍需進一步深入研究。這一結(jié)果為大戟科Lathyrane型P-糖蛋白調(diào)控劑的藥物開發(fā)和應(yīng)用提供了方法和研究基礎(chǔ)。參考文獻 References中國藥典委員會. 中華人民共和國藥典M. 北京: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 2015: 34 Chinese Pharmacopoeia Commission. The Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China M. Beijing: China Medical Science Press, 2015: 34Bicchii C, Appendino G, Cordero C, Rubiolo P,

55、Ortelli D, Veuthey JL. HPLC-UV and HPLC-positive-ESI-MS analysis of the diterpenoid fraction from caper spurge (Euphorbia lathyris) seed oil J. Phytochem Anal, 2001, 12 (4): 255-262Jiao W, Dong W, Li Z, Deng M, Lu R. Lathyrane diterpenes from Euphorbia lathyris as modulators of multidrug resistance

56、and their crystal structures J. Bioorg Med Chem, 2009, 17 (13): 4786-4792Jiao W, Wan Z, Chen S, Lu R, Chen X, Fang D, Wang J, Pu S, Huang X, Gao H, Shao H. Lathyrol diterpenes as modulators of P-glycoprotein dependent multidrug resistance: structure-activity relationship studies on Euphorbia factor

57、L3 derivatives J. J Med Chem, 2015, 58 (9): 3720-3738Abbott NJ, Patabendige AA, Dolmam DE, Yusof SR, Begley DJ. Structure and function of the blood-brain barrier J. Neurobiol Dis, 2010, 37 (1): 13-25Schinkel HA. P-glycoprotein, a gatekeeper in the blood-brain barrier J. Adv Drug Deliv Rev, 1999, 36: 179-194Banks WA. Drug delivery to the brain in Alzheimers disease: consideration of the blood-brain barrier J. Adv Drug Deliv Rev, 2012, 64 (7): 629-639Vogelgesang S, Jedlitschky G, Brenn A, Walker LC. The role of the ATP-binding cassett