何水林版基因工程第五章基因的轉移與重組體的篩選和鑒定

1、第五章基因的轉移與重組體的篩選和鑒定 一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5端磷酸與3-OH連到一起單酶切、雙酶切第一節(jié) DNA的體外重組DNA的體外重組：將目的基因與載體連接，這種重新組合的DNA稱為重組DNA。（一） 直接連接T4 DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的110%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -OH-PP-HO-5 3 二、平末端（blunt end）的連接（1）同聚加尾法 （二） 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端轉移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3-OH端加上脫氧核苷酸。 原理：分別給載體和

2、插入片斷加上互補的核苷酸。 加尾堿基互補缺點：優(yōu)點：能把任何片段連接起來操作繁瑣；外源片段難以回收；同聚物尾巴影響外源基因表達。非酶切位點（2）銜接物（linker）連接Linker：用化學合成法合成的一段10-12bp的，具有一個或數(shù)個限制性內切酶識別位點的平末端雙鏈寡核苷酸GGAATTCC CCTTAAGGEcoR I linker：（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （1）多核苷酸激酶處理（2）T4連接酶連接（3）限制性內切酶消化（4）目的片段與載體連接（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （3）DNA接頭 （adapter）連接法 adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序

3、列）Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 3HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 接頭與接頭以粘末端連接，影響與DNA片段的連接 優(yōu)點：連上后就能用。 缺點：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5端的磷酸，防止自我連接。 防止自我連接5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG GGCCCTAG-p5 Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-3 GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5HO-GATCCCGG- GGCC CCGG -GGCCCTA

4、G-OH5 5HO-GATCCCGG3 GGCC-OH5 nick缺口nick缺口HO-OHCIP處理T4 ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接T4多核苷酸激酶處理使5磷酸化三、PCR產物的連接1.在引物的5端設計酶切位點符合載體的多克隆位點；（1）設計原則（2）帶酶切位點的引物的結構3端1520bp與模板互補； 5端內切酶識別序列保護堿基避免與所擴增的DNA片斷內部酶切位點重復。三、PCR產物的連接1.在引物的5端設計酶切位點請設計一對PCR引物，在N端和C端分別加一個EcoRI（GAATTC，保護堿基GCA）和BamHI酶切位點（GGATCC，保護堿基CGC），另外，各含有18

5、個同該基因同源的核苷酸，能夠用于擴增該基因的編碼序列。寫出P1和P2的引物序列。 帶酶切位點的PCR產物GCAGAATTC PCR產物5-3 CCTAGGCGC PCR產物-5 3-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoR I位點BamH I位點AATTC PCR產物5-3 CCTAG PCR產物-5 3-GGEcoR IBamH I兩頭各有一個粘性末端！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶載體PCR產物TATA三、PCR產物的連接2. 與T載體直接連接三、Gateway 載體構建系統(tǒng)噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)；高效的實現(xiàn)DNA序列在多種載體系統(tǒng)的轉移。入門克隆改造過的各種表達載體三

6、、Gateway 載體構建系統(tǒng)（1）創(chuàng)建入門克隆 BP反應：attB+attP attL+attR，產物：入門克隆入門克隆改造過的各種表達載體三、Gateway 載體構建系統(tǒng)（2）構建表達克隆 LR反應：attL+attR attB+attP，產物：表達克隆入門克隆改造過的各種表達載體第二節(jié) 重組體導入受體細胞一、重組DNA導入大腸桿菌（一）轉化（transformation）大腸桿菌捕獲質粒DNA的過程。（三）轉染（transfection）受體菌直接捕獲噬菌體DNA的過程。（二）轉導（transduction）借助噬菌體把外源DNA導入細菌的過程。（一）轉化（transformation）

7、（1）熱激法（heat shock）（2）電轉化法（electronporation）（3）PEG介導的原生質體轉化（4）接合轉化制備感受態(tài)細胞增加受體菌細胞膜的通透性（1）熱激法 目的感受態(tài)細胞：處于能吸收外源DNA分子的生理狀態(tài)的細胞制備感受態(tài)細胞1、將處于對數(shù)生長期的細菌置于0的CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹成球形，處于感受態(tài)；2、將感受態(tài)細胞與DNA混合，Ca2+與DNA結合形成抗DNase的羥基-磷酸鈣復合物，粘附于細胞表面；3、經(jīng)42短時間熱激處理，細胞吸收DNA復合物；4、在培養(yǎng)基中生長數(shù)小時之后，球形細胞復原并增殖。（1）熱激法 CaCl2法制備感受態(tài)細胞轉化DNA的原理 10

8、ng載體DNA100L感受態(tài)細胞冰浴30min42 12min加入1mL LB培養(yǎng)基（Amp-）37振蕩培養(yǎng)1h10-100L轉化液涂Amp平板吸附DNA攝入DNA操作步驟：（p140）轉化率：106-108/g DNA（2）電轉化法原理：在高壓脈沖下，細菌細胞表面形成暫時性微孔，重組DNA通過微孔進入細胞后，脈沖結束，細胞恢復原狀。實驗簡單，不需要制備特殊的感受態(tài)細胞 “感受態(tài)”：清洗處理，在低溫下使細胞處于無離子區(qū)且有甘油或蔗糖等保護劑的懸液中，保證電擊過程中細胞不被擊穿而死亡。轉化率：1091010/ g DNA（二） 轉導由噬菌體和細胞病毒介導的遺傳信息的轉移過程（三） 轉染噬菌體DN

9、A不經(jīng)過蛋白包裝成病毒顆粒，直接被感受態(tài)細胞捕獲的過程。與轉化無本質區(qū)別體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。每g DNA能形成106個噬菌斑 現(xiàn)在把DNA轉移至動物細胞的過程也稱轉染 體外包裝過程 二、重組DNA導入真核細胞（一）導入酵母細胞原生質體轉化堿金屬離子介導的完整細胞轉化PEG1000轉化法電擊法（二）導入植物細胞（三）導入動物細胞1. 利用原生質體進行轉化 酵母原生質體感受態(tài)酶去壁CaCl2 PEG插入外源基因的載體共轉化：將兩個以上的基因同時導入感受態(tài)細胞的方法轉化轉化細胞達原生質體總數(shù)的1%2%，轉化率受再生率影響共轉化的原生質體占轉化子總數(shù)的25%33%整理ppt

10、酵母0.1mol/L LiCl處理感受態(tài)2. 堿金屬離子介導的完整細胞轉化插入外源基因的載體40% PEG 4000熱激涂布選擇性平板，篩選轉化子 吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍轉化率：103個 / g DNA；共轉化現(xiàn)象極少整理ppt4. 電擊轉化（1）適于原生質體和完整細胞（2）轉化率高，105個 / g DNA（3）單鏈轉化率高于雙鏈3. PEG1000轉化PEG處理酵母細胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉化整理ppt二、重組DNA導入真核細胞（一）導入酵母細胞載體介導的轉化（農桿菌介導）DNA直接導入（基因搶法、電擊法等）種質系統(tǒng)法（花粉管通道法等）（二）導入植物細胞（三

11、）導入動物細胞整理ppt（二）導入植物細胞1. 農桿菌介導的Ti質粒遺傳轉化方法將目的基因插入到載體的T-DNA區(qū)，形成重組DNA整理ppt（二）導入植物細胞1. 農桿菌介導的Ti質粒遺傳轉化方法將重組DNA轉入含有Vir致病基因的農桿菌整理ppt（二）導入植物細胞1. 農桿菌介導的Ti質粒遺傳轉化方法通過農桿菌侵染植物外植體整理ppt（二）導入植物細胞1. 農桿菌介導的Ti質粒遺傳轉化方法將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細胞基因組中，獲得轉基因植株整理ppt在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)2天葉盤法的具體操作 整理ppt又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細胞的轉化技

12、術。DNA1.2m鎢彈頭 吸附金屬微粒加速，進入受體細胞基因槍裝入2. 基因槍法（gene gun） 外植體制備轟擊外植體培養(yǎng)及選擇整理ppt整理ppt具體操作 1. DNA微彈的制備2. 外植體的制備3. DNA微彈轟擊4. 外植體的培養(yǎng)整理ppt植物細胞原生質體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液電擊處理愈傷組織幼苗分化3. 電擊法（電穿孔法）選擇培養(yǎng)整理ppt二、重組DNA導入真核細胞（一）導入酵母細胞1. 磷酸鈣沉淀法2. 脂質體介導法3. 顯微注射法4. DEAE-葡萄糖轉染法（二）導入植物細胞（三）導入動物細胞整理ppt原理：（三）導入動物細胞1. 磷酸鈣沉淀法通過磷酸鈣-DNA

13、共沉淀，將外源基因導入哺乳動物細胞依據(jù)不同的細胞類型，平皿上最多能有10%的細胞能吸收DNA沉淀。整理ppt整理ppt操作簡便，成本低廉、可大批量轉染、對細胞毒性小、效果穩(wěn)定，但轉染效率低。整理ppt2. 脂質體介導法脂質體包埋DNA，通過細胞膜進入細胞。整理ppt整理ppt應用玻璃顯微注射器，直接把外源DNA注射到宿主細胞核里，使其整合到染色體上。3. 顯微注射法1）外源基因制備：線性化的質?；蚰康钠?）收集受精卵：受孕后幾小時內3）顯微注射：將外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植整理ppt整理ppt二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖為多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細胞攝入外源DNA。4.

14、DEAE-葡萄糖轉染法葡聚糖葡聚糖整理pptDEAE-dextran外源DNA細胞混合DEAE-dextran對細胞有毒，常采用低濃度長時間處理吸附到細胞表面后被細胞吞入，部分DNA可以進入到細胞核里。4. DEAE-葡萄糖轉染法整理ppt整理ppt三、轉化率及影響因素轉化率（cfu / gDNA）：每微克重組DNA轉化后，接納DNA分子的受體細胞的個數(shù)，即陽性克隆數(shù)。（一）轉化率的計算：轉化率 產生菌落的總數(shù) / DNA的加入量 整理ppt三、轉化率及影響因素例：取1l（0.1 ng/l）完整的質粒轉化100l的感受態(tài)細胞。向轉化反應液中加入900l培養(yǎng)液，讓細菌恢復一小段時間，取100l鋪

15、板。培養(yǎng)過夜，產生1000個菌落，轉化率為多少？轉化率1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /g 整理ppt三、轉化率及影響因素例：某一DNA重組實驗的重組率為20%，轉化率為107 cfu / mg 天然載體，經(jīng)酶切和連接處理后的重組載體轉化率比天然載體約低100倍，欲獲得104個重組克隆，需要投入多少重組載體DNA進行重組實驗？104 107 cfu / mg 10-2 a 20% 重組載體 a = 0.5 mg整理ppt三、轉化率及影響因素普通的亞克隆實驗：110 6 cfu/g DNA；更復雜的亞克?。?107 cfu/g DNA，如有限量的DNA的轉化，T-A克隆

16、；構建文庫： 1108 cfu/g DNA。整理ppt1）載體DNA類型、大??；重組DNA濃度、純度2）受體細胞3）轉化方法：同一轉化方法技術參數(shù)影響轉化率（二）轉化率的影響因素三、轉化率及影響因素整理ppt一、載體表型選擇法二、根據(jù)插入基因的表型選擇三、DNA電泳檢測法四、PCR檢測法五、核酸雜交檢測法六、免疫化學檢測法七、DNA序列分析第三節(jié) 重組子的篩選與鑒定整理ppt1. 抗藥性標記及其插入失活選擇法pBR322質粒上有兩個抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位點BamH I和Sal I; Ampr上有插入位點Pst I。一、載體表型選擇法整理ppt2. -半乳糖苷酶顯色

17、反應選擇法-半乳糖苷酶 X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍+深藍色整理ppt-半乳糖苷酶使X-gal分解成藍色產物。整理ppt利用插入的外源基因的表達產物特性進行直接選擇。轉化進來的外源基因產物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。二、根據(jù)插入基因的表型選擇1. 彌補缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長整理ppt例：抗生素抗性抗性基因載體外源DNA連接轉化受體菌抗生素培養(yǎng)基平板含抗生素抗性基因的克隆才能生長使被轉化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。2. 增加新性狀整理ppt有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。1. 直接電泳檢測法從轉化后的菌體克隆中分離質粒，電泳、

18、比較其分子量。三、 DNA電泳檢測法 Marker載體重組克隆整理ppt2. 酶切電泳篩選法根據(jù)外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選一兩種內切酶切割，電泳后比較電泳結果：DNA帶數(shù)和長度。一般用重組時的內切酶將外源DNA切出單雙整理ppt整理ppt四、PCR擴增檢測法應用PCR反應擴增出預期DNA片斷（1）從重組克隆中提取質粒（或DNA）；（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR；（3）凝膠電泳；（4）是否有條帶產生，條帶大小是否正確。整理ppt五、核酸雜交檢測法 1. Southern blotting從宿主細胞中提取DNA，用探針雜交。整理ppt2. Northern blotting主要檢測插入片斷是否被轉錄。從宿主細胞中提取RNA，用探針雜交。整理ppt3. Western blotting在蛋白質凝膠電泳以后，用轉膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質泳帶。（SDS）點樣電泳方向