分子生物學(xué)第五講

1、翻譯 Translation（蛋白質(zhì)的生物合成 Protein Biosynthesis ）1 轉(zhuǎn)錄: 在RNA聚合酶（RNA Polymerase）的催化下，以DNA為模板合成RNA的過程 。Review of last class2轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性(asymmetric transcription ) DNA鏈上只有部分區(qū)段作為轉(zhuǎn)錄模板(反義鏈或模板鏈),且模板鏈并非自始至終位于同一股DNA單鏈上，稱為轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性。有義鏈(Sense strand) 與mRNA序列相似的那條DNA鏈稱為有義鏈，又叫編碼鏈.3啟動(dòng)子(Promoter)：位于DNA分子上專一與RNA聚合酶結(jié)合并決定轉(zhuǎn)錄起始的

2、一段序列。 轉(zhuǎn)錄單元：一段從啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的DNA序列。包括上游調(diào)控區(qū)、結(jié)構(gòu)基因區(qū)、下游轉(zhuǎn)錄終止區(qū)三個(gè)部分。4轉(zhuǎn)錄起始（Initiation） (模板識(shí)別 Template recognition) RNA聚合酶與DNA結(jié)合尋找啟動(dòng)子解開DNA雙螺旋起始位點(diǎn)合成RNA5RNA polymerase II位于核質(zhì)中用于所有蛋白質(zhì)編碼基因mRNA前體的合成前體mRNA需經(jīng)過加帽、加尾及剪接等加工過程。6復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相同點(diǎn)：都以DNA為模板合成方向均為53方向都需要依賴DNA的聚合酶遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律原料為核苷酸產(chǎn)物為多聚核苷酸鏈7 1、DNA復(fù)制時(shí)，以35方向的母鏈作為模板，指導(dǎo)新合成的鏈

3、以53方向進(jìn)行連續(xù)合成的鏈稱為 。另一條非連續(xù)合成的鏈稱作 ，該合成鏈上有許多被稱作 片段的不連續(xù)片段。 2、RNA有三種基本類型，它們是 、 和 。 3、下列過程不屬于轉(zhuǎn)錄起始的是（ ） A、RNA聚合酶與DNA結(jié)合 B、尋找啟動(dòng)子 C、解開DNA雙螺旋 D、在核心酶作用下， NTP不斷聚合 4、A gene with 6 exons is expected to have（ ） A、5 introns B、6 introns C、7 introns D、incertitude8順式作用元件(cis-acting element)：影響自身基 因表達(dá)活性的非編碼DNA序列，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子

4、、沉默子等（1）啟動(dòng)子：在DNA分子中，RNA聚合酶能夠識(shí)別、結(jié)合并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始的序列。（2）增強(qiáng)子：能從啟動(dòng)子的上游或下游數(shù)千個(gè)堿基處激活轉(zhuǎn)錄的序列元件（3）沉默子：某些基因含有負(fù)性調(diào)節(jié)元件沉默子，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。9反式作用因子(trans-acting factors)能直接、間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子。 反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptional factors, TF)。 10End of Review111213桃基因組測(cè)序完成，2013, 3.24 Na

5、ture Genetics1415粗山羊草基因組測(cè)序完成注：擬斯卑爾脫山羊草 BB 16 流感病毒可分為甲（）、乙（）、丙（）三型。其中，甲型流感依據(jù)流感病毒血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）的不同可分為1-16種亞型（H1H16）， 根據(jù)病毒神經(jīng)氨酸酶蛋白（neuraminidase, NA）的不同可分為1-9種亞型（N1N9），HA不同亞型可以與NA的不同亞型相互組合形成不同的流感病毒。Beware the New Bird Flu H7N9 血凝素蛋白呈柱狀，能與人、鳥、豬豚鼠等動(dòng)物紅細(xì)胞表面的受體相結(jié)合引起凝血。血凝素蛋白水解后分為輕鏈和重鏈兩部分，后者可以與宿主細(xì)胞膜上的

6、唾液酸受體相結(jié)合，前者則可以協(xié)助病毒包膜與宿主細(xì)胞膜相互融合。 17 神經(jīng)氨酸酶蛋白是一個(gè)呈蘑菇狀的四聚體糖蛋白，具有水解唾液酸的活性，當(dāng)成熟的流感病毒經(jīng)出芽的方式脫離宿主細(xì)胞之后，病毒表面的血凝素會(huì)經(jīng)由唾液酸與宿主細(xì)胞膜保持聯(lián)系，需要由神經(jīng)氨酸酶將唾液酸水解，切斷病毒與宿主細(xì)胞的最后聯(lián)系。 因此神經(jīng)氨酸酶是流感治療藥物的一個(gè)作用靶點(diǎn)，針對(duì)該酶設(shè)計(jì)的奧司他韋（Oseltamivir）是著名的抗流感藥物之一，商品名叫達(dá)菲 （Tamiflu）。 18內(nèi)容提要 1、基本概念2、遺傳密碼3、核蛋白體是多肽鏈合成的裝置4、tRNA與氨基酸的活化5、蛋白質(zhì)生物合成過程191. 概念翻譯：翻譯是指以mRNA

7、為模板，把核苷酸三聯(lián)子遺傳密碼翻譯成氨基酸序列、合成蛋白質(zhì)多肽 鏈的過程。 蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所是? 蛋白質(zhì)合成的模板是? 模板與氨基酸之間的接合體是? 蛋白質(zhì)合成的原料是?tRNA 溫故部分概念 P1222020種氨基酸(a.a.)作為原料酶及眾多蛋白因子，如IF、eIF ATP、GTP、無機(jī)離子參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)包括 三種RNAmRNA（messenger RNA, 信使RNA）rRNA（ribosomal RNA, 核蛋白體RNA）tRNA（transfer RNA, 轉(zhuǎn)移RNA）212. 遺傳密碼原核生物的多順反子（polycistronic）真核生物的單順反子（monocistro

8、nic）非編碼序列核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)起始密碼子終止密碼子編碼序列PPP53蛋白質(zhì)PPPmG -53蛋白質(zhì)22 mRNA上存在遺傳密碼mRNA分子上從5至3方向，由AUG開始，每3個(gè)核苷酸為一組，決定肽鏈上某一個(gè)氨基酸或蛋白質(zhì)合成的起始、終止信號(hào)，稱為三聯(lián)體密碼(triplet coden)。起始密碼(initiation codon): AUG 終止密碼(termination codon): UAA，UAG，UGA 23遺傳密碼表24從mRNA 5端起始密碼子AUG到3端終止密碼子之間的核苷酸序列，稱為開放閱讀框架(open reading frame, ORF)。 Complete CDS

9、and deduced amino acid sequence of BcPRO in Brassica campestris ssp. chinenesis. BcPRO gene is 405 bp in length encoding 135 amino acids. 25 連續(xù)性(Commaless)遺傳密碼的特點(diǎn)編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無間斷也無交叉。 基因損傷引起mRNA閱讀框架內(nèi)的堿基發(fā)生插入或缺失，可能導(dǎo)致移碼突變(frameshift mutation)。 26簡(jiǎn)并性(Degeneracy)遺傳密碼中，除色氨酸和甲硫氨酸僅有一個(gè)密碼子外，其余氨基

10、酸有2、3、4個(gè)或多至6個(gè)三聯(lián)體為其編碼。27通用性(universal)蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例外，如動(dòng)物細(xì)胞的線粒體、植物細(xì)胞的葉綠體。密碼的通用性進(jìn)一步證明各種生物進(jìn)化自同一祖先。 28擺動(dòng)性(Wobble)轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的tRNA的反密碼需要通過堿基互補(bǔ)與mRNA上的遺傳密碼反向配對(duì)結(jié)合，但反密碼子與密碼子之間不嚴(yán)格遵守常見的堿基配對(duì)規(guī)律，稱為擺動(dòng)配對(duì)。 tRNA反密碼子第1位堿基IUGACmRNA密碼子第3位堿基U, C, AA, GU, CUG29內(nèi)容提要 1、基本概念2、遺傳密碼3、核蛋白體是多肽鏈合成的裝置4、tRNA與氨基酸的活化5、蛋白質(zhì)生

11、物合成過程303、核蛋白體是多肽鏈合成的裝置31 不同細(xì)胞核蛋白體的組成 核蛋白體是細(xì)胞質(zhì)和線粒體中無膜包裹的顆粒狀細(xì)胞器，具蛋白質(zhì)合成功能。核蛋白體包括RNA 和蛋白質(zhì)，直徑為20-25nm 。 32原核生物翻譯過程中核蛋白體結(jié)構(gòu)模式:A位：氨基酰位(aminoacyl site)P位：肽酰位(peptidyl site)E位：排出位(exit site)334、tRNA與氨基酸的活化反密碼環(huán) 氨基酸臂（Amino arm）34tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖35氨基酸 + tRNA氨基酰- tRNAATP AMPPPi氨基酰-tRNA合成酶氨基酰-tRNA合成酶 (aminoacyl-tRNA s

12、ynthetase)氨基酸的活化36第一步反應(yīng)氨基酸 ATP+E 氨基酰-AMP-E PPi 37第二步反應(yīng)氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E38氨基酰-tRNA合成酶對(duì)底物氨基酸和tRNA都有高度特異性。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(proofreading activity) 。氨基酰-tRNA的表示方法：Ala-tRNAAla Ser-tRNASerMet-tRNAMet 39補(bǔ)充說明： 大小亞基：小亞基結(jié)合mRNA和tRNA（A位氨基酰tRNA 和肽酰tRNA） 大亞基則催化肽鍵的形成。40翻譯的起始(initiation)翻譯的延長(zhǎng)(elongation

13、)翻譯的終止(termination )整個(gè)翻譯過程可分為 ：翻譯過程從閱讀框架的5-AUG開始，按mRNA模板三聯(lián)體密碼的順序延長(zhǎng)肽鏈，直至終止密碼出現(xiàn)。 5、蛋白質(zhì)生物合成過程41（1）肽鏈合成起始指mRNA和起始氨基酰-tRNA分別與核蛋白體結(jié)合而形成翻譯起始復(fù)合物 (translational initiation complex)。原核、真核生物各種起始因子的生物功能 促進(jìn)核蛋白體分離成大小亞基eIF-6促進(jìn)各種起始因子從小亞基解離，進(jìn)而結(jié)合大亞基eIF-5eIF-4F復(fù)合物成分，結(jié)合eIF-4E和PABeIF-4GeIF-4F復(fù)合物成分，結(jié)合mRNA5帽子eIF-4E結(jié)合mRNA，

14、促進(jìn)mRNA掃描定位起始AUGeIF-4BeIF-4F復(fù)合物成分，有解螺旋酶活性，促進(jìn)mRNA結(jié)合小亞基IF-4A最先結(jié)合小亞基促進(jìn)大小亞基分離eIF-2B，eIF-3促進(jìn)起始tRNA與小亞基結(jié)合eIF-2真核生物促進(jìn)大小亞基分離，提高P位對(duì)結(jié)合起始tRNA敏感性 IF-3促進(jìn)起始tRNA與小亞基結(jié)合 IF-2占據(jù)A位防止結(jié)合其他tRNAIF-1原核生物生物功能起始因子促進(jìn)核蛋白體分離成大小亞基eIF-6促進(jìn)各種起始因子從小亞基解離，進(jìn)而結(jié)合大亞基eIF-5eIF-4F復(fù)合物成分，結(jié)合eIF-4E和PABeIF-4GeIF-4F復(fù)合物成分，結(jié)合mRNA5帽子eIF-4E結(jié)合mRNA，促進(jìn)mRN

15、A掃描定位起始AUGeIF-4BeIF-4F復(fù)合物成分，有解螺旋酶活性，促進(jìn)mRNA結(jié)合小亞基IF-4A最先結(jié)合小亞基促進(jìn)大小亞基分離eIF-2B，eIF-3促進(jìn)起始tRNA與小亞基結(jié)合eIF-2真核生物促進(jìn)大小亞基分離，提高P位對(duì)結(jié)合起始tRNA敏感性-3促進(jìn)起始tRNA與小亞基結(jié)合-占據(jù)A位防止結(jié)合其他tRNAIF-1原核生物生物功能起始因子42原核生物翻譯起始復(fù)合物形成核蛋白體大小亞基分離；mRNA在小亞基定位結(jié)合；起始氨基酰-tRNA的結(jié)合； 核蛋白體大亞基結(jié)合。43lF1、3met-GTP-lF230S50SGDP+PilF2,fmetfmet30S50SlF1、3mRNAGTP44

16、與原核生物的差異 1）核蛋白體真核生物80S（40S+60S），原核生物70S; 2）起始因子（eIF）有10種，結(jié)構(gòu)上與原核IF差別很大； 3）起始蛋氨酰-tRNA不需甲酰化； 4）mRNA結(jié)構(gòu)不同，有5帽子結(jié)構(gòu)和3多聚A 5）起始復(fù)合物形成過程不同45起始過程1）大小亞基的解離2) Met-tRNAimet-GTP-eIF2eIF-3eIF4c小亞基463）mRNA結(jié)合到小亞基： 所需因子：eIF-3、eIF-1、eIF-4A、eIF-4B，由ATP提供能量。 結(jié)合過程：通過帽結(jié)合因子（CBP：eIF-4E、eIF-4F）與 mRNA 的帽結(jié)合，轉(zhuǎn)移至小亞基。mRNA在小亞基上向下游移動(dòng)，

17、使起始密碼 AUG在tRNAimet的反密碼位置結(jié)合，開始翻譯。4）通過eIF-5的作用，小亞基與大亞基結(jié)合，形成起始復(fù)合物。47帽結(jié)合蛋白（CBP）種類： CBP eIF-4E CBP eIF-4F 功能：與mRNA的帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合 CBP 具有解旋酶和ATP酶活性。48met40S60SMetMet40S60SmRNAeIF-2B、eIF-3、 eIF-6 elF-3GDP+Pi各種elF釋放elF-5ATPADP+PielF4E, elF4G, elF4A, elF4B,PABMetMet-tRNAiMet-elF-2 -GTP真核生物翻譯起始復(fù)合物形成過程49（2）肽鏈合成延長(zhǎng)指根據(jù)mR

18、NA密碼序列的指導(dǎo)，次序添加氨基酸從N端向C端延伸肽鏈，直到合成終止的過程。肽鏈延長(zhǎng)在核蛋白體上連續(xù)性循環(huán)式進(jìn)行，又稱為核蛋白體循環(huán)(ribosomal cycle)，每次循環(huán)增加一個(gè)氨基酸， 包括以下三步：進(jìn)位(entrance)成肽(peptide bond formation)轉(zhuǎn)位(translocation)50延伸過程所需蛋白因子稱為延長(zhǎng)因子(elongation factor, EF)原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts)、EF-G真核生物：EF-1 、EF-2 原核延長(zhǎng)因子生物功能對(duì)應(yīng)真核延長(zhǎng)因子EF-Tu促進(jìn)氨基酰-tRNA進(jìn)入A位，結(jié)合分解GTPEF-1-EF-Ts調(diào)節(jié)亞基EF-1-EFG有轉(zhuǎn)位酶活性，促進(jìn)mRNA-肽酰-tRNA由A位前移到P位，促進(jìn)卸載tRNA釋放EF-251又稱注冊(cè)(registration)進(jìn)位指根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導(dǎo)，使相應(yīng)氨基酰-tRNA進(jìn)入核蛋白體A位。 52成肽是由轉(zhuǎn)肽酶(transpeptidase)催化的肽鍵形成過程。53轉(zhuǎn)位延長(zhǎng)因子EF-G有轉(zhuǎn)位酶( translocase )活性，可結(jié)合并水解1分子GTP，促進(jìn)核蛋白體向mRNA的3側(cè)移動(dòng) 。54進(jìn)位轉(zhuǎn)位成肽55真核生物肽鏈合成的延長(zhǎng)過程與原核基本相似，但有不同的反應(yīng)體系和延長(zhǎng)