分子生物學(xué)基礎(chǔ)了解

1、第五章 分子生物學(xué)研究方法1 分子生物學(xué)研究之所以從20世紀(jì)中葉開(kāi)始得到高速發(fā)展，其中最主要的原因就是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細(xì)胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增等核心技術(shù)2基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)的過(guò)程.基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征：具有跨越天然物種屏障、把來(lái)自任何生物的基因置于毫無(wú)親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞

2、之中的能力。本章將在回顧重組DNA技術(shù)史上主要事件的基礎(chǔ)上，討論DNA操作技術(shù)、基因克隆的常用載體系統(tǒng)以及基因的分離與鑒定等三個(gè)環(huán)節(jié)。 34三大成就 ：1. 40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題；BacterialStrainInjectionResultsLiving S cellsLiving R cellsHeat killed S cellsHeat killed S cells mixed with living R cellsLiving S cells in blood sample from dead mousecaps

3、ule1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae51952年Hershey和Chase證實(shí)噬菌體DNA侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)62. 50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；X-ray sourceCrystallized DNARosalind FranklinMaurice WilkinsPhotographicfilm1953- Franklin & Wilkins7Description of the 3-D str

4、ucture of DNAFrancis Crick & James Watson8Conservative ModelSemiconservative ModelFrank StahlMatt MeselsonParent cellFirst replicationSecond replication1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway93. 50年代末至60年代，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說(shuō),成

5、功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。Jacob and Monod10但是，如果沒(méi)有分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學(xué)家就無(wú)法對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。 11兩大技術(shù)保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber 發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了 DNA 連接酶DNA ligase covalently links two DNA strands RestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase353512Herbert Boyer,Stanley Cohen1972年獲得第一個(gè)重組DNA分子Herber

6、t Boyer1314重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的主要工具酶酶 類功 能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開(kāi)DNADNA連接酶通過(guò)磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5到3方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5-OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或用來(lái)進(jìn)行DNA的連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3末端逐個(gè)切除單核苷酸噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5末端逐個(gè)切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5或3末端的磷酸

7、基團(tuán) 到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開(kāi)，以供下一步研究。 151972 - Paul Berg,Produced first recombinant DNA using EcoRIEcoRI recognition sites phage DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky endSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant DNA16 僅僅能在體

8、外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組遠(yuǎn)不能滿足基因研究的需要。 DNA片段在體外不具備自我復(fù)制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。 這就是基因克隆，或分子克隆 。 17分子克隆的載體-具備自主復(fù)制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。18從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量氯化鈣處理后，能有效地吸收噬菌體DNA。1972年，Cohen等人又報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大

9、腸桿菌細(xì)胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。191973 - Boyer, Cohen & ChangTransform E. coli with recombinant plasmidStanley Cohen & Annie ChanHerbert BoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE. coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells plated onto medium with kanamycin and tetrac

10、yclineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies20表明： （1）像pSC101這樣的質(zhì)粒DNA分子可以作為基因克隆的載體，從而把外源DNA導(dǎo)入寄主細(xì)胞；（2）像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)；（3）質(zhì)粒DNA-大腸桿菌細(xì)胞作為一種成功的基因克隆體系，有可能在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。212.DNA的核苷酸序列分析技術(shù) DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來(lái)的一門(mén)重要的DNA技術(shù)學(xué)，這門(mén)技術(shù)，對(duì)于從分子水平上研究基因的

11、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價(jià)值。22General process of gene engineering1. 從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2. 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。3. 將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。4. 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。235. 將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間

12、的關(guān)系。245.2 DNA操作技術(shù)5.2.1 核酸的凝膠電泳 自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來(lái)，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如： DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。255.2.1.1 基本原理 一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜

13、帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說(shuō)，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。由于在電泳中往往使用無(wú)反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，故電泳的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。 已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，因此，根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過(guò)電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開(kāi)來(lái)。26 在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（polyanions），把這些核酸分子放置在電場(chǎng)當(dāng)中，它們就會(huì)向正電極的方向

14、遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。大分子量的DNA移動(dòng)的慢小分子量的DNA移動(dòng)的快電泳緩沖液陽(yáng)極陰極DNA加樣孔272829瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.250kb之間30聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個(gè)堿基對(duì)到1000個(gè)堿基對(duì)之間31凝膠類型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50 0001 0000.7%瓊脂糖20 0001 0001.4%瓊脂糖6 00

15、03004.0%聚丙烯酰胺1 00010010.0%聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺501 凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。 32在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（ethidium bromide，簡(jiǎn)稱EtBr）染料對(duì)核酸分子進(jìn)行染色，然后將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地檢測(cè)出來(lái)。在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的DNA分子發(fā)出熒光33稱樣溶解加熱制

16、板倒膠電泳操作基本程序34取樣點(diǎn)樣電泳檢測(cè)35結(jié)果365.2.2 核酸的分子雜交 將帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段就會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來(lái)自不同的生物有機(jī)體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。37 不同溫度下DNA的構(gòu)型變化一 DNA/DNA的雜交作用，可以用來(lái)檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間是否存在著親緣關(guān)系，而形成DNA/RNA間雜種分子的能力可被用來(lái)揭示核酸片段中某一特定基因的位置。38 不同溫度下DNA的構(gòu)型變化二39 在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過(guò)毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝

17、膠中的位置原封不動(dòng)地“吸印”上去的，因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交”。Southern Blotting E.M. Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來(lái)的。材料：尼龍濾膜 硝酸纖維素濾膜 二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）步驟：第一，將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上核酸印跡轉(zhuǎn)移電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法第二，是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交40雜交模式圖放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交41Southern Blotting的過(guò)程1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過(guò)電泳液的移動(dòng)轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固

18、定膠中的DNA4.預(yù)雜交和雜交（放射性和熒光檢測(cè)）5.結(jié)果檢測(cè)42 在理想條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即便每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測(cè)出來(lái)。由于放射性同位素對(duì)人體的危害，近年來(lái)又發(fā)展了熒光法檢測(cè)雜交信號(hào)的技術(shù)，雖然靈敏度略低于同位素法，卻使核酸雜交實(shí)驗(yàn)變得更為安全。常用的熒光染料：C5、C3等432.Northern blotting（諾賽恩RNA印跡技術(shù)） 是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。Northern Hybridization Isolate mRNA (Differe

19、nt Lengths) Probe with labeled DNA443.Western blotting（韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)） 將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)。Step 1. Antibody Recognitionof target protein/antigenStep 2. Secondary Antibodyrecognition of primary AbStep 3. Color Development45檢測(cè)重組體克隆的菌落雜交技術(shù)原位雜交46In situ hybridizationLocalizati

20、on of DNALocalization of RNA471.將快速生長(zhǎng)中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。 所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。 處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。5.2.3 細(xì)菌轉(zhuǎn)化步驟：482.與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細(xì)胞表面的復(fù)合物。 3.立即將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會(huì)被細(xì)胞所吸收。4.在全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)、

21、細(xì)胞活性恢復(fù)5. 涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。495.2.4基因擴(kuò)增 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。DNA 聚合酶具有在核苷酸底物的存在下，以一條DNA鏈為模板催化新鏈的合成需要具有 3 -OH 的引物具有 5 到3 方向聚合的能力通常具有 3到 5 外切酶活性50 PCR技術(shù)的原理并不復(fù)雜：51一DNA 體外擴(kuò)增技術(shù) 1.PCR反應(yīng)體系 1) 基本原理 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：52PCR Cycle

22、- Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意圖模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；53PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer

23、 253553533模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；54PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dN

24、TP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈。55End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。56Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplico

25、n2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon572.降低反應(yīng)溫度（約50），致冷1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上;3.將反應(yīng)混合物的溫度上升到72左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按53方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈1.首先是將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在高溫（

26、91）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA；4.重復(fù)以上操作PCR的過(guò)程DNA解鏈（變性）引物與模板DNA相結(jié)合（退火）DNA合成（鏈的延伸）58一次循環(huán)2二次循環(huán)4三次循環(huán)8兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應(yīng)是2n59PCR儀605.2.5 核苷酸序列分析1968年 華裔科學(xué)家吳瑞設(shè)計(jì)出引物延伸測(cè)序策略Sanger在它的基礎(chǔ)之上發(fā)展了快數(shù)測(cè)定DNA的末端終止法K Mullis完善了PCR擴(kuò)增DNA方法615.2.5.1. Sanger雙脫氧鏈終止法(dideoxy-termination sequencing) 原理：雙脫氧（2，3）-核苷酸可以象2

27、-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3 端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長(zhǎng)度的DNA片段測(cè)定出核苷酸序列。不能和下一個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接起來(lái)62AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53添加 DNA polymerase所有4 dNTPs其中一種標(biāo)記的ddNTPddTTP ddCTP ddGTP ddATP在四個(gè)不同的反應(yīng)管中各只包含一種ddNTP.63AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGAT

28、reactionC reactionG reactionA reaction每一管中的復(fù)制的序列都停留在ddNTPs 處564反應(yīng)終止后，四個(gè)反應(yīng)管中的反應(yīng)混合液分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離.這四個(gè)反應(yīng)管中延伸的寡核苷酸僅相差一個(gè)堿基.電泳結(jié)構(gòu)通過(guò)顯色指示. T C G A3CCTTTAGCT565 過(guò)程：制備ss-DNA與引物退火分為4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)每個(gè)系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標(biāo)記）和一種雙脫氧核苷酸DNA聚合酶定序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳凝膠干燥放射自顯影。 該法亦適合mRNA的序列分析。 GC富集區(qū)常出現(xiàn)“隱影”或“停止”現(xiàn)象，如在反應(yīng)中加入dITP（脫氧三磷酸次黃嘌呤）或

29、脫氧三磷酸-7-脫氧鳥(niǎo)苷可解決GC富集區(qū)的測(cè)序。662. DNA定序的一般程序 酶法測(cè)序(Sanger) 化學(xué)測(cè)序法(Maxam-Gilbert) 待測(cè)DNA片段 待測(cè)DNA片段 次克隆 5-末端標(biāo)記 篩選重組子 鏈分離 限制酶切 模板增殖與純化 純化標(biāo)記的ss-DNA 與引物退火 定序反應(yīng) 定序反應(yīng) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 真空干燥 放射自顯影 閱讀序列和計(jì)算機(jī)錄入 核苷酸序列的分析與比較67二. DNA序列測(cè)定的自動(dòng)化 1. DNA測(cè)序步驟與自動(dòng)化 1）模板制備 可自動(dòng)化 2）定序反應(yīng) 可自動(dòng)化 3）凝膠電泳 自動(dòng)化有一定困難：制膠，點(diǎn)樣，電泳，凝膠干燥，放射自顯影。 4）核苷酸序列閱讀與計(jì)算

30、機(jī)輸入 可自動(dòng)化 2.自動(dòng)測(cè)序儀 Conney等人于1987年設(shè)計(jì)了不同熒光染料標(biāo)記引物，然后做鏈終止測(cè)序，用激光掃描閱讀序列。 紅色引物+T反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黃色引物+G反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 綠色引物+A反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddATP） 蘭色引物+C反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddCTP）6869優(yōu)點(diǎn)：i. 四個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)可合并點(diǎn)樣，大大節(jié)省制膠和點(diǎn)樣時(shí)間； ii. 可同時(shí)讀出多個(gè)樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射自顯影； iii.可連續(xù)電泳，可讀出較多的核苷酸序列。缺點(diǎn)：無(wú)法保留原始記錄, 四個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)在一條道上,

31、相互間會(huì)發(fā)生干擾, 導(dǎo)致讀序時(shí)分辨率下降。DNA序列分析自動(dòng)化包括兩個(gè)方面的內(nèi)容，一是指“分析反應(yīng)”的自動(dòng)化，另一方面則是指“讀片過(guò)程”的自動(dòng)化。70715.2.5.3.雜交測(cè)序自從70年代末期DNA測(cè)序技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，人們已經(jīng)做了大量重要的改進(jìn)，但從根本原理上創(chuàng)新的則只有雜交測(cè)序法（sequencing by hybridization，SBH）一種。它利用一組已知序列的寡核苷酸短序列作探針，同某一特定的較長(zhǎng)的靶DNA分子進(jìn)行雜交，從而測(cè)定其核苷酸的序列。 DNA雜交測(cè)序?qū)嵸|(zhì)上包括兩個(gè)主要的步驟首先是將待測(cè)定的靶DNA分子同一組已知其核苷酸順序的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，然后與那些能夠同靶DNA形

32、成完全的雙鏈雜合分子的寡核苷酸探針做比較分析，并據(jù)此推算出靶DNA的核苷酸序列。72如果將一種核苷酸順序?yàn)?-AGCCTAGCTGAA-3的12-mer的靶DNA，與一組完全隨機(jī)的8-mer寡核苷酸探針混合雜交，在總數(shù)為48=65 536種的8-mer探針群體中，僅有5種會(huì)與靶DNA形成完全互補(bǔ)的雙鏈體分子。根據(jù)這5種發(fā)生了完全雜交作用的8-mer寡核苷酸探針之間的重疊序列的線性關(guān)系，便可推算出這段12-mer的靶DNA分子的核苷酸順序。 當(dāng)然，這只是一種理想化狀態(tài)，實(shí)際上此種雜交模式要復(fù)雜得多，因?yàn)槟切](méi)有同靶DNA片段完全互補(bǔ)的寡核苷酸探針，也仍然會(huì)與之形成不穩(wěn)定的雙鏈分子。73上圖是兩條

33、長(zhǎng)度均為17-mer的靶DNA片段I和II的雜交測(cè)序結(jié)果，兩者僅在第8位堿基有不同，分別為C和T。靶DNA片段I可與18共8段彼此相互重疊的8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子，但不能與第9段8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子。根據(jù)相鄰的兩段8-mer寡核苷酸之間各自具有7個(gè)堿基的重疊情況，可以構(gòu)建出互補(bǔ)的DNA序列。靶DNA片段II的雜交結(jié)果表明，橫跨其第8位堿基T的6段8-mer寡核苷酸的雙鏈體，由于含有內(nèi)部的堿基錯(cuò)配，因此其雜交效率明顯下降；但與第1和第8兩段8-mer寡聚體形成的具有末端G-T錯(cuò)配的雙鏈分子，其穩(wěn)定性下降并不顯著。與第9段8-mer寡核苷酸能雜交形成完全的雙鏈體分子，

34、證實(shí)與片段I相比，它在第8位發(fā)生了由C堿基到T堿基的變化。74（基因芯片測(cè)序)75基因芯片測(cè)序流程765.2.6.1. 凝膠阻滯試驗(yàn) 凝膠阻滯試驗(yàn)（gel retardation assay），又叫作DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（DNA mobility shift assay），是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，裸露的DNA朝正電極移動(dòng)的距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比。如果此時(shí)DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，在特定電壓和時(shí)間內(nèi)朝正電極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)縮短了。所以，當(dāng)某個(gè)DNA片段與細(xì)胞提取物

35、混合之后，若它在凝膠電泳中的移動(dòng)距離變小了，就說(shuō)明它可能已與提取物中的某種特殊蛋白質(zhì)分子相結(jié)合了。5.2.6 DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究77凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理圖放射性標(biāo)記的DNA由于與一種細(xì)胞蛋白質(zhì)B結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動(dòng)速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影*凝膠電泳放射性標(biāo)記的DNA細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合*BDNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合785.2.6.2. DNaseI足跡試驗(yàn) 在DNaseI足跡試驗(yàn)（DNA foot-printing assay）過(guò)程中，首先將待檢測(cè)的雙鏈DNA分子用32P作末端標(biāo)記，并用限制性內(nèi)切酶去

36、掉其中的一個(gè)末端，得到只有一條鏈的單個(gè)末端標(biāo)記的雙鏈DNA分子，與細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物混合。待二者結(jié)合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿著靶DNA作隨機(jī)單鏈切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之達(dá)到平均每條DNA鏈只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂。如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特異蛋白質(zhì)，經(jīng)DNaseI消化之后便會(huì)產(chǎn)生出距放射性標(biāo)記末端1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)核苷酸等等一系列前后長(zhǎng)度均僅相差一個(gè)核苷酸的連續(xù)的DNA片段梯度群體。 如果有一種蛋白質(zhì)已經(jīng)結(jié)合到DNA分子的某一特定區(qū)段上，那么，它就將保護(hù)這一區(qū)段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能產(chǎn)生出相應(yīng)長(zhǎng)度的切割條帶。在電泳凝膠的放射自

37、顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位是沒(méi)有放射標(biāo)記條帶的，出現(xiàn)了一個(gè)空白的區(qū)域，人們形象地稱之為“足跡”。7932p1 5 10*1 4 8 10*加入蛋白質(zhì)X加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影1510A B足跡(a)(c)(b)DNaseI 足跡實(shí)驗(yàn)805.3 基因克隆的主要載體系統(tǒng) 1. 至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。 2.至少應(yīng)有一個(gè)克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入。 3.至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞 4.安全性大腸桿菌載體pBR322結(jié)構(gòu)圖 載體特點(diǎn)基因工程載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞自主復(fù)制

38、的DNA分子。815.3.1 質(zhì)粒DNA及其分離純化 細(xì)菌質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體并能自主復(fù)制的遺傳成份。絕大多數(shù)的質(zhì)粒都是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復(fù)制子，也有線性質(zhì)粒 的報(bào)道。 質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，也可能在一定的條件下被可逆性整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。 應(yīng)用質(zhì)粒作為基因克隆的載體分子，最重要的前提是要獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。82 Ecoli的質(zhì)粒種類 1) colE1因子（大腸桿菌素因子）多數(shù)不能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移DNA，屬高拷貝松弛型。 2) R因子（抗藥性因子） 可接合轉(zhuǎn)移DNA，屬低拷貝 嚴(yán)緊型，

39、質(zhì)粒較大，操作不便 3) F因子（性因子）83關(guān)鍵步驟：寄主細(xì)胞的裂解作用是分離質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)操作。 通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來(lái)促使大腸桿菌細(xì)胞裂解。如果寄主細(xì)胞沒(méi)有完全裂解，就會(huì)顯著降低質(zhì)粒DNA的回收率。假如細(xì)胞裂解反應(yīng)相當(dāng)溫和，同時(shí)實(shí)驗(yàn)操作又十分謹(jǐn)慎仔細(xì)，那么絕大部分的染色體DNA分子都將以高分子量的形式釋放出來(lái)，可以用高速離心的方法使之與細(xì)胞碎片一起被沉淀除去，得到高純度的質(zhì)粒DNA。84質(zhì)粒載體DNA的分離 關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體DNA分開(kāi) 原理：質(zhì)粒DNA比染色體DNA 小得多，在DNA抽提過(guò)程中，染色體DNA斷裂成小片段(線狀)，質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋

40、構(gòu)型變性法： 變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒DNA RF型的分離, 質(zhì)粒DNA的氯霉素?cái)U(kuò)增使用并不廣泛（菌株和載體）855.3.1.1. 氯化銫密度梯度離心法 實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)胞裂解及DNA分離的過(guò)程中，大分子量的細(xì)菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應(yīng)的線性片段，而質(zhì)粒DNA則由于其分子量較小、結(jié)構(gòu)緊密，因此仍能保持完整的狀態(tài)。這種差別對(duì)質(zhì)粒DNA的純化是十分有用的。上清液 加入固體CsCl與EtBr溶液 室溫下超速離心(45,000rpm）16小時(shí) 穿孔取出DNA（320nm） 異丙醇抽提溴乙錠 緩沖液透析除去殘余CsCl 兩倍體積冷乙醇沉淀DNA 離心、洗滌、干

41、燥865.3.1.2. 堿變性法 通過(guò)氯化銫-EtBr密度梯度離心法雖然可以得到高純度、高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，但它操作復(fù)雜，需要價(jià)格昂貴的氯化銫和超速離心機(jī)設(shè)備，而且溴化乙錠又是一種致癌物質(zhì)，如果操作不慎，不僅會(huì)造成環(huán)境污染，還會(huì)危及實(shí)驗(yàn)工作人員的身心健康。 實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，在pH值介于12.012.5的條件下加熱DNA溶液，使染色體DNA變?yōu)閱捂?，而質(zhì)粒DNA仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)變性條件發(fā)生迅速變化時(shí)，前者仍不能復(fù)性，而后者又可回復(fù)到天然構(gòu)型。 隨機(jī)斷裂產(chǎn)生的線性染色體DNA分子，彼此已經(jīng)分離的互補(bǔ)鏈之間的復(fù)性作用就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，往往聚集形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)及RNA一道被離心沉淀下來(lái)

42、。 用酒精沉淀法可以收集仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒DNA。875.3.2 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體5.3.2.1. pSC101質(zhì)粒載體 pSC101是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有12個(gè)拷貝。其分子大小為9.09kb，編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（tetr）。 pSC101質(zhì)粒不僅具有可插入外源DNA的多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的單克隆位點(diǎn)，而且還具有四環(huán)素抗性的強(qiáng)選擇記號(hào)，因此，它被選為第一個(gè)真核基因的克隆載體。當(dāng)然，這個(gè)質(zhì)粒載體也有其明顯的缺點(diǎn)，它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSC101 DNA，其產(chǎn)量就要比其它質(zhì)粒載體低得多。8

43、85.3.2.2.ColE1質(zhì)粒載體 ColE1質(zhì)粒屬于松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。在正常生長(zhǎng)條件下，當(dāng)培養(yǎng)基中用于蛋白質(zhì)合成的氨基酸被耗盡，或是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)也隨之停止。此時(shí)，松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒DNA仍然可以繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制達(dá)數(shù)小時(shí)之久，使每個(gè)寄主細(xì)胞中所累積的ColE1質(zhì)?？截悢?shù)增加到10003000個(gè)之多，質(zhì)粒DNA大約可占細(xì)胞總DNA的50%左右。由此可見(jiàn)，由于質(zhì)?？截悢?shù)高，插入的外源DNA片段的產(chǎn)量也就得到相應(yīng)的提高。895.3.2.3. pBR322質(zhì)粒載體為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，有必要用人工的方法構(gòu)

44、建一種既帶有多種抗藥性的強(qiáng)選擇記號(hào)、又具有低分子量、高拷貝、以及外源DNA插入不影響復(fù)制功能的多種限制性核酸內(nèi)切酶單切割位點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)的新的質(zhì)粒載體。 pBR322質(zhì)粒是由三個(gè)不同來(lái)源的部分組成的：第一部分來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；第二部分來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tertr）；第三部分則來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）。12390第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具有較小的分子量，其長(zhǎng)度為4,363bp。由于分子量小，不僅易于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起來(lái)仍較為便利。第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具有兩種抗生素抗性基因以

45、用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。質(zhì)粒DNA編碼的抗生素抗性基因的插入失活效應(yīng)，是檢測(cè)重組體質(zhì)粒的一種十分有用的方法。第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞中可累積10003000個(gè)拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)915.3.2.4.pUC質(zhì)粒載體pUC系列質(zhì)粒載體包括如下四個(gè)部分：(i)來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；(ii)氨芐青霉素抗性基因（ampr），但它的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來(lái)的限制性核酸內(nèi)切酶的單識(shí)別位點(diǎn)；(iii)大腸桿菌-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因；(i

46、v)位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，它并不破壞該基因的功能。92 第一，更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時(shí)，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復(fù)制起點(diǎn)，使其分子縮小了許多，如pUC8為2 750bp，pUC18為2 686bp。同時(shí)，由于rop基因缺失，使pUC8質(zhì)粒的拷貝數(shù)比帶有pMB1或ColE1復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體都要高得多，不經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)增，平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá)500700個(gè)拷貝。 第二，可用組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來(lái)自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補(bǔ)作用。因此，可用X-gal

47、顯色法實(shí)現(xiàn)對(duì)重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。 第三，具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8質(zhì)粒載體上。pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：935.3.2.5. pGEM-3Z質(zhì)粒 pGEM-3Z是一種與pUC系列十分類似的小分子質(zhì)粒載體，總長(zhǎng)度為2,743bp，編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)lacZ基因。 pGEM-3Z具有兩個(gè)來(lái)自噬菌體的啟動(dòng)子，即T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子，它們?yōu)镽NA聚合酶的附著作用提供了特異性的識(shí)別位點(diǎn)。由于這兩個(gè)啟動(dòng)子分別位于lacZ基因中多克隆位點(diǎn)區(qū)的兩側(cè)，故若在反應(yīng)試管中加入純化的T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的

48、外源基因便會(huì)轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。質(zhì)粒載體pGEM-4Z和pGEM-3Z在結(jié)構(gòu)上基本相似，兩者之間的差別僅僅在于SP6和T7這兩個(gè)啟動(dòng)子的位置互換、取向相反而已。94大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，含有兩種分別來(lái)自大腸桿菌和釀酒酵母的復(fù)制起點(diǎn)與選擇標(biāo)記。它使研究工作者可以自如地在這兩種不同的寄主細(xì)胞之間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因，并單獨(dú)或同時(shí)在兩種寄主細(xì)胞中研究目的基因的表達(dá)活性及其它調(diào)節(jié)功能。例如，可將酵母的某種基因亞克隆到穿梭質(zhì)粒載體上，置于大腸桿菌中進(jìn)行定點(diǎn)突變處理后，再把突變體基因返回到酵母細(xì)胞，以便在天然寄主中觀察研究此種突變的功能效應(yīng)。大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體955.3.3 噬菌體載體 噬菌體

49、是一類細(xì)菌病毒的總稱，英文名叫作Bacteriophage，來(lái)源于希臘文“phagos”，如同質(zhì)粒分子一樣，噬菌體也可以用于克隆和擴(kuò)增特定的DNA片段，是一種良好的基因克隆載體。作為細(xì)菌寄生物的噬菌體，它可以在脫離寄主細(xì)胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但一旦脫離了寄主細(xì)胞，就既不能生長(zhǎng)也不能復(fù)制，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的噬菌體只能利用寄主核糖體、合成蛋白質(zhì)的因子、各種氨基酸及能量代謝體系進(jìn)行生長(zhǎng)和增殖。96我們將只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體叫作烈性噬菌體。而溶源生長(zhǎng)周期是指在感染過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA被整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個(gè)組成部分。具有這種溶源周期的噬菌體，叫作溫和噬菌

50、體。 以噬菌體DNA分子作載體，克隆含有目的基因的外源DNA片段，如果沒(méi)有導(dǎo)致重要的噬菌體基因失活，那么當(dāng)這種重組的噬菌體DNA分子感染了寄主細(xì)胞之后，插入的外源DNA片段便會(huì)隨著噬菌體DNA分子一道增殖。用放射性同位素32P標(biāo)記的特異性探針作噬菌斑放射自顯影雜交，可以十分敏感地檢測(cè)出含有這種重組體DNA分子的噬菌斑（即陽(yáng)性斑點(diǎn)）。獲得了陽(yáng)性噬菌斑之后，我們就可按照類似于制備質(zhì)粒DNA的方法，分離到大量的重組體噬菌體DNA，實(shí)現(xiàn)克隆基因的擴(kuò)增。97 噬菌體可被分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。98噬菌體整個(gè)基因組可分為三個(gè)部分左臂：從A到J長(zhǎng)約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)

51、組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。中段：長(zhǎng)約20kb，是DNA整合和切出，溶原生長(zhǎng)所需的序列。右臂：長(zhǎng)約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長(zhǎng)最重要的調(diào)控基因和序列、以及DNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。 左右臂包含DNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，中段是非必需的。 99 在噬菌體線性雙鏈DNA分子的兩端，各有一條由12個(gè)核苷酸組成的彼此完全互補(bǔ)的5單鏈突出序列，即通常所說(shuō)的粘性末端。注入到感染寄主細(xì)胞內(nèi)的噬菌體的線性DNA分子，會(huì)迅速地通過(guò)粘性末端之間的互補(bǔ)作用，形成環(huán)形雙鏈DNA分子。隨后在DNA連接酶的作用下，將相鄰的5-P和3-OH基團(tuán)封閉起來(lái)

52、，并進(jìn)一步超盤(pán)繞。這種粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點(diǎn)（cohesive-end site，粘性末端位點(diǎn).1005.3.3.1.插入型載體 外源的DNA克隆到插入型載體分子上，就會(huì)使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應(yīng)。根據(jù)插入失活效應(yīng)的特異性，插入型載體又可以進(jìn)一步被分為免疫功能失活和大腸桿菌-半乳糖苷酶失活兩種亞型。(1) 免疫功能失活插入型載體。這類載體的基因組中有一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種限制性核酸內(nèi)切酶的單切割位點(diǎn)。當(dāng)外源DNA片段插入到這種位點(diǎn)上時(shí)，就會(huì)破壞載體所具有的合成功能性阻遏物的能力，阻礙其進(jìn)入溶源周期。因此，凡帶有外源DNA插入的重組體都只能形成清晰

53、的噬菌斑，而沒(méi)有外源DNA插入的親本噬菌體就會(huì)形成混濁的噬菌斑。這種形態(tài)學(xué)上的差異，為分離重組體分子提供了方便的標(biāo)志。(2) -半乳糖甙酶失活插入型載體。許多種載體的基因組中含有大腸桿菌的lacZ區(qū)段，編碼-半乳糖苷酶基因lacZ。由這種載體感染大腸桿菌的lac-指示菌，涂布在補(bǔ)加有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基平板上，會(huì)形成藍(lán)色的噬菌斑，但在克隆過(guò)程中，如果外源DNA插入到lacz區(qū)段上，阻斷了-半乳糖苷酶基因lacZ的編碼序列，那么由這種重組體感染的lac-指示菌，由于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成無(wú)色的噬菌斑。1015.3.3.2.替換型載體 替換型載體又叫作取代型載體（substitut

54、ion vector）是一類在噬菌體基礎(chǔ)上改建的、在其中央部分有一個(gè)可以被外源插入DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體。在構(gòu)建此類載體時(shí)，安排在中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，因此當(dāng)外源DNA插入時(shí)，一對(duì)克隆位點(diǎn)之間的DNA片段便會(huì)被置換掉，從而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。102 “cosmid”一詞是由英文“cos site-carrying plasmid”縮寫(xiě)而成的，其原意是指帶有粘性末端位點(diǎn)的質(zhì)粒。因此我們說(shuō)，所謂柯斯質(zhì)粒其實(shí)是一類由人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。在柯斯質(zhì)粒載體pHC79中，除cos位點(diǎn)之外，其兩側(cè)還具有與噬

55、菌體包裝有關(guān)的DNA短序列。質(zhì)粒DNA部分則是一個(gè)完整的復(fù)制子，包括一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和兩個(gè)抗菌素抗性基因ampr和tetr。很明顯，pHC79柯斯質(zhì)粒兼具了噬菌體載體和pBR322質(zhì)粒載體兩方面的優(yōu)點(diǎn)，其克隆能力為3145kb，而且能夠被包裝成為具有感染能力的噬菌體顆粒。5.3.4 柯斯質(zhì)粒載體103用限制性內(nèi)切酶處理質(zhì)粒和噬菌體，再將cos位點(diǎn)拼接到質(zhì)粒上再酶切位點(diǎn)將重組質(zhì)粒線形化，再插入相應(yīng)的基因組DNA 通過(guò)含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)平板篩選存活的細(xì)胞可能含有相應(yīng)的重組質(zhì)粒104第一，具有噬菌體的特性。柯斯質(zhì)粒載體在克隆了合適長(zhǎng)度的外源DNA，并在體外被包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效轉(zhuǎn)染對(duì)噬

56、菌體敏感的大腸桿菌寄主細(xì)胞。進(jìn)入寄主細(xì)胞之后的柯斯質(zhì)粒DNA分子，能按照噬菌體DNA同樣的方式環(huán)化。第二，具有質(zhì)粒載體的特性。柯斯質(zhì)粒載體具有質(zhì)粒復(fù)制子，因此能像質(zhì)粒DNA一樣在寄主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，并且能在氯霉素作用下，獲得進(jìn)一步擴(kuò)增。此外，柯斯質(zhì)粒載體通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重組體分子表型選擇標(biāo)記，其中有一些還帶上基因插入失活的克隆位點(diǎn)。第三，具有高容量的克隆能力?？滤官|(zhì)粒載體的分子僅具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一兩個(gè)選擇記號(hào)和cos位點(diǎn)等三個(gè)組成部分，其分子量較小，一般只有57kb左右。因此，可以插入到柯斯質(zhì)粒載體上并能被包裝成噬菌體顆粒的最大外源DNA片段，即柯斯質(zhì)粒載體的克隆極限可達(dá)4

57、5kb左右?？滤官|(zhì)粒載體的特點(diǎn)：105 pBluescript是專用的商品名稱，系指由Stratagene公司發(fā)展的一類從pUC載體派生而來(lái)的噬菌粒載體，簡(jiǎn)稱為pBS（+/-），如今則更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。 SK表示多克隆位點(diǎn)區(qū)的一種取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向轉(zhuǎn)錄；（+/ -）表示單鏈?zhǔn)删wf1復(fù)制起點(diǎn)的兩種相反的取向。f1（+）起點(diǎn)表示當(dāng)pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時(shí)，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1（-）起點(diǎn)則表示當(dāng)pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體

58、共感染寄主細(xì)胞時(shí)，可回收到lacZ基因的無(wú)意義鏈DNA。5.3.5 pBluescript噬菌粒載體106(i) 在多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對(duì)T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子，用以定向指導(dǎo)插入在多克隆位點(diǎn)上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；(ii) 同時(shí)具有一個(gè)單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無(wú)輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復(fù)制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；(iii) 編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標(biāo)記；(iv) 含有一個(gè)lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學(xué)顯色法篩選噬菌粒載體的

59、重組子。1075.4 基因的分離與鑒定克隆： 多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上:表示由具有相同基因型的同一物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體，所以說(shuō)，從同一受精卵分裂而來(lái)的單卵雙生子（monozygotic twins）便是屬于同一克隆。在細(xì)胞水平上:指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitor cell）分裂而來(lái)的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體?；静襟E： (1) 用于基因克隆的DNA材料的選擇以及DNA分子的片段化；(2) 外源DNA片段與載體分子的體外連接反應(yīng)；(3) 將人工重組的DNA分子導(dǎo)入它們能夠進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞；(4) 重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選。108109110克隆基因的分離1、應(yīng)

60、用核酸探針?lè)蛛x克隆目的基因2、應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)分離克隆目的基因3、應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因4、應(yīng)用酵母雙雜交體系克隆基因5、基因的圖位克隆法6、DNA微列陣技術(shù)進(jìn)行基因克隆111 基因克隆的第一步是要從實(shí)驗(yàn)材料中制備包括“目的基因”在內(nèi)的DNA片段群體，而且這個(gè)DNA片段群體必須包容整個(gè)基因組的全部序列，DNA片段的大小要適合于基因操作的要求。最簡(jiǎn)單的辦法是利用限制性核酸內(nèi)切酶消化供體基因組DNA，并直接將消化產(chǎn)物與載體分子相連接。這個(gè)被稱為鳥(niǎo)槍法（shot-gun approach）的方法最明顯的缺點(diǎn)，是所形成的重組體分子帶有大小不同的插入片段。由于高等真核生物的基因組龐大，按