儀器分析版本

1、 丁卓平 教授,2011-09-05現(xiàn)代儀器分析Instrumental Analysis1第一章 色譜分析法 （Chromatography)第一節(jié) 緒論第二節(jié) 氣相色譜法第三節(jié) 高效(壓)液相色譜法第四節(jié) 薄層色譜(TLC)21.色譜分析概論 傅若農(nóng) 化學工業(yè)出版社2000年10月第1版2.氣相色譜方法及應用劉虎威 化學工業(yè)出版社2000年10月第1版 3.高壓液相色譜方法及應用于世林 化學工業(yè)出版社2000年10月第1版4.儀器分析劉密新 清華工業(yè)出版社2002年8月第2版參考書3工具書李浩春等 氣相色譜法 北京科學出版社1993李浩春等 分析化學手冊第二版 氣相色譜分析 北京化學工業(yè)出

2、版社1999張玉奎主編 液相色譜分析 北京化學工業(yè)出版社2000 朱良漪主編 分析儀器手冊 北京化學工業(yè)出版社19974期刊分析化學 色譜分析測試通報藥物分析雜志J. of Chromatography(荷蘭）1958年創(chuàng)刊 J. of Chromatography science(美國）J. of Hight Resilution Chromatography, HRC(德)5期刊Chromatography (德)J. of Liquid Chromatography & Related techniques(液相色譜為主）J. of Capillary Electrophoresis(毛

3、細管電泳）Analytical Chemistry (美國)6第一節(jié)緒論一、什么是色譜法二、色譜名稱的由來三、色譜法的發(fā)展四、色譜法的現(xiàn)狀和未來五、色譜法的定義與分類六、色譜法的特點和優(yōu)點7第一章 色譜分析法（Chromatography)第一節(jié)緒論一、什么是色譜法 色譜法又名色層法、層析法，是一種用以分離、分析多組分混合物的極有效的物理及物理化學分析方法。二、色譜名稱的由來 色譜法是由俄國植物學家Tswett(茨維特）于1903年在波蘭華沙大學作了“葉綠素在碳酸鈣上分離”的演講時首先提出來,1906年他發(fā)表了第一篇關于色譜法的論文。8三、色譜法的發(fā)展1903年Tswett演講。1906年發(fā)表

4、色譜法的論文。 1931年德國的Kuhn和Lederer分離了、 、胡蘿卜素及60多種色素。 1940年英國學者Martin和Synge提出液液分配色譜法（Liquid-Liquid Partition Chromatography) 1941年Martin和Synge建立了“塔板理論”模型,提出了用氣體代替液體作流動相的可能性。1952年James和Martin發(fā)表了從理論到實踐比較完整的氣液色譜方法而獲諾貝爾獎（Gas-Liquid Chromatography)1956年荷蘭學者Van Deemter（范.弟姆特）提出了“速率理論”，為毛細官色譜、高效液相色譜的發(fā)展起了指導性的作用。9

5、. 1944年Consden等發(fā)現(xiàn)了紙色譜。 8.1949年Machlean等使薄層色譜法（TLC)得以實際應用。 9. 1956年Stahl開發(fā)出薄層色譜板涂布器之后，才使TLC得 到廣泛地應用。10. 1955年第一臺商品GC儀器推出。11. 1958年毛細管GC柱問世。 12. 60年代末把高壓泵和化學鍵合固定相用于液相色譜，出現(xiàn)了高效 液 相色譜（HPLC) (High Performance Liquid Chromatography) (Pressure) 13. 80年代初毛細管超臨界流體色譜（SFC）得到發(fā)展。 90年代末得到廣泛的發(fā)展和應用。 14 . 80年代初由Jorge

6、nson發(fā)展起來的毛細管電泳 （CZE）。 90年代得到廣泛的發(fā)展和應用。 15. 21 世紀UPLC10四、色譜法的現(xiàn)狀和未來有人認為GC可能是世界上應用最廣的分析技術，并將以3 4 逐年增長。GC/MS將以 10 的速度增加。HPLC近年以6 8 的速度增長。LC/MS系統(tǒng)將開發(fā)更為簡單便宜的系統(tǒng)。CZE具有很高的柱效，用它來分析生物大分子有非常突出的優(yōu)點，但它缺乏色譜方法靈活調節(jié)分離因子的機動性。難以成為定量分析的手段。CZE分析結果的偏差要比HPLC整整大一個數(shù)量級。要解決這些困難，需要付出十分艱辛的研究，才能使CZE有更大的前途。11五、色譜法的定義與分類相“相”是指體系中某一均勻的

7、部分固定相在色譜過程中它是固定不移動的流動相沿固定相流動的流體稱流動相原理（定義）色譜法實質上是一種用以分離、分析多組分混合物的極有效的物理化學分析方法，即利用不同物質在兩相（固定和流動相）中具有不同的分配系數(shù)（或吸附系數(shù)、滲透性等），當兩相作相對運動時，各物質在兩相中反復多次分配，從而使各組分得到完全分離。12按流動相和固定相的狀態(tài)分類按流動相按固定相英文縮寫氣相色譜氣固色譜氣液色譜 GSC GLC液相色譜液固色譜液液色譜 LSC LLC五、色譜法的定義與分類13 2 . 按固定相形狀分類柱色譜填充柱色譜和毛細管色譜 紙色譜用濾紙作固定相薄層色譜固定相碾成粉末,制成薄板14. 按分離過程的物

8、理化學原理分類吸附色譜法（Absorption Chromatography）分配色譜法（Partition Chromatography）離子交換色譜（Ion-exchange Chromatography）凝膠色譜（空間排斥色譜、排代色譜、排阻色譜）（Size exchange Chromatography）154.按固定相和流動相的極性分類正相色譜（NPC）固定相的極性大于流動相的極性。反相色譜（RPC）流動相的極性大于固定相的極性。16正相反相17各種分類方法的分類原則都是按每一種色譜法的某一種特征（如固定相的“物態(tài)”或“形態(tài)”等）加以分類的。各種分類方法即有聯(lián)系又有區(qū)別（吸附：GSC

9、/LSC）任何一種色譜法所發(fā)生的機理往往不是單一的，而是幾種機理同時發(fā)生作用的 。（如:紙色譜法即有吸附作用，又有分配作用。哪一種作用占優(yōu)勢，決定于紙的性質與實驗條件）5.有關分類總結18附：分類方法之間聯(lián)系表按分離原理的色譜法名稱吸附色譜法按其它分類法分類的色譜法名稱 液固柱色譜法（LSC）紙色譜法（PC）薄層色譜法（TLC）氣固色譜法（GSC）分配色譜法液液柱色譜法（LLC：NPC/RPC)紙色譜法薄層色譜法氣液色譜法（GLC：填充柱/毛細管柱）離子交換色譜法裝有離子交換樹脂的液固色譜紙色譜薄層色譜排斥色譜法凝膠色譜（GPC）裝有分子篩的氣固色譜19六、色譜法的特點和優(yōu)點特點其高超的分離能

10、力優(yōu)點（1）分離效率高（2）應用范圍廣（3）分析速度快（4）樣品用量少（5）靈敏度高（6）分離和測定一次完成（7）易于自動化20第二節(jié) 氣相色譜法一、色譜分離的本質二、氣相色譜中常用的術語和參數(shù)三、色譜理論四、氣相色譜儀五、氣相色譜應用六、其它氣相色譜技術21第二節(jié) 氣相色譜法 (Gas Chromatography) 22第二節(jié) 氣相色譜法 (Gas Chromatography) 一、色譜分離的本質舉例：(苯、環(huán)己烷，沸點差0.6,氫氣43mL/min,EGS 0.5m,TCD,氣化室溫度200,柱溫100。環(huán)己烷10s、苯20s出峰。)分配系數(shù)的差異是所有色譜分離的實質性原因丁二酸乙二醇

11、聚酯23第二節(jié) 氣相色譜法 (Gas Chromatography) 一、色譜分離的本質2. 分配系數(shù) 在一定的溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g mL ）之比，稱為分配系數(shù)。用K表示。 組分在固定相中的濃度 CsK= = 組分在流動相中的濃度 CmK環(huán)己烷4000)PEG 20MHO-CH2-CH2-O-n-OHV180表2-5續(xù)序號名稱商品代號結構式類別4聚醚DEGSHO-(CH2)2O(CH2)2O2C(CH2)2 HOn-)CH2)2O(CH2)2O2CV15全氰基聚硅氧烷Silar10C,SP2340 CH2CH2CH2CN(CH3)3Si-OSi-n-OSi(CH3

12、)3 CH2CH2CH2CNV36三氟丙基聚硅氧烷OV-210,SP2401 CH3(CH3)3Si-O-Si-O-n-Si(CH3)3 CH2CH2CH2CF3V381固定液的選擇 在填充柱氣相色譜中由于色譜柱的柱長受到限制，它的總柱效一般難以超過6000理論板數(shù)，所以對難分離的混合物就必須提高固定相的選擇性。因此填充柱固定液的選擇就十分重要。選擇固定液前對樣品的了解 “相似相溶”原則：選擇固定液的基本原則 固定液和被分離物分子 之間的特殊作用力82選擇固定液的基本原則(續(xù))基本原則 “相似相溶”原則： 極性混合物用極性固定液進行分離，非極性混合物用非極性固定液進行分離的規(guī)律條件：一般來說，

13、在同系物或相同官能團的混合物各組分在沸點上有差別時，使用“相似相溶”原則有效。 固定液和被分離物分子之間的特殊作用力 利用固定液的誘導力 利用固定液的氫鍵力 利用固定液的受質子力 利用固定液給質子力 利用形成超分子的固定液 83 氣固色譜填充柱 氣固色譜在氣相色譜中雖然占的比例不大，但是它廣泛地用于永久氣體和低沸點烴類的分析，在化工、石油和石油化工領域應用很普遍。 固定相活性碳石墨化碳黑碳多孔小球（碳分子篩）分子篩84 開管型壁涂毛細管柱 (Wall Coated Open Tubular Column) 固定相 這種毛細管柱把固定液直接涂漬到毛細管柱壁上，現(xiàn)在多數(shù)毛細管柱是這種類型，簡稱WC

14、OT柱。85 毛細管柱的預處理粗糙化方法：沉淀石墨化炭黑、沉積氯化鈉、沉積二氧化硅去活方法：石英毛細管柱的水熱處理（用2的鹽酸經(jīng)一定步驟略） 石英毛細管柱硅烷化去活86 WCOT柱的尺寸分類（見下表）柱類型內徑/mm常用柱長/m每米理論塔板數(shù)主要用途微徑柱常規(guī)柱大口徑柱不大于0.10.20.320.530.7511010601050400080003000500010002000快速GC常規(guī)分析定量分析87常用的不同廠商毛細管色譜柱牌號對照（見下表）極性固定液HP(Agilent)J&WSupelcoAlltechSGE適用范圍非極性弱極性中極性強極性OV - 1,SE -30SE -54SE

15、 -52OV-1701,OV-17PEG-20MFFAPHP-1,Ultra-1HP-5,Ultra-2,HP -5MSHP-17,HP-50HP-20MHP-FFAPDB-1DB-5DB-1701DB-WAXSPB-1SPB-5SPB-7Supelco wax 10AT-1AT-5AT-1701,AT-50AT-WAXBP-1BP-5BP-10BP-20脂肪烴化合物,石化產(chǎn)品各類弱極性化合物及各種極性組分的混合物極性化合物,如農(nóng)藥等極性化合物,如醇類,羧酸酯等88 毛細管柱柱效能高，對固定液的選擇性較填充柱簡單一些，有人估計，一個常規(guī)GC實驗室只要購置三種毛細管柱，就可應付85以上的GC分析

16、任務，這三種柱是：OV-1(SE-30)、SE54、OV-17(OV-1701)。如果再加一根PEG-20M柱，則可應付95的GC分析任務。89注意事項選擇柱時必須要看具體的分析任務，如果是做法規(guī)分析，則必須按有關法規(guī)的要求選擇色譜柱，（如法規(guī)規(guī)定用填充柱，那你就不能用毛細管柱）否則你分析結果不被法規(guī)認可。毛細管柱特別容易斷。安裝時按說明書要求伸進多長就多長。接頭不要擰的太緊，先用手擰緊再用扳手擰 圈。新柱安裝后，都要在進樣前進行老化。90 4 檢測器 GC所使用的檢測器有多種，但商品化的檢測器不外乎以下幾種： 熱導檢測器 (TCD) 氫火焰離子化檢測器 (FID) 火焰光度檢測器 (FPD)

17、 氮磷檢測器 (NPD) 測農(nóng)藥 電子捕獲檢測器 (ECD) 光離子化檢測器 (PID)紅外光譜檢測器 (IRD)原子發(fā)射光譜檢測器 (AED) 質譜檢測器 (MSD)91 熱導檢測器(Thermal Conductivity Detector)原理： 是基于不同的氣體或蒸汽具有不同的熱導系數(shù)。在未進樣時，通過參比池和測量池的都是載氣，由于載氣的熱導作用，使鎢絲溫度下降，電阻減小，但此時參比池和測量池中鎢絲溫度下降和電阻值的減小的數(shù)值是相同的，當有試樣進入檢測器時，載氣流經(jīng)滲比池，同時載氣攜帶著組分流經(jīng)測量池。由于載氣和待測組分混合氣體的熱導系數(shù)和純載氣的熱導系數(shù)不同，使參比池和測量池的鎢絲溫

18、度和電阻值產(chǎn)生了差異，通過測量此差值，即可確定載氣中組分的濃度。 見書P18頁惠斯頓電橋圖。9293 TCD為什么用He作載氣？ 載氣與試樣的熱導系數(shù)相差愈大，靈敏度就愈高，一般物質蒸汽的熱導系數(shù)較小，所以應選擇熱導系數(shù)大的H2（或He）作載氣。He:388; H2:490; Ar:50; N2:73 (cal/sec.cm)綜合評價 結構簡單，靈敏度適中，穩(wěn)定性好，線性范圍寬。對可揮發(fā)的無機物及有機物均有響應，是應用最廣泛的檢測器之一。屬濃度型，通用型檢測器。94 氫火焰離子化檢測器 (Flame Ionization Detector) 原理： 微量有機物組分被載氣帶入檢測器，在氫火焰(2

19、100 C)能源作用下離子化。產(chǎn)生的離子在發(fā)射極和收集極的外電場作用下定向運動而形成微弱的電流(10 610 -14A)。所產(chǎn)生的離子數(shù)與單位時間內進入火焰的碳原子質量成正比。 （ 見書P18頁）9596有機物在氫火焰中離子反應過程 例: C6H66CH 6CH+3O26CHO + +6e- 6CHO + +6H2O6CO+6H3O+ 在外電場作用下，這些離子形成離子流，經(jīng)放大后被記錄下來。綜合評價 對大多數(shù)有機物有很高的靈敏度，比TCD高出3個數(shù)量級能檢測10gg 級的痕量有機物質。 結構簡單，靈敏度高，響應快，穩(wěn)定性好，屬質量型、準通用型檢測器，是目前應用廣泛的一種較理想的檢測器。特別適合

20、于毛細管氣相色譜使用。 缺點是不能檢測惰性氣體、空氣、水、CO、CO2、NO、SO2及H2S等。97 電子捕獲檢測器(Electron Capture Detector)原理： 在電子捕獲檢測器內一端有一個 放射源作為負極，另一端有一個正極，兩極間加適當電壓。當載氣(N2)進入檢測器時，受 射線的輻射發(fā)生電離： N2+N2 + + e 生成的正離子和電子分別向負極和正極移動，形成恒定的基流。當含有電負性元素的樣品AB進入檢測器后，就會捕獲電子而生成穩(wěn)定的負離子。 AB+e AB 生成的負離子又與載氣正離子復合： N2 + +AB =N2+AB 結果導致基流下降。因此；樣品經(jīng)過檢測器，會產(chǎn)生一系

21、列的倒峰。9899 電子捕獲檢測器(Electron CapturDetector)綜合評價 這是一種高選擇性、高靈敏度的濃度型檢測器。它只對具有電負性的物質（如鹵素、硫、磷、氧的物質）有響應。是一種用63Ni或氚做放射源的離子化檢測器。主要缺點是線性范圍較窄。100 火焰光度檢測器（FPD） 是基于樣品在富氫火焰中燃燒，使含硫、磷化合物經(jīng)燃燒后又被氫還原而得到特征光譜的檢測器。 氮磷檢測器(NPD)又稱熱離子檢測器(TID) 它是在FID的噴嘴和收集極之間放置一個含有硅酸銣的玻璃珠。適于測定氮、磷化合物的選擇性檢測器。 光離子化檢測器(PID) 是利用紫外光能激發(fā)解離電位較低(10.2eV)

22、的化合物，使之電離而產(chǎn)生信號的檢測器。101 質譜檢測器(MSD) 是質量型、通用型GC檢測器，其原理與質譜(MS)相同，MSD實際上是一種專用于GC的小型MS儀器。 原子發(fā)射光譜檢測器(AED) 采用微波等離子技術，實際上也是一種聯(lián)用技術，原則上可測除載氣以外的所有元素，靈敏度為pg/s量級，線性范圍 10 10 4 常用GC檢測器的特點和技術指標(見下表) 102常用GC檢測器的特點和技術指標 檢測器類型最高操作溫度/ C敏感度/(g/s)線性范圍最小檢測量g主要用途TCD濃度型通用型4001*10-6 1*10 -10 g/ml1*104 1*1051*10 -4 1*10-8適用于各種

23、無機氣體和有機物的分析多用于永久氣體的分析FID質量型準通用型4502*10 1*10 61*1071*103 S: 5*1021*10-10適合于含硫、磷和含氮化合物的分析NPD(TID)質量型選擇型400氮1*10-13磷1*10-14104 1051*10-13適合于含氮和含磷化合物的分析104 檢測器性能表示方法靈敏度（響應值） 單位濃度（或質量）的物質通過檢測器所產(chǎn)生信號的大小。 Si=Ai/mi=1/fi mi組分i的進樣量 Ai組分i的峰面積 Si檢測器對組分的響應值檢測限(敏感度) D=2N/S 當產(chǎn)生的信號大小為二倍噪音時，通過檢測器的物質量叫檢測限。 最小檢測量 是指檢測器

24、出現(xiàn)可檢測信號時，進入色譜柱的最小物質量。線性范圍 是指檢測器信號大小與被測物質量成線性關系的范圍105 5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄儀 就是常用的自動平衡電子電位差計,它可以把從檢測器來的電信號記錄成為電壓隨時間變化的曲線,即色譜圖.積分儀 這種裝置包括一個微處理器,前置放大器,計算器寄存器,打印機,鍵盤和狀態(tài)指示器等,是現(xiàn)今更為普通使用的色譜處理裝置.色譜工作站 是一種專用于色譜分析的微機系統(tǒng),在色譜儀和計算機之間安裝一個A/D轉換器.通過專門的應用軟件,計算機不僅能完成積分儀的所有工作,而且能夠設計,編輯報告格式,還可以永久保存色譜原始數(shù)據(jù).在色譜分析的同時還可以進行其他計算機工作.(如數(shù)據(jù)分析

25、、論文寫作、聽音樂、上網(wǎng)等）106五、氣相色譜應用1.方法步驟 樣品的來源及其預處理方法 來源： GC能直接分析的樣品必須是氣體或液體，固體樣品在分析前應當溶解在適當?shù)娜軇┲?，而且還要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無機鹽），或可能損壞色譜柱的組分，所以必須了解它的來源。 被分析的組分在一定的溫度下能被氣化，并且不發(fā)生裂解。 107五、氣相色譜應用1.方法步驟 樣品的來源及其預處理方法 GC常用溶劑丙酮、乙烷、氯仿、苯、石油醚避免用水、二氯甲烷和甲醇作溶劑如能確認樣品可直接分析，只要找一種合適的溶劑如用毛細管柱，樣品濃度不要太高108五、氣相色譜應用1.方法步驟 樣品的來源及其預處理方法預

26、處理 如樣品不能用GC 直接分析，采用預分離手段，如:萃取提純濃縮等方法。 注意樣品中組分損失。（詳見色譜分析樣品處理王立 化學工業(yè)出版社）109五、氣相色譜應用1.方法步驟 確定儀器配置 確定初始操作條件主要包括進樣量進樣口溫度檢測器溫度色譜柱溫度載氣流速 分離條件優(yōu)化 分離條件的優(yōu)化目的就是要在最短的分析時間內達到符合要求的分離結果。 110五、氣相色譜應用 1.方法步驟 定性鑒定對簡單樣品：可通過標準物質對照定性（根據(jù)保留時間、加入純物質增加峰高）雙柱或多柱定性(因為同一柱不同的化合物可能有相同的tR)111五、氣相色譜應用1.方法步驟 定性鑒定 對復雜樣品： 通過保留指數(shù)定性()用GC

27、/MS來定性用GC/IRD來定性 （詳見色譜定性定量和色譜聯(lián)用技術化學工業(yè)出版社）112定量分析 定量方法 計算公式 特點面積百分比法 xi=Ai / Ai 100%簡單,定量準確度低,要求樣品中所有組分均出峰歸一化法xi=fi Ai / fiAi 100%定量準確度高,但復雜,要求所有樣品組分均出峰,且有所有組分的標準品外標法 xi=Ai / AE Ei簡單,定量準確度較低,只要樣品待測組分出峰且完全分離即可內標法 xi=msAifs, i / mAs 100%定量準確度高,只要樣品待測組分出峰且完全分離即可,但樣品制備過程稍復雜,需選擇合適的標物標準加入法(疊加法)xi=miAiAj/m(

28、AiAj - AiAj) 100%定量精度介于內標法和外標法之間113標注: 計算公式中的符號:xi待測樣品中組分i的含量(濃度);Ai 組分 i的峰面積;fi 組分 i的校正因子,用標準樣品測定fi=Ei/Ai;Ei 標準樣品中組分i的含量(濃度);AE 標準樣品中組分i的峰面積;m 樣品的質量;ms 待測樣品中加入內標物的量;As 待測樣品中內標物的峰面積;fs,i 組分i與內標物的校正因子之比,稱為相對校正因子;Ai 待測物中加入mi的組分i后組分i的峰面積;Aj 待測物中與組分i相鄰的組分j的峰面積;Aj 待測物中加入mi的組分 后相鄰組分j的峰面積;mi 待測物中加入組分i的量。11

29、4五、氣相色譜應用2.方法的驗證 所謂方法驗證，就是要證明此開發(fā)方法的實用性和可靠性，即使應用他人的方法，也應驗證所得數(shù)據(jù)的可靠性。 方法的線性范圍 方法的檢測限 方法回收率（準確度） 方法重復性和重現(xiàn)性（精密度） 115116蘇丹測定方法最低檢測限的確定 粉狀樣品：在加入200L的混合標準使用液（D號）后在液相色譜上測定，還有峰出現(xiàn)，加入100L的混合標準使用液（D號）后在液相色譜上測定，卻沒有峰出現(xiàn)。根據(jù)信噪比S/N=3，由此可以估計粉狀樣品的方法最低檢測限為30ngg-1左右。 117混合標準使用液（D號）：混合標準使用液（B號）10mL，用乙腈定容至100mL配制成為:蘇丹（460ng

30、mL-1）、蘇丹（455ngmL-1）、蘇丹（430ngmL-1）、蘇丹（360ngmL-1）混合標準使用液（D號）。118回收率（準確度） 回收率=測定值/理論值 *100%回收率=（加標樣品的測定值樣品測定值）稀釋倍數(shù)/加標溶液的理論值100%錯的回收率=加標樣品的測定值稀釋倍數(shù)/(加標溶液的理論值+樣品測定值) 100%一般要求回收率大于60% ，越接近100% 越好。119粉狀樣品：商檢局編號200513633 辣椒粉回收率及精密度加入1.00mL混合標準使用液（E號）：蘇丹（115ngmL-1）、蘇丹（114ngmL-1）、蘇丹（108ngmL-1）、蘇丹（90.0ngmL-1）?；?/p>

31、合標準使用液（E號）的高效液相色譜回收率及精密度見表2.9.1。120五、氣相色譜應用2.方法的驗證 方法重復性和重現(xiàn)性（精密度） 重現(xiàn)性同一方法在不同時間、地點、不同型號的儀器、不同操作人員使用時所的結果的一致性。 重復性同一個人在同一臺儀器上重復進行所得結果的一致性 重現(xiàn)性和重復性都用多次(510次)分析所得結果的相對標準偏差(RSD)來表示 一般要求保留時間的(RSD) 不大于1%， 峰面積的(RSD) 不大于5%。121六、其它氣相色譜技術1.程序升溫技術（書P19）2.毛細管色譜柱技術（書P20）3.裂解氣相色譜（使一些大分子量，結構復雜、難揮發(fā)物質得到分離）4.頂空氣相色譜（對液體

32、或固體中揮發(fā)性成分進行氣相色譜分析的一種間接測定方法）122六、其它氣相色譜技術1.程序升溫技術（書P19）123第三節(jié) 高效(壓)液相色譜法一、液相色譜中常用的術語和參數(shù)二、 液相色譜速率理論的方程三、氣相色譜和高效液相色譜的比較四、高效液相色譜儀流動相貯罐泵進樣系統(tǒng)色譜柱檢測器124第三節(jié) 高效(壓)液相色譜法 High Performance (pressure) Liquid Chromatography最早的色譜是液相色譜塔板理論 氣液色譜氣液色譜 速率理論速率理論 液相色譜 GC-20的化合物推動液相色譜發(fā)展的原因: 高分子、熱穩(wěn)定性差 極性強的化合物125第三節(jié) 高效(壓)液相色

33、譜法HPLC依照流動相及固定相的狀態(tài)或作用機制的不同可分為：液固色譜 正相色譜液液色譜 反相色譜離子交換色譜凝膠色譜等126 在這些HPLC模式中，以反相色譜的應用最多，占到高效液相色譜的70%80%。本節(jié)以反相色譜為重點。127128一、液相色譜中常用的術語和參數(shù)1. HPLC中容量因子用k表示 k=tR / tM2. 在HPLC中沒有比保留體積(Vg)和保留指數(shù)()的概念129一、液相色譜中常用的術語和參數(shù)3.獨有的參數(shù)（簡單介紹）粒間體積(V0)(多孔填充劑的)孔體積 （Vp）柱外體積(Vext)液體總體積(Vtot)(Vtot=V0+Vp+Vext)淋洗體積(Ve)流體力學體積（Vh）

34、130一、液相色譜中常用的術語和參數(shù)4.和柱效能有關的參數(shù) 折合板高(Reduced plate height) (hr) 折合成固定相單位粒徑的理論板高。 hr =H / dp 折合流動相速度(Vr) Vr=u dp / Dm131二、 液相色譜速率理論的方程 H=Au 0.33 +B/u +Cu+Du Au 0.33 =Cedp +Cmdp u/ Dm縱向擴散項：B / u=Cd Dm / u停滯流動相擴散項：Cu=Csm dp u/Dm固定相傳質阻力項：Du=Cs dfu/Ds 132注: Ce、Cm、Cd、Csm是塔板高板系數(shù)； dp是填料平均粒徑 df是固定相膜厚 u是流動相流速 D

35、s是固定相中的擴散系數(shù) Dm是流動相中的擴散系數(shù) A、B、C、D是給定的柱常數(shù)133討論： 使用小的粒徑填料，其dp值?。ㄈ?um 、3 um） 可以使柱效大幅度提高 固定相的液膜(df)越薄，柱效能越高。 現(xiàn)代HPLC填料多使用鍵合固定相，其固定相膜很薄因而大大提高了柱效134三、氣相色譜和高效液相色譜的比較 氣相色譜 高效液相色譜1.只能分析揮發(fā)性的物質，只能分析20%的化合物幾乎可以分析各種物質2.不能用于熱不穩(wěn)定物質的分析可用于熱不穩(wěn)定物質的分析3.用毛細管柱色譜可得到很高的柱效色譜柱不能很長柱效不會很高4.有很靈敏的ECD和較靈敏的FID和TCD沒有很高靈敏度的檢測器5.流動相無毒，

36、易于處理流動相有毒，費用較高6.運動操作容易比GC難7.儀器制造難度較小制造難度較大8.溫度梯度溶劑 梯度9.不參加分離。參加分離135四、高效液相色譜儀液相色譜儀由：(1)流動相溶劑儲存器，(2)輸液泵，(3)進樣系統(tǒng)，(4)色譜柱及柱溫箱，(5)檢測器，(6)工作控制站，(7)信號放大、積分、記錄儀組成。136四、高效液相色譜儀流動相貯罐 常使用1L的錐形瓶加一個電磁攪拌器，在連接到泵入口處的管線上時要加一個過濾器 (2um過濾芯)，以防止溶劑中的固體顆粒進入泵。 使用高純度的流動相 脫去流動相中的溶解氣體 除去流動相中的氧，防止流動相與固定相可能發(fā)生的反應 流動相的選擇: 首先要考慮溶劑

37、的物理性質，如沸點，粘度，紫外吸收的波長范圍其次要考慮的是溶劑對所要分離樣品的容量因子。一般來說選擇較低沸點和較低粘度的溶劑137常用的幾種溶劑常用溶劑極性順序正戊烷正已烷環(huán)已烷四氯化碳二甲苯甲苯氯仿四氫呋喃苯二氯甲烷乙醇乙腈甲醇8）不穩(wěn)定）金屬氧化物基質（二氧化鈦、二氧化鋯等）非多孔基質各種聚合物149 固定相 硅膠表面鍵合固定相有兩類 硅膠表面的-OH基直接進行酯化反應形成Si-O-C鍵（氧二丙腈、聚乙二醇）。 Si OH + HO R Si OR + H2O是將硅膠表面的 OH基硅烷化，制成Si O Si C鍵 Si OH Si O Si OH + C18H37SiCl3 Si OSi

38、C18H37 Si OH Si O R R硅膠 O Si O (Si O )n Si R3 （書上） R R150 固定相(續(xù)） 硅膠表面涂漬各種聚合物 其他氧化物表面上涂漬聚合物 無孔單分散填料（分離生物大分子） 有機高聚物填料（適于小分子的核酸、核苷 酸、多環(huán)芳烴分離） 手性固定相填料分離蛋白質（核糖核酸酶A、細胞色素C、溶菌酶、 乳球蛋白、卵清蛋白）151常用液液色譜固定相類型名稱鍵合相 粒度（m） 生產(chǎn)廠正相柱（氰基、氨基柱可用于反相）Lichrosorb DiolYWG-CNMicropak CNVydac 501 TPBondapak NH2二醇氰乙基氰丙基氰基氨基10101010

39、10Hewlett packard等天津試劑二廠VarianApplied Sci.Waters反相柱GYQG-C18Partisil ODS 系列Lichrosorb RP系列ODS-sil-X-1Hitachi Gel 30450系列Vydac 201 C18ZY1102Zorbax C8十八硅烷十八硅烷十八硅烷十八硅烷十八硅烷十八硅烷十八硅烷辛基硅烷5、7、95、105、10105、10、15105、106北京化學試劑研究所Applied Sci.等HPLC Technology Ltd.Perkin-Elmer日立Applied Sci.北京分析儀器廠島津152 柱的保護用后先用過渡溶

40、液清洗，最后用甲醇H2O或乙腈 H2O流動相徹底洗脫。勿將柱跌落地上不能用酸、堿洗脫（特別是HCl，腐蝕不銹鋼管邊，柱的使用說明有pH的使用范圍）柱保存時的兩頭必須用相應螺栓塞妥；并標以日期及柱內用什么流動相。取用時柱的方向不能裝錯，螺栓要用手擰再用扳手擰半圈使用時注意系統(tǒng)壓力，防止柱內填料壓碎柱效下降153 5. 檢測器液相色譜檢測器是液相色譜儀的“眼睛”;是一種信號接收和信號轉換裝置;檢測器性能的好壞直接影響分析結果的可靠性和準確性。154 5. 檢測器 常用紫外可見光檢測器示差折光率檢測器光電二極管陣列檢測器螢光檢測器 不常用光散射檢測器化學反應檢測器手性檢測器放射性檢測器 聯(lián)用技術液相

41、色譜與質譜付里葉變換紅外核磁共振電感耦合等離子155按性質或應用范圍分類總體性能檢測器（示差、介電常數(shù)、電導檢測器等） 響應值取決于流出物（包括樣品和流動相）某些物理性質的總的變化的檢測器 （噪聲、漂移較大，靈敏度低，不適于痕量分析，且不能用于梯度洗脫）溶質性能檢測器（紫外-可見、熒光、手性檢測器等） 響應值取決于流動相中溶質的物理或化學特性的檢測器（靈敏度高，受操作條件和外界環(huán)境影響小，可用于梯度洗脫）156理想的檢測器應具備以下特點：靈敏度高，以便能作痕量分析，能檢出10 -6 g以下的樣品對所有的物質都能響應不受溫度和流動流速變化的影響線性范圍寬噪音低，漂移小，作梯度淋洗時也能測定死體積

42、小對樣品無破壞性響應快能給出定性信息穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好、使用方便價格便宜良好的氣密性157評價檢測器的性能指標噪聲和漂移靈敏度檢測限線性范圍最小檢測量和最低檢測濃度158 紫外-可見光檢測器 (ultraviolet-visible detector UV-VIS) 又稱紫外可見吸收檢測器、紫外吸收檢測器、紫外光波檢測器，或直接稱紫外檢測器，是HPLC應用最廣泛的檢測器，其使用率占70%左右。對占物質總數(shù)約80%的有紫外吸收的物質均有響應。即可測190nm350nm范圍 (紫外)的光吸收變化，也可向可見光范圍350700nm延伸。159特點及優(yōu)點：靈敏度高且噪聲低, 對于具有中等強度紫外吸收

43、的溶質，最小檢測量可達10 g的數(shù)量級，最低檢測濃度可達10g/mL，因此對紫外吸收不強的樣品也可檢測，線性范圍寬，應用廣泛。對流動相基本無響應，屬于溶質性檢測器，受操作條件和外界環(huán)境影響很小，一般對流速和溫度變化 不太敏感適于梯度洗脫。屬于選擇性檢測器，對無紫外吸收的物質如飽和烴及有關衍生物無響應。需選用無紫外吸收特性的溶劑作流動相。屬濃度敏感型檢測器。屬于非破壞型檢測器，能用于制備色譜，或與其它檢測器串聯(lián)使用。結構簡單，使用維修方便。 160原理：紫外可見光檢測器是通過測定樣品待測組分在檢測池中對特定波長紫外光的選擇性吸收的大小來確定樣品含量的,待測組分的濃度與吸光度的關系服從郎伯比耳定律

44、 0 1A=abc=lg = lg Ta吸光系數(shù)，b光在溶液中的距離，c濃度 A= b c 為摩爾消光系數(shù) L/(molcm)161生色團（或發(fā)色團）它們都含有不飽和鍵或未共用電子對，能產(chǎn)生 -及n-的躍遷。如：C=C、C=O、S C 、C=N、N=N、N=O等助色團某些基團本身不產(chǎn)生吸收峰，但與生色團相連時，常常引起吸收峰位移和吸收強度改變，這些基團稱為助色團。如：羥基、烴氧基、氨基、烷氧基、芳氨基等162一些發(fā)色基團最大吸收波長max和相應的摩爾吸光系數(shù)表2-1 發(fā)色團系統(tǒng)max/nm /(L molcm max/nm /(L molcm醚基 -O-硫醚基 -S-氨基 -NH2硫醇基 -S

45、H二硫化物 -S-S-溴化物 -Br碘化物 -I腈 -CN乙炔化物 -CC-砜 -SO2肟 -NOH疊氮化物 C=N-烯烴類 C=C 1000 4600 2800 1400 5500 300 400 160175180 6000180 5000190 8000 1600255 400163表2-1續(xù)164常用溶劑透過波長下限表2-2165表2-2續(xù)166討論測定波長的選擇被測用溶質有最大吸收（ max ）；流動相無吸收（所選波長流動相的透過波長下限）；透過波長下限=吸收波長上限=截止波長吸收波長透過波長截止波長167舉例：調味品中蘇丹紅樣品高效液相色譜法工作條件 色譜柱：ODS 5（2004.

46、6mm）；流動相：乙腈-水(90:10，V/V)；流速：1mLmin-1；柱溫：室溫；進樣量：10.00L。檢測波長：蘇丹 478nm， 蘇丹、 蘇丹、蘇丹 520nm，于6.5分鐘時切換；乙腈的透過波長下限是210 nm，（所選波長流動相的透過波長下限）。168表: 波長改變的時間Tab: Gradient wavelength with the changing of time 時間（min） 波長（nm） 0.00 478 6.50 478 6.51 520 17.50 520 17.51 478169結構類型固定波長紫外可見光檢測器(fixed wavelength UV-Vis de

47、tector)紫外 254檢測器有紫外吸收、特別是芳香屬在此都有一定的吸收紫外 280檢測器采用磷光轉換的方法選擇不同的光源可達到不同波長的檢測可變波長紫外可見光檢測器 檢測器的波長選擇是任意可調的 170結構類型（續(xù)）1光源;2 單色器;3 流通池;4-光電管;171 光電二極管陣列檢測器(photo-diode array PDA) 又稱光電二極管列陣檢測器或光電二極管矩陣檢測器，也有稱之為多通道快速紫外可見光檢測器。 一般認為是液相色譜最有發(fā)展、最好的檢測器，技術發(fā)展已較成熟。172 光電二極管陣列檢測器 在結構上的主要特點是用光電二極管陣列同時接受來自源通池的全光譜透過光。然后由一系列

48、分光技術，使所有波長的光在接收器同時被檢測。 它在結構和光路安排上與普通的紫外檢測器有重要區(qū)別，樣品與光柵的相對位置正好相反，經(jīng)常稱為“倒光學”系統(tǒng)。原理：173圖：單色儀和多色儀 (a)單色儀; (b)多色儀 1光源;2 單色器;3 流通池;4-光電管;5 光電二極管陣列 174特點：可以同時得到多個波長的色譜圖，并計算不同波長的相對吸收比?？梢栽谏V分離期間，對每個色譜峰的指定位置實時記錄吸收光譜圖，并計算最大吸收波長?？梢灾瘘c進行光譜掃描，得到時間-波長-吸收值為坐標的三維圖形?？梢赃x擇整個波長范圍，幾百納米的寬譜帶檢測，僅需一次進樣，將所有組分檢測出來。175主要應用：在藥物學和毒物學

49、中的應用 生物體液中未知藥物代謝產(chǎn)物的研究在生物學中的應用分離肽和蛋白質在環(huán)境學中的應用對熱不穩(wěn)定的農(nóng)藥 (苯脲類除草劑、三嗪類農(nóng)藥等)在其它方面的應用飲料中合成色素176 示差檢測器(refractive index RI)示差折光檢測器的通用性在于如果選擇合適的溶劑，幾乎所有的物質都可以進行檢測，是少有的通用型檢測器之一。這種檢測器不能采用梯度洗脫。177示差檢測器(refractive index RI) 通過測定純流動相和含有被分析組分的流動相之間折光率的差別而對樣品濃度進行檢測的。 R=Z(n n0) Z為儀器常數(shù)， n 為溶液折射率 n0為溶劑折射率 原理：178 示差檢測器(re

50、fractive index RI)屬于總體性能檢測器屬于濃度敏感型檢測器屬于中等靈敏度檢測器 檢測限：10 -6 g/mL10 7 g/mL，線性范圍小于105對壓力和溫度的變化很敏感最常用的溶劑是水，但所有的透明溶劑原則上都可以使用。特點：179示差檢測器(refractive index RI)靈敏度不高是它最大的缺點不能用于梯度洗脫缺點：糖類化合物的測定只能用示差檢測器。180熒光檢測器(fluorescence detector FLD)熒光檢測器是一種很靈敏的，有選擇的，測量溶液熒光強度的裝置。所謂熒光是指某些物質吸收了與它本身特征頻率相同的光線以后，原子中的某些電子從基態(tài)中的最低

51、振動能級躍遷到較高的某些振動能級。電子在同類分子或其它分子中撞擊，消耗了相當?shù)哪芰?，從而降到第一激發(fā)態(tài)中的最低振動能波，同時發(fā)生比原來吸收的頻率低、波長長的一種光，就是熒光。181 熒光檢測器(fluorescence detector FLD) 液相色譜中的熒光檢測器僅使用吸收紫外光或可見光而發(fā)射的熒光，利用測量化合物熒光強度對化合物進行檢測。原理：182優(yōu)點：靈敏度極高，最小檢測量可達1013 g，特別適合于痕量分析。良好的選擇性線性范圍寬(10 4 10 5 )受外界條件的影響小只要選作流動相的溶劑不會發(fā)射熒光，就能用于梯度洗脫183缺點： 它的高選擇性優(yōu)點在一些情況下，也是該檢測器的缺

52、點因為不是所有化合物在選擇的條件下都能發(fā)生熒光，所以它不屬于通用型檢測器，應用范圍較窄。184熒光化合物：具有對稱共軛體系的分子能發(fā)射熒光具有芳香環(huán)并帶有給電子取代基的化合物或具有共軛不飽和體系的化合物（-OH, -NH2, -OCH3,-NR2等）pH值對某些化合物影響很大（例：苯酚pH=1時產(chǎn)生熒光，pH =13溶液無熒光）185在環(huán)境及生物科學方面的應用多核芳烴（如：苯并芘）霉菌毒素（如：黃曲 霉素）色素和蛋白質其它物質（生物堿、維生素、心得安、潘生丁、雌性激素等）186 主要檢測器聯(lián)用技術與紅外光譜儀聯(lián)用與核磁共振的聯(lián)用與質譜儀的聯(lián)用(LC MS )187第四節(jié) 薄層色譜法一.分類二.

53、特點三. 薄層色譜(TLC)與高效液相色譜(HPCL)的比較四.常用技術參數(shù)五.薄層色譜常用吸附劑六.粘合劑及添加劑七.展開劑的選擇八.薄層板的制備九.定性十.含量測定十一. 薄層色譜法的應用188第四節(jié) 薄層色譜法(Thinlayer chromatography TCL) 薄層色譜法也叫薄層層析法.是色譜中應用最普遍的方法之一,它是將固定相于玻璃等載板上涂布成均勻的薄層,將被分離物質點在薄層的一端,置展開室中,展開劑(流動相)借毛細作用從薄層點樣的一端展開到另一端,在此過程中不同物質可以得到分離,然后進行鑒定和定量分析. 189第四節(jié) 薄層色譜法(Thinlayer chromatogra

54、phy TCL) 經(jīng)典的TLC在自動化程度,分辨率及重現(xiàn)性等方面不及GC和HPCL,被認為是一種定性和半定量的方法而不被重視, 近年來用適當?shù)膬x器代替以往的手工操作,再配以高質量的薄層掃描儀,大大提高了定量結果的重現(xiàn)性準確度.至此 TLC法已成為一般實驗室必不可少的分離分析手段,常常是被首選成不可替代的方法.190一.分類吸附薄層法,分配薄層法,離子交換薄層法凝膠層法.191二.特點固定相是一次性使用,樣品的預處理比較簡單;對被分離物質的性質沒有限制,應用范圍廣;可同時平行分離多個樣品;展開劑用量極少,即可節(jié)約溶劑又減少了污染;固定相,流動相選擇范圍寬,利于不同性質化合物的分離;應用不同的展開

55、方式有利于難分離物質對的分離;在同一色譜上可選擇不同顯色劑或檢測方法進行定性和定量;斑點均貯存在薄板上,可隨時對譜圖在相同或不同參數(shù)下重復掃描檢測,得出最佳結果;唯有TLC技術可以提供原始彩色圖象,便于保存,直觀性,可比性極強;TLC為開放式的離線操作,有別于柱色譜法的封閉式的在線操作.192三. 薄層色譜(TLC)與高效液相色譜(HPCL)的比較.HPCL流動相為液體HPLC為柱色譜，固定相多次使用,樣品預處理比較復雜;封閉式在線操作.一個樣品一測定梯度操作TLC流動相為液體TLC為平板色譜固定相是一次性使用,樣品預處理比較簡單;開放式的離線操作多個樣品同時測定可換不同的展開劑193四.常用

56、技術參數(shù) 比移值(Rf)Rf=b/a=原點中心至斑點中心的距離 / 原點中心至溶劑前沿的距離194 2. 對相比移值(Ri,s) 由于影響被分離物質在薄層上移動距離的因素較多,因此Rf值的重現(xiàn)性較差,如果將被分離的物質與一參比物點在同一塊薄層上,用相同的色譜條件進行分離,相對比移值就是被分離物質(i)和參比物(s)的Rf值之比,或是被分離物質(i)和參比物(s)在薄層上移動距離之比. Rf(i ) 溶質自原點移動距離 Ri,s= = Rf(s ) 參考化合物自原點移動距離 也有用Rst表示1953. 分離度 dR= (w1+w2)/2當R1.5時,相鄰兩斑點可達到基線分離196理論塔板 n=16(D/W) D:原點到組分斑點中心的距離(cm) W:組分斑點寬度(cm)197五.薄層色譜常用吸附劑硅膠(Silicagel) 作為薄層色譜法用的固定相雖然很多,但90%以上的分離工作都可應用硅膠,因此對硅膠的主要性質及參數(shù)作些介紹.普通硅膠化學組成及結構.改性硅膠198 普通硅膠化學組成及結構. 硅膠為多孔性無定形粉末,硅膠表面帶有硅醇基(Silanol,Si