RTPCR操作流程及其相關(guān)注意事項

1、 一、知識背景：1、基因表達(dá)：DNARNAProtein2、PCR技術(shù)（Polymerasechainreaction）:即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：A、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；B、退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2+存在下，退火引物沿53方向延伸。以上三步為一個循環(huán)，如此反復(fù)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的D

2、NA聚合酶,至少具有以下三種活性：1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；2、Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.4、引物的設(shè)計及其原則：引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。a、引物長度:一般為1530bp，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，

3、特別是連續(xù)出現(xiàn)3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40%60%,PCR擴增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去510度。c、3端要求：3端必須與模板嚴(yán)格互補，不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T。d、引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。e、引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個連續(xù)堿基互補，3端不應(yīng)超過2個。f、同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個的互補堿基存在。g、5端無嚴(yán)格限制：5末端堿基可以游離

4、，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點等）等等。根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設(shè)置。RNA提取（用Trizol法提?。┳⒁馐马棧?、整個操作過程中總是帶著帽子、口罩和手套2、整個RT-PCR過程均必須使用無菌無RNA酶的制品（玻璃物品和飯盒需在18烤箱烘烤，注意烘烤時最好是早上開C烤箱，晚上到時間后一定要關(guān)掉，第二天早上將所需物品取出。取東西時需帶好帽子和口罩，輕柔操作，防止有空氣逆流入烤箱引起酶污染；塑料制品泡。水水提前一天配制，并用玻璃棒攪拌混勻。連續(xù)高溫高壓消毒次，以充分

5、降解P3、除非特別注明，所有程序均在室溫（1530C）下進行，試劑也放置于室溫。4提前，收拾干凈試驗臺，盡量不要放無關(guān)的物品；將試驗臺桌面用普通的酒精仔細(xì)擦兩遍；將所需用到的移液器全部用普通的酒精仔細(xì)擦拭干凈。需要的試劑：氯仿、異丙醇（裝此試劑的廣口瓶，瓶蓋最好用錫箔紙包一下）乙醇（溶于處理的水中）:制成0水，放入的玻璃瓶中用的玻璃棒攪拌，靜置小時以上，高溫高壓消毒。的制備：把水加入到的玻璃瓶中，加入至（）靜置過夜，高壓蒸汽滅菌，連續(xù)3遍。需要的器具：100ml棕色廣口瓶2個、100ml白色廣口瓶4個、鉗子2把、飯盒一個、100ml量筒一個、藍(lán)、黃、白Tip頭若干、1.5EP管、0.5EP管、

6、PCR管若干、PE手套、錫箔紙若干、4C離心機需提前降溫、平衡管，大培養(yǎng)皿一套，濾紙、滴管支，比色皿1個操作步驟：1、均質(zhì)化：單層培養(yǎng)的細(xì)胞，直接在培養(yǎng)瓶中裂解。倒掉培基，中號培養(yǎng)瓶中直接加入1mlTrizol試劑，加入后即反復(fù)抽吸、吹打細(xì)胞數(shù)次（約2040次）I室溫（153C）孵育5min（以利于勻漿樣品中核蛋白體完全解離）I轉(zhuǎn)移均質(zhì)溶液到新的1.5mlEP管中2、相分離：I每1mlTrizol試劑加入200ul氯仿，小心蓋緊管蓋（單手操作；將裝氯仿和異丙醇的廣口瓶放在正前方遠(yuǎn)離自己的位置，操作時不會越過瓶口上方造成污染；取氯仿時，不要把瓶蓋放在桌面上，取完立即蓋好瓶蓋）I用手劇烈震蕩15s

7、I室溫（153C）靜置23min（215min）I4C離心將管在離心機取出時需十分小心，盡量不要使管晃動I #IRNA存在于水相中，水相體積約為60%均質(zhì)化時使用的Trizol試劑量水相（無色）中間相，白色紅色下層（酚、氯仿相）I # #I 3、RNA沉淀I水相轉(zhuǎn)移至一個新的1.5mlEP管【注意：EP管垂直；槍垂直、貼壁、用200ul槍緩慢抽；一共最多抽400ul,寧缺勿濫】I混合異丙醇，以從水相中沉淀RNA,每1ml用于初始同質(zhì)化的Trizol試劑，使用500ul異丙醇，輕輕顛倒混勻12次I室溫（153C）孵育樣品10min（510min）【將逆轉(zhuǎn)錄的試劑置于冰上溶解備用】I4C離心往往離

8、心前沉淀不可見，離心后在管側(cè)面和底部形成一個凝膠樣沉淀4、RNA洗滌I棄上清（緩慢倒出）I用75%乙醇洗滌RNA沉淀一次I每ml用于初始同質(zhì)化的Trizol試劑使用至少1ml75%乙醇（可用75%乙醇預(yù)洗一次放進去乙醇，不漩渦，小心倒掉；再加入1ml乙醇）I漩渦混合I4C離心I緩慢倒出上清液，再用小離心機離心數(shù)秒，用20ul的槍移走剩余的水，以保證整個EP管的干燥是同步的。整個過程一定要小心。5、重新溶解RNAI簡單干燥RNA沉淀空氣干燥510min【將有RNA沉淀的EP管放入裝有濾紙的大培養(yǎng)皿中；不要讓RNA沉淀完全干燥，這將大大降低其溶解度】I用無RNAsefreewater（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒

9、里的一般用不完）20ul吹打幾次，溶解RNAI用紫外分光光度計測定A260/A280及RNA的濃度1.82.0比較好注：紫外分光光度計的使用：打開后面的電源一按RNA-確定RNA對應(yīng)的設(shè)置時1OD=40-向比色皿中加入50ul高溫消毒之后的三蒸水一blank將其中的水吸出一加入3ulRNA+47ul三蒸水漩渦混勻后的樣品dilutionentersample（默認(rèn)光程為10mm,比色皿光面對著自己）（應(yīng)用GeneCopoeiaTMFirstStrandcDNASynthesisKit）：1、準(zhǔn)備：緩慢顛倒混勻試劑，避免起泡，并經(jīng)瞬時離心后，放置冰上待用用于制備RNA-PrimerMix的EP管

10、需在冰上預(yù)冷。2、制備RNA-PrimerMix，輕彈幾下混勻，瞬時離心3、變性RNAI6C加熱RNA-PrimerMix,10min（RNA二級結(jié)構(gòu)打開，增加反應(yīng)產(chǎn)量）I立即放置冰上冷卻（消除RNA大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合）、4、配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：在已冷卻的RNA-PrimerMix反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積25p1。試劑組分體積終濃度RNA-PrimerMix13pl5xRTReactionBuffer5pl1x25mMdNTP1pl1mM25U/plRNaseInhibitor1pl1U/ul200U/ulM-MLVRTase(RNaseH-)1pl8U/ulddH2O(DN

11、ase/RNaseFree)4pl總體積25ul5、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)I混勻反應(yīng)Mix,瞬時離心，42C6、滅活并保存逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物I加熱至85C終止反應(yīng)一在儀上設(shè)置CI將cDNA保存于-20CPCR階段：反應(yīng)體系50pL=PCR-Mix+模板+引物1+引物2+去RNA酶的水反應(yīng)條件：95C預(yù)變性5min后，94C變性30s,55C退火40s,72C延伸1min；共進行35個循環(huán)后72C延伸10min。取10pL產(chǎn)物10%瓊脂糖凝膠電泳、照相。并采用凝膠圖像處理軟件ImageTool(IT)3.0測量灰度值，計算mRNA表達(dá)的相對值。計算方法：mRNA表達(dá)的相對值=目的基因灰度值/P-actin灰度值。凝

12、膠電泳： # 1、先高火煮瓊脂糖，見快要冒泡時即轉(zhuǎn)到低火，直至溶液清亮為止。開始可能會冒泡比較多，不要讓其溢出來，之后就不會冒出來了。2、灌膠時，先緩慢灌膠再插梳齒，不容易出氣泡。3、電泳緩沖液最好每次都用新的；至少要保證電泳緩沖液中不能有很多氣泡。3、膠跑到中間時，可以放到機子上去顯影，看有無目的條帶，是否需要繼續(xù)跑。trizol試劑盒提取總RNA。取2pg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄后各取7.5L行PCR反應(yīng)，p-actin為內(nèi)參照。TRX引物：上游為5-CATATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3，下游為5-TGTCACGCAGATGGCAACTG-3，擴增片段大小為420bp。p-actin引物：上游為5-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3，下游為5-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3，擴增片段大小為204bp。4、分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（）線性DNA片段的有效分離范圍（kb）0.51300.70.8121.00.5101.20.471.50.235、電泳緩沖液配方：貯存液/1000ml(50X)242gTris-base57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA(PH=8.0)TAE(Tris-乙酸)工作液(X)40mmol/LTris-乙酸1mmol/LED