分子生物學實驗方法精選

1、5 分子生物學研究方法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作(cozu)技術(shù)共九十四頁從20世紀中葉(zhngy)開始，分子生物學研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進步?；虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學研究的核心技術(shù)。共九十四頁基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi)并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強調(diào)了外源核酸分子在另一種不同(b tn)的

2、寄主細胞中的繁衍與性狀表達。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。共九十四頁5.1 重組DNA技術(shù)(jsh)回顧三大成就40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎問題；50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)(jigu)模型和半 保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。 共九十四頁重組DNA技術(shù)歷史上的主要事件 年份事 件 1869F Miescher

3、首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1944O.T. Avery證實DNA是遺傳物質(zhì)。1952A.D. Hershey和M.Chase再次證實和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結(jié)構(gòu)。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1958M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留復制模型。1959-1960S. Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一個遺傳

4、密碼；F. Jacob和J. Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達的操縱子模型。1964C. Yanofsky和S. Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關系。共九十四頁1965S. W. Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學家證明細菌的抗藥性通常由質(zhì)粒DNA所決定。1966M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒

5、中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細菌基因克隆。1975-1977F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測定技術(shù)。1977年完成了全長5387bp的噬菌體174基因組測定。1978首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素。1980美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。1981R. D. Palmiter和R. L. Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。共九十四頁198

6、2美、英批準使用第一例基因工程藥物-胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。1983獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984斯坦福大學獲得關于重組DNA的專利。1986GMO首次在環(huán)境中釋放。1988J. D. Watson出任人類基因組計劃首席科學家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠-Oncomouse。1992歐共體35個實驗室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定。1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25107bp)全序列測定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個高等植物擬南芥的全序列測定。2001完成第一個人

7、類基因組全序列測定。2004中國科學家完成家蠶基因組全序列測定。2005中、美、日科學家聯(lián)合完成水稻基因組全序列測定。共九十四頁限制性內(nèi)切酶限制性核酸(h sun)內(nèi)切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。 1972年Boyer實驗室第一個發(fā)現(xiàn)了核酸內(nèi)切酶EcoRI的識別序列。命名：Escherichia coli RY13 中第一個內(nèi)切酶 EcoRI.EcoRIEcoRVBsaISfiI同裂酶ApaIGGGCC/CPspOMIG/GGCCC同尾酶NcoIC/CATGGBspHIT/CATGA有一些來源(liyun)不同的限制酶識別的是同樣的核苷酸靶子序列，這類酶稱為同裂

8、酶。同裂酶的切割位點可能不同，識別和切割位點都相同的叫同序同切，識別位點相同但切割位點不同的叫同序異切酶。 一類識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能酶切產(chǎn)生相同黏性末端的限制性內(nèi)切酶。由同尾酶產(chǎn)生的DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補作用彼此連接起來的。 共九十四頁雙酶切共九十四頁單酶切共九十四頁質(zhì)粒是真核細胞細胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細菌細胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子。現(xiàn)在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體DNA以外的DNA分子。在基因(jyn)工程中質(zhì)粒常被用做基因(jyn)的載

9、體(Vector)。嚴緊型質(zhì)粒，當細胞染色體復制一次時，質(zhì)粒也復制一次，每個細胞內(nèi)只有12個質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒，當染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細胞 內(nèi)一般有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理（如氯霉素）抑制寄主蛋白質(zhì)的合成還 會使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。 功能：進行細胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。質(zhì)粒共九十四頁共九十四頁共九十四頁 載體：多數(shù)質(zhì)粒都含有半乳糖苷酶的前146個AA編碼序列和調(diào)控序列。編碼序列中包含了一個MCS，它不破壞讀碼框，不影響功能。 宿主菌：編碼半乳糖苷酶C端部分序列。 分別編碼的片段均無活性，但可融為一體(rng w

10、i y t)，形成具有酶活的蛋白質(zhì)。共九十四頁共九十四頁共九十四頁共九十四頁限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶探針標記、補平3末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標記末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾堿性磷酸酶3切除末端磷酸基DNA外切酶3末端切除單核苷酸噬菌體DNA外切酶5末端切除單核苷酸重組DNA實驗中常見(chn jin)的主要工具酶共九十四頁轉(zhuǎn)化外源DNA的進入而使細胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化。早在1943年，Avery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺炎雙球菌的DNA與無毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺炎雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。由于天然狀態(tài)下DNA進入細胞的效率很低，

11、在分子生物學和基因工程工作中可采取一些方法處理細胞，經(jīng)處理后的細胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌(d chn n jn)經(jīng)冰冷CaCl2的處理，就成為感受態(tài)細菌，當加入重組質(zhì)粒并突然由4轉(zhuǎn)入42作短時間處理，質(zhì)粒DNA就能進入細菌；用高電壓脈沖短暫作用于細菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱為電穿孔（electroporation）轉(zhuǎn)化法。共九十四頁將連接有所需要的DNA的載體導入宿主細胞的常用方法有四種：轉(zhuǎn)化，用質(zhì)粒作載體所常用的方法。轉(zhuǎn)染，用噬菌體DNA作載體所用的方法，這里所用的噬菌體DNA并沒有包上它的外殼。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。

12、轉(zhuǎn)導，用噬菌體作載體所用的方法，這里所用的噬菌體DNA被包上了它的外殼，不過這外殼并不是在噬菌體感染過程中包上，而是在離體情況下包上的，所以稱為離體包裝。注射，如果(rgu)宿主是比較大的動植物細胞則可以用注射方法把重組DNA分子導入。 共九十四頁共九十四頁核酸凝膠電泳技術(shù)細菌轉(zhuǎn)化與目標DNA分子的增殖聚合酶鏈反應技術(shù)實時定量PCR、基因組DNA文庫(wnk)構(gòu)建5.2 DNA基本操作技術(shù)(jsh)共九十四頁5.2.1 核酸(h sun)凝膠電泳技術(shù)在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，呈離子化狀態(tài)，DNA和RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰離子，把它們放置在電場當中，會向正電極的方向遷移

13、。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此(ync)它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。這就是應用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。共九十四頁準備(zhnbi)膠板配制(pizh)瓊脂糖凝膠倒膠共九十四頁上樣共九十四頁共九十四頁溴化乙錠由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射(zhosh)下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。共九十四頁DNA的遷移速度(sd)與構(gòu)型有關用酚、氯仿法從工程菌中提取的質(zhì)粒一般有三種構(gòu)像，即超螺旋，線形和開環(huán)。（開環(huán)質(zhì)粒是指雙鏈

14、環(huán)狀的質(zhì)粒DNA有部分解鏈，因此電泳速度(sd)最慢）三種構(gòu)像的質(zhì)粒在瓊脂糖電泳的前后順序是超螺旋線形開環(huán)，線形的質(zhì)粒在中間，而開環(huán)的質(zhì)粒在最后。判斷質(zhì)粒質(zhì)粒好壞的一個指標就是超螺旋質(zhì)粒在所以質(zhì)粒中的含量。共九十四頁聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)共九十四頁原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)主要是以PAGE為介質(zhì)，根據(jù)DNA分子大小和電荷分離DNA分子。染色：銀染法進行顯色。銀染的原理：1.銀離子（一般是AgNO3)和DNA結(jié)合；2.還原劑甲醛把Ag+還原成銀顆粒，最終(zu zhn)DNA呈現(xiàn)為黑褐色。特點： 根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離 分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的D

15、NA片段和DNA序列分析 分離長度僅相差0.1%（即1000bp中的1bp）的核苷酸分子聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺）和過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合(jh)形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑N,N-亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯酰胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠。聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑的濃度及比例決定的。共九十四頁普通(ptng)的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進行超大分子研究，要用到脈沖電場凝膠電泳(PFGE)共九十四頁脈沖(michng)電場凝膠電泳原理在脈沖電場中，DNA分子的遷移方向隨著電場方向

16、的周期性變化而不斷改變。由于瓊脂糖凝膠的電場方向、電流大小及作用時間都在交替變化，使得DNA分子能夠隨時調(diào)整其游動方向，以適應(shyng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。與相對分子質(zhì)量較小的DNA相比，相對分子質(zhì)量較大的DNA需要更多的脈沖次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使其按新的方向游動。應用脈沖電場凝膠電泳技術(shù)，可成功分離到高達107bp的DNA大分子。共九十四頁脈沖(michng)電場凝膠電泳效果產(chǎn)氣莢膜梭菌共九十四頁5.2.2 細菌轉(zhuǎn)化與目標(mbio)DNA分子的增殖準備轉(zhuǎn)化(zhunhu)態(tài)細胞42熱沖擊電轉(zhuǎn)化加入外源DNA細胞復蘇平板篩選CaCl210%甘油藍白斑篩選+ 抗生素 + IPTG +

17、 X-gal 要靈活運用，根據(jù)不同情況設計篩選策略！共九十四頁電轉(zhuǎn)化儀共九十四頁利用噬菌體顆粒能夠有效(yuxio)將DNA注入到宿主細胞這一特點，科學家又發(fā)明了DNA分子的體外包裝法共九十四頁延伸(ynshn)：其他基因?qū)敕椒ü簿攀捻?.2.3 聚合酶鏈反應技術(shù)(jsh)模板(mbn)引物DNA聚合酶dNTPMg2+共九十四頁變性(binxng)退火(tu hu)延伸共九十四頁PCR引物設計：引物的長度一般為15-30 bp。引物在模板內(nèi)最好具有單一性，特別是3端。引物序列的GC 含量最好在40一60，且上下游引物序列GC含量的差異不要太大。避免(bmin)形成穩(wěn)定的引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)

18、 。 引物二聚體引物特異性差（不專一(zhuny)）共九十四頁聚合酶（Taq酶）Taq酶是從水生棲熱菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分離出的具有熱穩(wěn)定性的DNA 聚合酶。與一般(ybn)酶不同,用Taq酶擴增DNA時常使3端凸出一個A，可用于TA Cloning. 高保真PCR酶利用自身的35外切(wi qi)酶活性（pfu DNA Polymerase，PrimeSTAR HS DNA Polymerase等）能保證PCR產(chǎn)物的保真度，但擴增的PCR產(chǎn)物為不帶A尾的平末端DNA片段，不能直接TA克隆。共九十四頁RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄(zhun l)PCR)共九十四頁5

19、.2.4 實時(sh sh)定量PCR共九十四頁什么(shn me)是Real Time PCR? 在PCR反應體系中加入熒光基團利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行(jnxng)定量分析的方法與普通PCR的區(qū)別普通PCR:在PCR結(jié)束后對終點產(chǎn)物進行定量分析。 Real Time PCR : 實時檢測PCR擴增，在擴增的指數(shù)期對起始模板進行定量。 共九十四頁Real Time PCR的數(shù)學原理 共九十四頁Real Time PCR的數(shù)學原理Ct的定義: 擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。此時擴增是呈對數(shù)(du sh)期增長。C-Cycle t-th

20、reshold共九十四頁Real Time PCR的數(shù)學原理Ct值與模板(mbn)的關系 研究表明(biomng),每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系,其實拷貝數(shù)越多,Ct值越小.利用已知拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標代表Ct值.因此,只要獲得Ct值,即可從標準曲線上獲得模板的起始拷貝數(shù)共九十四頁Real Time PCR的化學(huxu)原理根據(jù)Real Time PCR的化學發(fā)光原理可以(ky)分為2 大類： 探針類:包括TaqMan探針和分子信標，利用與靶序列 特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加 非探針類:其中包括如SYBR Gr

21、een I 或者特殊設計的引 物(如LUXPrimers)通過熒光染料來指示產(chǎn)物的 增加。共九十四頁Real Time PCR的化學(huxu)原理TaqMan探針(tn zhn) TaqMan探針是最早用于定量的方法。在PCR 擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5端標記一個報告熒光基團，3端標記一個淬滅熒光基團。 探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，也就是FRET 反應；PCR 擴增時，Taq 酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實

22、現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR 產(chǎn)物形成完全同步。 而新型TaqMan-MGB 探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。共九十四頁Real Time PCR的化學(huxu)原理TaqMan探針(tn zhn)的FRET共九十四頁Real Time PCR的化學(huxu)原理1.退火,開始聚合4.聚合完成2.復制后遇到探針3.Taq酶的5 3外切活性TaqMan探針(tn zhn)共九十四頁數(shù)量(shling)關系: 每產(chǎn)生一條(y tio)DNA鏈，就切斷一條(y tio)探針 每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個單位信號 信號強度與

23、結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比優(yōu)點:對目標序列的高特異性-陰性結(jié)果確定引物設計相對簡單重復性比較好缺點:只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高共九十四頁Real Time PCR的化學(huxu)原理1.引物、探針的設計 探針Tm為68-70，30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段400 bp，引物Tm為59-602.反應參數(shù)的確定 95 ,3min94 ，15S 60 ，60S3.優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4.其他與常規(guī)PCR相同40 cyclePCR反應(fnyng)的構(gòu)建

24、TaqMan探針共九十四頁Real Time PCR的化學(huxu)原理SYBR Green 法SYBR Green I 是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA 結(jié)合染料，與雙鏈DNA 結(jié)合后，其熒光大大(d d)增強。共九十四頁Real Time PCR的化學(huxu)原理SYBR Green 法工作機理:SYBR Green只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光在延伸結(jié)束階段采集(cij)熒光信號。SYBR Green也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應結(jié)束 時做熔解曲線分析。共九十四頁Real Time PCR的化學(huxu)原理SYBR Green 法熔

25、解曲線(qxin)分析單一峰無非特異性熒光,定量準確出現(xiàn)雜峰,即出現(xiàn)非特異性熒光,定量不準確共九十四頁Real Time PCR的化學(huxu)原理SYBR Green 法SYBR Green PCR反應體系的建立和優(yōu)化SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光(ynggung)信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應Buffer 體系的優(yōu)化反應溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同共九十四頁優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性-適用于任何DNA使用方便-不必設計復雜探針非

26、常(fichng)靈敏便宜缺點:容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應條件對引物特異性要求較高SYBR Green 法Real Time PCR的化學(huxu)原理共九十四頁SYBR Green 法數(shù)量(shling)關系:每形成一個DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去染料一結(jié)合，就產(chǎn)生熒光信號信號強度與DNA分子總數(shù)目成正比Real Time PCR的化學(huxu)原理共九十四頁Real Time PCR的應用(yngyng)絕對(judu)定量(Absolute Quantification，AQ) 病原體檢測轉(zhuǎn)基因食品檢測基因表達研究 相對定量(

27、Relative Quantification，RQ)基因在不同組織中的表達差異藥物療效考核耐藥性研究 實時PCR分析共九十四頁Real Time PCR的應用(yngyng)等位基因分型(Allelic Discrimination，AD) 基因突變分析SNP研究物種鑒定(jindng)、菌株鑒定(jindng) 陰性陽性鑒定(Plus/Minus with IPC，+/-) 終點分析共九十四頁5.2.5 重亞硫酸鹽測序技術(shù)(jsh)確定某個(mu )堿基位點的甲基化情況注意：引物設計、多次測序避免產(chǎn)生同源測序。共九十四頁5.2.6 基因組DNA文庫(wnk)的構(gòu)建從生物組織細胞提取出全部D

28、NA將其切成預期大小的片段，分別與載體連接，轉(zhuǎn)入(zhun r)受體細菌或細胞，形成克隆。這樣每一個細胞接受了含有一個基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴增，許多細胞一起組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫。如果這個文庫足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫。共九十四頁用噬菌體建立DNA文庫(wnk)示意圖其他載體：bacterial artificial chromosome (BAC) p1 artificial chromosome (PAC)yeast artificial chromosome (PA

29、C)共九十四頁5.3 RNA基本操作技術(shù)(jsh)總RNA的提取(tq)mRNA的純化cDNA的合成cDNA文庫的構(gòu)建基因文庫的篩選共九十四頁5.3.1 總RNA的提取(tq)RNA易遭降解，實驗要求較嚴格(yng)。總RNA提取的方法有多種，主要有LiCl法、CTAB法、異硫氰酸胍法（TriZol）。異硫氰酸胍法（TriZol）原理：TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的

30、蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。共九十四頁5.3.2 mRNA的純化(chn hu)共九十四頁5.3.3 cDNA的合成(hchng)共九十四頁共九十四頁5.3.4 cDNA文庫(wnk)的構(gòu)建cDNA 文庫是指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典 cDNA 文庫構(gòu)建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當?shù)倪B接接頭，連接到適當?shù)妮d體中獲得文庫。步驟：在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成接頭的加入

31、、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進行鑒定。這里強調(diào)的是對載體的選擇，常規(guī)用的是 噬菌體，這是因為 DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端(m dun)，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。共九十四頁5.3.4 基因文庫的篩選(shixun)基因文庫的篩選(shixun)是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選方法有很多種，常用的有：核酸雜交法PCR篩選法免疫篩選法共九十四頁核酸(h sun)雜交法共九十四頁PCR篩選(shixun)后稀釋PCR篩選(shix

32、un)后稀釋PCR篩選后稀釋PCR篩選法共九十四頁免疫篩選法共九十四頁5.4 基因(jyn)克隆技術(shù)在多細胞的高等生物個體水平上，人們用克隆(k ln)（clone）表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic twins）便是屬于同一克隆。在細胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細胞（progenitor cell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。在分子生物學上，人們把將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制這種過程稱為克隆。共九十四頁5.4.1 RACE技術(shù)(jsh)RACE（rapid am

33、plification of cDNA ends, cDNA末端快速擴增）是一種獲得轉(zhuǎn)錄本5或3未知序列(xli)的方法。它根據(jù)已知序列(xli)設計基因片段內(nèi)部特異引物， 用cDNA進行PCR擴增得到目的序列。用于擴增5端的方法稱為5RACE，用于擴增3端的稱為3RACE。已知cDNA序列可來自序列表達標簽、減法cDNA庫、差法顯示和基因文庫篩選。共九十四頁共九十四頁5.4.2 應用cDNA差示法分析克隆(k ln)基因cDNA差示分析法（representational difference analysis, RAD）充分發(fā)揮了PCR能以指數(shù)形式擴增雙鏈DNA模板，僅以線形形式擴增單鏈模

34、板的特性，通過(tnggu)降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片斷。共九十四頁加去磷酸化的接頭(ji tu)混合(hnh)、變性、復性填平粘性末端指數(shù)擴增線性擴增無擴增以 為引物的PCR試驗材料Tester探針材料Driver共九十四頁加去磷酸化的接頭(ji tu)混合(hnh)、變性、復性填平粘性末端指數(shù)擴增線性擴增無擴增以 為引物的PCR試驗材料Tester探針材料Driver共九十四頁5.4.3 Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)共九十四頁共九十四頁Gateway技術(shù)是基于已研究的非常清楚的噬菌體位點特異重組系統(tǒng)（attB x attP attL x att

35、R）。BP和LR兩個反應就構(gòu)成了Gateway技術(shù)。BP反應是利用一個attB DNA片段或表達克隆和一個attP供體載體之間的重組反應，創(chuàng)建一個入門克隆。LR反應是一個attL入門克隆和一個attR目的載體之間的重組反應。LR反應用來在平行的反應中轉(zhuǎn)移(zhuny)目的序列到一個或更多個目的載體。共九十四頁共九十四頁共九十四頁5.5 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學技術(shù)(jsh)蛋白質(zhì)組學（Proteomics）一詞，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組學（genomics）兩個詞的組合，意指“一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白(dnbi)質(zhì)組本質(zhì)上指的是

36、在大規(guī)模水平上研究蛋白(dnbi)質(zhì)的特征，包括蛋白(dnbi)質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白(dnbi)與蛋白(dnbi)相互作用等，由此獲得蛋白(dnbi)質(zhì)水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識。 共九十四頁5.5.1 雙向電泳技術(shù)(jsh)雙向電泳（ 2-DE ）由OFarrells于1975年首次建立并成功地分離約1 000個E.coli蛋白，并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的，而是隨環(huán)境而變化。雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后(suhu)，再沿垂直的方向進行分子量的分離。pH3pH10IEFSDS 共九十四頁 等電聚焦電泳（IEF）原理：利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個pH梯度，電泳時每種蛋白質(zhì)就將遷移到等于其等電點（pI）的pH處（此時此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負電荷），形成一個很窄的區(qū)帶。 SDS原理：SDS帶大量負電荷，蛋白質(zhì)在SDS凝膠電場中的運動速率和距離完全(wnqun)取決于其相對分子質(zhì)量而不受其所帶電荷的影響，不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)將位于凝膠的不同區(qū)段而得到分離。共九十四頁步驟(bzhu)細胞(xbo)或組織樣品樣品制備二向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)顯色