DB15T 2594-2022紫花苜蓿組織培養(yǎng)技術規(guī)程

1、ICS65.020.20CCSB 2115 內 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標 準DB15/T 25942022紫花苜蓿組織培養(yǎng)技術規(guī)程Technical code of practice for tissue culture of medicago sativa2022-06-24 發(fā)布2022-07-24 實施內蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā) 布 DB15/T 25942022前言本文件按照GB/T 1.12020標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則的規(guī)定起草。 本文件由內蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原局提出并歸口。 本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所、內蒙古農(nóng)業(yè)大學。本文件主要起

2、草人：徐春波、王勇、趙海霞。 I DB15/T 25942022DB15/T 25942022紫花苜蓿組織培養(yǎng)技術規(guī)程范圍本文件規(guī)定了紫花苜蓿組織培養(yǎng)的術語與定義、培養(yǎng)基、外植體、愈傷組織誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗與移栽等基本內容及技術要求。 本文件適用于紫花苜蓿組織培養(yǎng)育苗。 規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 603 化學試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備NY/T 2306 花卉種苗組培快繁技術規(guī)程

3、 DB15/T 1940 西部沙櫻組織培養(yǎng)技術規(guī) 術語和定義NY/T 2306界定的術語和定義適用于本文件。 紫花苜蓿 medicago sativa L.屬于豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago）多年生草本植物。 4 環(huán)境與器具滅菌按照DB15/T 1940操作。 5 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基、1/2 MS、改良SH培養(yǎng)基和MSO培養(yǎng)基見附錄A。 母液的配制和保存5.2.1 配 制將常用試劑配制成50100倍的母液，嚴格按照GB/T 603規(guī)定方法配制。所用激素均配制濃度為0.5 mg/mL，配制方法詳見附錄B。 1 5.2.2 保 存母液配制好分別貼上標簽，注明溶液名

4、稱、配制倍數(shù)、配制日期、配制者。母液貯存在4 的冰箱中。貯藏時間在3個月之內，有霉菌和沉淀產(chǎn)生，則不準許使用。 培養(yǎng)基的配制配制配置1 L培養(yǎng)基時，先加蒸餾水600 ml700 ml，再加入7.5 g瓊脂，加熱攪拌瓊脂融化后加入25 g 蔗糖，攪拌溶解后再分別加入母液，攪拌均勻，加蒸餾水定容至1 L。 pH 值調節(jié)用1 mol/L的NaOH將配制好的培養(yǎng)基調到pH值5.86.0，用酸度計或精密pH試紙測定。 分裝和滅菌配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝。分裝量以占培養(yǎng)容器的1/41/3為宜。切勿將培養(yǎng)基沾到瓶口和外壁上， 以免招致雜菌污染。分裝后立即加蓋，不同的處理做好標記。分裝后進行滅菌，121 狀態(tài)下

5、保持20 min。 6 外植體 無菌苗的培養(yǎng)紫花苜蓿種子用75%的酒精滅菌3 min5 min，無菌水沖洗，再用10%次氯酸鈉消毒10 min15 min，無菌水沖洗56次后用滅菌的濾紙吸干種子表面的液體，接種到1/2 MS培養(yǎng)基上。 外植體的選擇和制備取7 d10 d無菌苗的子葉和下胚軸或15 d20 d無菌苗的葉片、葉柄和莖段，將外植體剪成3 mm5 mm長的小塊或小段。 7 愈傷組織誘導培養(yǎng)培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)基為改良SH+2.0 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA。 接種將外植體接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，每2.5 cm23 cm2接種1個，均勻擺放，封好皿口，標明名稱和日期

6、。 培養(yǎng)條件白天25 、晚上18 ，每天光照時間16 h，光照強度1000 Lux2000 Lux。 培養(yǎng)時間培養(yǎng)20 d30 d。 2 增殖培養(yǎng)培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基1為MSO+0.5 mg/L NAA+ 1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L AgNO3。增殖培養(yǎng)基2為MS+0.3 mg/L TDZ。 接種在超凈工作臺上，將誘導出的愈傷組織轉到增殖培養(yǎng)基上，每4 cm25 cm2接種1個，均勻擺放，封好皿口，標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件按照7.3進行。 培養(yǎng)時間增殖培養(yǎng)基1培養(yǎng)14 d20 d，移到增殖培養(yǎng)基2繼續(xù)培養(yǎng)5 d7 d，之后再移至增殖培養(yǎng)基1培養(yǎng)10 d15 d。 分化培養(yǎng)培養(yǎng)基

7、分化培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L KT。 接種在超凈工作臺上，將胚性愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基，每5 cm26 cm2接種1個，均勻擺放，封好瓶口， 標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件按照7.3進行。 培養(yǎng)時間培養(yǎng)40 d50 d；每20 d換1次培養(yǎng)基。 10 生根培養(yǎng) 培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基為1/2 MS。 接種在超凈工作臺上，將長至3 cm5 cm的小苗逐一轉入生根培養(yǎng)基，每器皿接種1苗，封好瓶口，標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件3 按照7.3進行。 培養(yǎng)時間培養(yǎng)20 d30 d。 11 煉苗與移栽煉苗選擇生長健壯的組培苗，打開封口膜，放在自然光、室溫下2 d3 d。 基質土:草碳:蛭石3:2:1混合。高壓滅

8、菌后裝入花盆備用。 移栽取出組培苗，洗掉培養(yǎng)基，栽入花盆，澆水，放入溫室，適當保溫，常規(guī)管理。待苗長至20 cm30 cm移栽至大田。 4 AA 附 錄 A（規(guī)范性） 基本培養(yǎng)基成分基本培養(yǎng)基成分見表A.1 。 表A.1 基本培養(yǎng)基成分類型 組分 MS 培養(yǎng)基 改良 SH 培養(yǎng)基 MSO 培養(yǎng)基 大量元素 KNO3 1900.0 2830.0 1900.0 NH4NO3 1650.0 463.0 1650.0 MgSO47H2O 370.0 185.0 370.0 KH2PO4 170.0 400.0 170.0 CaCl22H2O 440.0 166.0 440.0 微量元素 MnSO44H

9、2O 22.300 - 22.300 ZnSO47H2O 8.600 8.600 8.600 H3BO3 6.200 - 6.200 KI 0.830 - 0.830 Na2MoO46H2O 0.250 0.250 0.250 CuSO4.5H2O4 0.025 0.025 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 0.025 鐵鹽 Na2-EDTA 37.30 37.30 37.30 FeSO4.7H2O 27.80 27.80 27.80 有機物 甘氨酸 2.000 - - 鹽酸吡哆辛 0.500 9.500 1.000 鹽酸硫銨素 0.100 9.900 10.000 煙酸 0.500 - 1.000 肌醇 100.000 - 100.000 尼克酸 - 4.500 - 5 BB 附 錄 B（規(guī)范性） 激素的配制激素的配制見表B.1 。 表B.1 激素的配制類別 名稱 配制方法 滅菌方式 存儲方式 生長素 2，4-二氯苯氧乙酸 （2，4-D） 用適量無水乙醇溶解后加入去離子水定容。 高溫滅菌 冷藏（4 ）， 密封，避光保存 萘乙酸（NAA） 細胞分裂素6-芐基嘌