DB15T 2594-2022紫花苜蓿組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

1、ICS65.020.20CCSB 2115 內(nèi) 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB15/T 25942022紫花苜蓿組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程Technical code of practice for tissue culture of medicago sativa2022-06-24 發(fā)布2022-07-24 實(shí)施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布 DB15/T 25942022前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。 本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原局提出并歸口。 本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件主要起

2、草人：徐春波、王勇、趙海霞。 I DB15/T 25942022DB15/T 25942022紫花苜蓿組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了紫花苜蓿組織培養(yǎng)的術(shù)語(yǔ)與定義、培養(yǎng)基、外植體、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗與移栽等基本內(nèi)容及技術(shù)要求。 本文件適用于紫花苜蓿組織培養(yǎng)育苗。 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 603 化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備N(xiāo)Y/T 2306 花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程

3、 DB15/T 1940 西部沙櫻組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī) 術(shù)語(yǔ)和定義NY/T 2306界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。 紫花苜蓿 medicago sativa L.屬于豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago）多年生草本植物。 4 環(huán)境與器具滅菌按照DB15/T 1940操作。 5 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基、1/2 MS、改良SH培養(yǎng)基和MSO培養(yǎng)基見(jiàn)附錄A。 母液的配制和保存5.2.1 配 制將常用試劑配制成50100倍的母液，嚴(yán)格按照GB/T 603規(guī)定方法配制。所用激素均配制濃度為0.5 mg/mL，配制方法詳見(jiàn)附錄B。 1 5.2.2 保 存母液配制好分別貼上標(biāo)簽，注明溶液名

4、稱(chēng)、配制倍數(shù)、配制日期、配制者。母液貯存在4 的冰箱中。貯藏時(shí)間在3個(gè)月之內(nèi)，有霉菌和沉淀產(chǎn)生，則不準(zhǔn)許使用。 培養(yǎng)基的配制配制配置1 L培養(yǎng)基時(shí)，先加蒸餾水600 ml700 ml，再加入7.5 g瓊脂，加熱攪拌瓊脂融化后加入25 g 蔗糖，攪拌溶解后再分別加入母液，攪拌均勻，加蒸餾水定容至1 L。 pH 值調(diào)節(jié)用1 mol/L的NaOH將配制好的培養(yǎng)基調(diào)到pH值5.86.0，用酸度計(jì)或精密pH試紙測(cè)定。 分裝和滅菌配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝。分裝量以占培養(yǎng)容器的1/41/3為宜。切勿將培養(yǎng)基沾到瓶口和外壁上， 以免招致雜菌污染。分裝后立即加蓋，不同的處理做好標(biāo)記。分裝后進(jìn)行滅菌，121 狀態(tài)下

5、保持20 min。 6 外植體 無(wú)菌苗的培養(yǎng)紫花苜蓿種子用75%的酒精滅菌3 min5 min，無(wú)菌水沖洗，再用10%次氯酸鈉消毒10 min15 min，無(wú)菌水沖洗56次后用滅菌的濾紙吸干種子表面的液體，接種到1/2 MS培養(yǎng)基上。 外植體的選擇和制備取7 d10 d無(wú)菌苗的子葉和下胚軸或15 d20 d無(wú)菌苗的葉片、葉柄和莖段，將外植體剪成3 mm5 mm長(zhǎng)的小塊或小段。 7 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良SH+2.0 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA。 接種將外植體接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每2.5 cm23 cm2接種1個(gè)，均勻擺放，封好皿口，標(biāo)明名稱(chēng)和日期

6、。 培養(yǎng)條件白天25 、晚上18 ，每天光照時(shí)間16 h，光照強(qiáng)度1000 Lux2000 Lux。 培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)20 d30 d。 2 增殖培養(yǎng)培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基1為MSO+0.5 mg/L NAA+ 1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L AgNO3。增殖培養(yǎng)基2為MS+0.3 mg/L TDZ。 接種在超凈工作臺(tái)上，將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上，每4 cm25 cm2接種1個(gè)，均勻擺放，封好皿口，標(biāo)明名稱(chēng)和日期。 培養(yǎng)條件按照7.3進(jìn)行。 培養(yǎng)時(shí)間增殖培養(yǎng)基1培養(yǎng)14 d20 d，移到增殖培養(yǎng)基2繼續(xù)培養(yǎng)5 d7 d，之后再移至增殖培養(yǎng)基1培養(yǎng)10 d15 d。 分化培養(yǎng)培養(yǎng)基

7、分化培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L KT。 接種在超凈工作臺(tái)上，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，每5 cm26 cm2接種1個(gè)，均勻擺放，封好瓶口， 標(biāo)明名稱(chēng)和日期。 培養(yǎng)條件按照7.3進(jìn)行。 培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)40 d50 d；每20 d換1次培養(yǎng)基。 10 生根培養(yǎng) 培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基為1/2 MS。 接種在超凈工作臺(tái)上，將長(zhǎng)至3 cm5 cm的小苗逐一轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，每器皿接種1苗，封好瓶口，標(biāo)明名稱(chēng)和日期。 培養(yǎng)條件3 按照7.3進(jìn)行。 培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)20 d30 d。 11 煉苗與移栽煉苗選擇生長(zhǎng)健壯的組培苗，打開(kāi)封口膜，放在自然光、室溫下2 d3 d。 基質(zhì)土:草碳:蛭石3:2:1混合。高壓滅

8、菌后裝入花盆備用。 移栽取出組培苗，洗掉培養(yǎng)基，栽入花盆，澆水，放入溫室，適當(dāng)保溫，常規(guī)管理。待苗長(zhǎng)至20 cm30 cm移栽至大田。 4 AA 附 錄 A（規(guī)范性） 基本培養(yǎng)基成分基本培養(yǎng)基成分見(jiàn)表A.1 。 表A.1 基本培養(yǎng)基成分類(lèi)型 組分 MS 培養(yǎng)基 改良 SH 培養(yǎng)基 MSO 培養(yǎng)基 大量元素 KNO3 1900.0 2830.0 1900.0 NH4NO3 1650.0 463.0 1650.0 MgSO47H2O 370.0 185.0 370.0 KH2PO4 170.0 400.0 170.0 CaCl22H2O 440.0 166.0 440.0 微量元素 MnSO44H

9、2O 22.300 - 22.300 ZnSO47H2O 8.600 8.600 8.600 H3BO3 6.200 - 6.200 KI 0.830 - 0.830 Na2MoO46H2O 0.250 0.250 0.250 CuSO4.5H2O4 0.025 0.025 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 0.025 鐵鹽 Na2-EDTA 37.30 37.30 37.30 FeSO4.7H2O 27.80 27.80 27.80 有機(jī)物 甘氨酸 2.000 - - 鹽酸吡哆辛 0.500 9.500 1.000 鹽酸硫銨素 0.100 9.900 10.000 煙酸 0.500 - 1.000 肌醇 100.000 - 100.000 尼克酸 - 4.500 - 5 BB 附 錄 B（規(guī)范性） 激素的配制激素的配制見(jiàn)表B.1 。 表B.1 激素的配制類(lèi)別 名稱(chēng) 配制方法 滅菌方式 存儲(chǔ)方式 生長(zhǎng)素 2，4-二氯苯氧乙酸 （2，4-D） 用適量無(wú)水乙醇溶解后加入去離子水定容。 高溫滅菌 冷藏（4 ）， 密封，避光保存 萘乙酸（NAA） 細(xì)胞分裂素6-芐基嘌