PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

1、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)；掌握群體遺傳學(xué)基因頻率與基因型頻率的計(jì)算方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】凝膠電泳是分離、鑒定、純化及制備DNA片段最常用的方法，可分為兩類(lèi)， 一類(lèi)是瓊脂糖凝膠電泳，適用于l kb和大于l kb以上DNA；另一類(lèi)是聚丙烯酰 胺凝膠電泳，適用于小于lkb的DNA。瓊脂糖凝膠電泳是一種簡(jiǎn)便易行的分離、 純化和鑒定DNA片段的方法。分為水平板和垂直板兩種，一般采用水平電泳。瓊脂糖凝膠在DNA分子泳動(dòng)時(shí)兼有“分子篩”和“電荷”的雙重作用。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。由于瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此電泳時(shí)

2、，帶電顆粒的分離速度不僅取決 于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小。由于實(shí)驗(yàn)中相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以同樣 的速度向正極移動(dòng)。相對(duì)分子質(zhì)量小者泳動(dòng)快，大的泳動(dòng)慢。漠化乙錠是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的DNA熒光染料，含有一個(gè)可以嵌入 DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)，它與DNA的結(jié)合幾乎沒(méi)有堿基序列特異 性。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，被吸收的能量在可見(jiàn)光譜紅橙區(qū)的 590nm處重新發(fā)射出來(lái)。漠化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒(méi)有結(jié)合DNA的染料 高出20-30倍。所以當(dāng)凝膠中含有游離的漠化乙錠（0.5g/mL）時(shí)，可以檢測(cè)到少至10ng的

3、DNA條帶TBE （成分：Tris，EDTA，硼酸，蒸餾水）的作用：穩(wěn)定體系酸堿度（正負(fù)極氧化還原反應(yīng)，使正極變酸、負(fù)極變堿性）使溶液具有導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移其中的EDTA螯合鎂離子，防止電泳時(shí)激活DNA酶引物二聚體：引物二聚體是引物的3端間相互錯(cuò)配擴(kuò)增形成的。引物二 聚體的出現(xiàn)是必然的，只是或多或少的問(wèn)題，電泳時(shí)看不到引物二聚體帶也不代 表沒(méi)有二聚體出現(xiàn)，只是含量低我們的肉眼看不到而已。優(yōu)化PCR的實(shí)驗(yàn)條件（包 括提高退火溫度，降低引物濃度等）可大大降低二聚體的濃度。11. Loading Buffer指示劑漠酚藍(lán)，可以顯示電泳的進(jìn)程；甘油成分增加樣品密度，是樣品密度大于電泳緩沖液

4、，防止樣品飄出點(diǎn)樣孔?！緦?shí)驗(yàn)過(guò)程及注意事項(xiàng)】（實(shí)驗(yàn)所用試劑及其作用）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備器材 離心機(jī)、離心管、記號(hào)筆、移液器、移液器吸頭、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、 紫外透射箱等。試劑 0.5XTBE、上樣緩沖液（loading buffer）、瓊脂糖、漠化乙錠、DNAmarker 等。材料PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。制備瓊脂糖凝膠：用1%TBE150ml緩沖液（1XTBE）溶解2.25g瓊脂糖，放入三角瓶中，微波爐 加熱煮沸（注意搖動(dòng)時(shí)避免產(chǎn)生氣泡），待瓊脂糖完全溶解后，冷卻至60C （不 燙手），加10ulEB，混勻、倒膠。制板：將膠倒入制膠板內(nèi)，室溫下充分凝固（約2h），豎直拔下梳子。將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入緩沖液，

5、沒(méi)過(guò)膠面12mm。點(diǎn)樣：（上樣時(shí)要輕、穩(wěn)、準(zhǔn)、快）注意：1%TBE緩沖液沒(méi)過(guò)膠面廣2mm，用移液器小心加入10ul PCR產(chǎn)物，留出 5ul Marker 的位置。電泳：接通電源，注意電極方向，電泳約25分鐘。觀(guān)察：取下瓊脂糖凝膠，放置在紫外投射箱中觀(guān)察。分析。汪意事項(xiàng)電泳通常選擇直流電源，電壓在1-2V/cm,在25C左右的室溫中進(jìn)行。溫度過(guò)高會(huì)加速DNA分子擴(kuò)散，使條帶變寬、模糊。注意每個(gè)上樣孔的載樣量，太少會(huì)使條帶不明顯；太多則會(huì)造成條帶拖尾。EB可以嵌入堿基分子中，導(dǎo)致錯(cuò)配。許多人認(rèn)為漠化乙錠是強(qiáng)誘變劑，具有高 致癌性。不可以直接接觸。拔梳子時(shí)候要垂直拔出。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論】（上傳瓊脂

6、糖凝膠電泳結(jié)果圖片，是否得到電泳條帶，并說(shuō) 明原因）本人得到了電泳條帶，本班電泳條帶比例為II型13人，ID型11人，DD型9人。本班內(nèi)：I 的基因頻率為（13*2+11） /66=0.56;D的基因頻率為0.44部分人沒(méi)有得到條帶，可能是以下原因：1上樣液發(fā)生擴(kuò)散飄移，而擴(kuò)增濃度達(dá)不到，電泳結(jié)果不明顯。DNA提取量太少，眼科剪未剪碎棉簽頭部，導(dǎo)致棉簽頭部過(guò)大，離心后吸取 DNA提取液（上清液），造成了 DNA提取液量比較少；也有可能是棉簽刮擦力度不夠，導(dǎo)致未得到電泳條帶瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖【思考題】某研究小組調(diào)查了某地區(qū)1000名無(wú)關(guān)個(gè)體ACE基因I/D的多態(tài)性分 布，其中608名為II基因型，ID基因型個(gè)體的基因型頻率為0.32, DD基因型個(gè) 體38人，50人未檢出，計(jì)算等位基因I與D的基因頻率。50人未檢出，即實(shí)際檢出950人故：ID基因型人數(shù)：0.32*950=304人基因頻率：群體中等位基因D的頻率：p= (38x2+304) /1900=0.20群體中等位基因I的頻率：q= (608x2+304) /1900=0.80答：I基因頻