臨床免疫學(xué)：第七章-免疫比濁技術(shù)課件(46頁(yè)P(yáng)PT)

1、第七章 免疫比濁技術(shù)第1頁(yè)，共46頁(yè)。 第一節(jié) 免疫比濁的類型第2頁(yè)，共46頁(yè)。免疫比濁技術(shù)（immunoturbidimetric assay, IA）將液相中沉淀反應(yīng)與現(xiàn)代光學(xué)儀器和自動(dòng)化分析技術(shù)相結(jié)合的一項(xiàng)免疫分析技術(shù)。當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時(shí)，在一定的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度，利用現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器對(duì)濁度進(jìn)行測(cè)定從而檢測(cè)抗原含量。第3頁(yè)，共46頁(yè)。免疫比濁技術(shù)沉淀反應(yīng)液體內(nèi)沉淀反應(yīng)絮狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀反應(yīng)單向擴(kuò)散試驗(yàn)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)免疫電泳技術(shù)免疫電泳免疫固定電泳第4頁(yè)，共46頁(yè)。免疫比濁技術(shù)的分類所檢測(cè)的光信號(hào)性質(zhì)測(cè)

2、定時(shí)間增敏劑透射免疫比濁散射免疫比濁終點(diǎn)法速率法無(wú)增敏PEG增敏膠乳增敏第5頁(yè)，共46頁(yè)。透射免疫比濁法基本原理一定波長(zhǎng)的光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)的溶液時(shí)，由于抗原抗體復(fù)合物的形成使入射光被反射、吸收，透射光減少，光吸收量增多。入射光被吸收的量與抗原抗體復(fù)合物形成的量呈正相關(guān)。測(cè)量通過(guò)反應(yīng)體系后的透射光強(qiáng)度，或者測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度，即可推導(dǎo)出溶液中待測(cè)物質(zhì)的濃度。第6頁(yè)，共46頁(yè)。分光光度計(jì)/光電比色計(jì)濁度儀第7頁(yè)，共46頁(yè)。透射免疫比濁法基本流程與方法1、將已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品作適當(dāng)稀釋；2、將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液與適當(dāng)過(guò)量的抗血清混合，在一定的反應(yīng)條件下，待抗原抗體反應(yīng)完成后，在一定波長(zhǎng)下

3、檢測(cè)各標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度；3、按一定方法進(jìn)行曲線擬合，以標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度及所測(cè)得吸光度值確定劑量-反應(yīng)曲線；4、用已知濃度的質(zhì)控品（第三方）檢測(cè)定標(biāo)結(jié)果的質(zhì)量；5、根據(jù)待測(cè)標(biāo)本管的吸光度值，按劑量-反應(yīng)曲線求得標(biāo)本中抗原的濃度。定標(biāo)（calibration）質(zhì)控（quality control）標(biāo)本檢測(cè)（sample testing）第8頁(yè)，共46頁(yè)。透射免疫比濁法技術(shù)要點(diǎn)1、由于抗原抗體復(fù)合物顆粒大小多在35-100nm之間，被近紫外光線照射可獲得最大吸收峰，故選擇290410nm波長(zhǎng)的光線測(cè)定效果最好，目前多選用340nm的波長(zhǎng)；2、如果待測(cè)反應(yīng)液中形成的抗原抗體復(fù)合物顆粒太小或數(shù)量太少時(shí)，阻擋不

4、了光線的通過(guò)，影響結(jié)果準(zhǔn)確性，因此選擇檢測(cè)抗體的分子量需足夠大或抗體的數(shù)量需足夠多；標(biāo)本用量相應(yīng)增多第9頁(yè)，共46頁(yè)。3、使用非離子型聚合物，如PEG,可提高復(fù)合物形成速度，縮短檢測(cè)時(shí)間并增加反應(yīng)液的濁度，從而提高檢測(cè)的靈敏度；4、反應(yīng)體系的溫度和時(shí)間將影響抗原抗體復(fù)合物的形成及穩(wěn)定性；5、抗體親和力好、效價(jià)高，且保證過(guò)量；第10頁(yè)，共46頁(yè)。透射免疫比濁法方法評(píng)價(jià)1、操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，結(jié)果較準(zhǔn)確；2、能用全自動(dòng)或半自動(dòng)化儀器進(jìn)行檢測(cè)；3、靈敏度比單向免疫擴(kuò)散法高510倍，但是比散射免疫比濁法低；4、要求抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠多、足夠大，故耗時(shí)長(zhǎng)。根據(jù)透射光減弱的原理來(lái)定量，分子太小則入射

5、光直接通過(guò)，只能測(cè)定抗原-抗體反應(yīng)的第二階段。第11頁(yè)，共46頁(yè)。散射免疫比濁法基本原理一定波長(zhǎng)的光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)的溶液時(shí)，溶液中的抗原抗體復(fù)合物會(huì)對(duì)入射光產(chǎn)生折射、偏轉(zhuǎn)，從而產(chǎn)生散射光，通過(guò)測(cè)定散射光的強(qiáng)度進(jìn)而推算得到待測(cè)抗原的含量。第12頁(yè)，共46頁(yè)。散射免疫比濁法基本流程與方法 以標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度及所測(cè)得散射光度值制作劑量-反應(yīng)曲線，依據(jù)所測(cè)散射光強(qiáng)度可以計(jì)算出待測(cè)抗原含量。散射光的強(qiáng)度與免疫復(fù)合物的含量、大小、偏轉(zhuǎn)角度、形狀有關(guān)，與反應(yīng)時(shí)間、光源的強(qiáng)度、波長(zhǎng)也有關(guān)。第13頁(yè)，共46頁(yè)。散射免疫比濁法如何檢測(cè)散射光根據(jù)免疫復(fù)合物顆粒直徑與入射光波長(zhǎng)的關(guān)系,散射光路可以分為三種：Rayle

6、igh散射(d/20)Rayleigh-Debye散射(/20 d )Mie散射(d )第14頁(yè)，共46頁(yè)。散射免疫比濁法第15頁(yè)，共46頁(yè)。散射免疫比濁法免疫復(fù)合物形成的散射光多數(shù)屬于Rayleigh散射，其光強(qiáng)度計(jì)算公式為：適當(dāng)增加抗原-抗體的體積，減少入射光的波長(zhǎng)，減小檢測(cè)角度，以及使用激光、較短波長(zhǎng)等高強(qiáng)度光源作為入射光，都可提高檢測(cè)靈敏度。（=0 ？）第16頁(yè)，共46頁(yè)。散射免疫比濁法的類型終點(diǎn)散射比濁法（end-point nephelometry）： 在免疫反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間時(shí)測(cè)定其濁度，故又被稱為定時(shí)散射比濁法（fixed time nephelometry ）分為兩個(gè)階段預(yù)反

7、應(yīng)階段反應(yīng)階段 第17頁(yè)，共46頁(yè)。終點(diǎn)散射比濁法技術(shù)要點(diǎn)保證檢測(cè)時(shí)所獲取的信號(hào)峰值是由被檢抗原產(chǎn)生，即抗原含量變化引起的。 1、保證抗體過(guò)量： 抗體結(jié)合抗原的能力達(dá)到相應(yīng)待測(cè)樣本正常血清濃度的50倍以上； 2、對(duì)抗原過(guò)量進(jìn)行閾值限定： 在預(yù)反應(yīng)階段先加入患者1/10的樣本與抗體反應(yīng)，當(dāng)抗原抗體復(fù)合物產(chǎn)生的散射光信號(hào)在預(yù)設(shè)閾值內(nèi)，提示標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度合適，可繼續(xù)進(jìn)行測(cè)定。若超過(guò)預(yù)設(shè)閾值，說(shuō)明抗原過(guò)剩，應(yīng)先稀釋標(biāo)本再測(cè)定。第18頁(yè)，共46頁(yè)。終點(diǎn)散射比濁法方法評(píng)價(jià)可用于自動(dòng)化儀器測(cè)定；檢測(cè)靈敏度可達(dá)g/ml水平，高于透射免疫比濁法；檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的第二階段，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，不適合快速檢測(cè)；第1

8、9頁(yè)，共46頁(yè)。散射免疫比濁法的類型速率散射比濁法（rate nephelometry ）是測(cè)定抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。所謂速率，即單位時(shí)間內(nèi)抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速度，可用該時(shí)間段內(nèi)測(cè)定的散射光強(qiáng)度表示。當(dāng)儀器測(cè)定到某一時(shí)間內(nèi)形成速率下降時(shí)，即出現(xiàn)速率峰，該峰值的高低即代表所測(cè)抗原的量。第20頁(yè)，共46頁(yè)?？乖贵w反應(yīng)與散射光峰值信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化示意圖第21頁(yè)，共46頁(yè)。散射免疫比濁法速率峰值一般在25秒時(shí)出現(xiàn)。 抗原抗體復(fù)合物形成的速率累計(jì)時(shí)間（s）形成IC總量速率累計(jì)時(shí)間（s）形成IC總量速率5 8 10 13 515 251220 603525 1509030 2308035 30

9、0 7040 360 6045 415 5550 450 3555 480 3060 500 20第22頁(yè)，共46頁(yè)。散射免疫比濁法技術(shù)要點(diǎn)峰值出現(xiàn)的時(shí)間與抗體的濃度及其親和力直接相關(guān)，純度高、親和力高的抗體可以縮短反應(yīng)時(shí)間；方法評(píng)價(jià)檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)的第一階段，檢測(cè)時(shí)間短，速度快，靈敏度高，可自動(dòng)化，存在鉤狀效應(yīng)第23頁(yè)，共46頁(yè)。膠乳顆粒增強(qiáng)免疫比濁法改良的免疫比濁檢測(cè)方法；基本原理：在高分子膠乳顆粒的表面交聯(lián)單克隆抗體或抗原，當(dāng)這些顆粒與待測(cè)抗原或抗體相遇后，短時(shí)間內(nèi)會(huì)迅速凝聚，從而改變了反應(yīng)液的透光性能（即吸光度）或散光性能；透射免疫增強(qiáng)比濁和散射免疫增強(qiáng)比濁；第24頁(yè)，共46頁(yè)。膠乳顆

10、粒增強(qiáng)免疫比濁法膠乳(latex)聚合物微粒分散于水中形成的膠體乳液的總稱。1955年Vanderhoff首次合成2 30m的聚苯乙烯（Polystyrene）膠乳微球（microsphere）目前可合成不同分子量、粒徑、形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及帶有不同功能基團(tuán)的各類微球第25頁(yè)，共46頁(yè)。膠乳顆粒增強(qiáng)免疫比濁法技術(shù)要點(diǎn) 1、膠乳顆粒直徑：稍小于入射光的波長(zhǎng)， 200nm/340nm； 2、膠乳顆粒的均一性，影響光散射效果； 3、常用聚苯乙烯乳膠，帶負(fù)電荷；方法評(píng)價(jià) 檢測(cè)速度快，靈敏度高（ng/ml）透射免疫比濁法 ：mg/ml散射免疫比濁法 ：g/ml第26頁(yè)，共46頁(yè)。 膠乳顆粒增強(qiáng)免疫比濁法（a）

11、帶抗體的膠乳直徑在波長(zhǎng)之內(nèi)可透過(guò)光線（b）結(jié)合抗體的膠乳通過(guò)抗原連接后，對(duì)入射光形成光線衰弱第27頁(yè)，共46頁(yè)。第二節(jié) 免疫比濁的技術(shù)要點(diǎn)一、抗體的選擇二、納米微球的致敏三、分析條件的優(yōu)化第28頁(yè)，共46頁(yè)。一、抗體的選擇1、抗體質(zhì)量 特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)，避免“偽濁度”2、抗體類型 R型抗體：特異性和親和力較強(qiáng)，具有較寬的抗原抗體合適比例范圍，與抗原結(jié)合后不易解離； H型抗體：親和力弱，合適比例范圍窄，易解離； 多克隆抗體 or 單克隆抗體第29頁(yè)，共46頁(yè)。二、納米微球的致敏致敏:利用各種功能性微球（聚苯乙烯、磁珠）作為載體，與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）進(jìn)行連接或耦合形成免疫微球復(fù)合

12、物。免疫微球技術(shù)（immunomicrosphere technique）:利用免疫微球進(jìn)行免疫、靶向治療或其他生物學(xué)檢測(cè)的一項(xiàng)技術(shù)。第30頁(yè)，共46頁(yè)。二、納米微球的致敏聚苯乙烯膠乳微球比表面積大、單分散性良好、生物相容性好、易于分離純化具有凝聚作用，在反應(yīng)中起到增強(qiáng)信號(hào)的作用，提高檢測(cè)的靈敏度（ng/ml）第31頁(yè)，共46頁(yè)。二、納米微球的致敏粒徑小的膠乳微球，所需抗體量較多，精密度和線性相對(duì)較好；粒徑大的膠乳微球，所需抗體量較少，精密度和線性相對(duì)較差，但靈敏度較好；第32頁(yè)，共46頁(yè)。二、納米微球的致敏納米微球的制備：物理吸附法共價(jià)偶聯(lián)法親和素-生物素橋聯(lián)法直接結(jié)合法多肽橋連接法第33頁(yè)

13、，共46頁(yè)。二、納米微球的致敏一、物理吸附法表面修飾有磺酸基、羧基、醛基的微球可以直接和蛋白質(zhì)上的疏水基團(tuán)配位結(jié)合，將二者混合反應(yīng)后，再除去未結(jié)合的游離抗體即可獲得膠乳-抗體復(fù)合物。缺點(diǎn)：活性降低、甚至失活二、共價(jià)偶聯(lián)法通過(guò)一定的活化劑將具有不同表面基團(tuán)的微球與抗原/抗體表面的相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)；比物理吸附法穩(wěn)定，能最大程度保持抗原、抗體的三維空間結(jié)構(gòu)并有效保護(hù)抗原抗體的活性位點(diǎn)。第34頁(yè)，共46頁(yè)。三、分析條件的優(yōu)化1、抗原、抗體的比例在抗體水平恒定的條件下，抗原量和比濁檢測(cè)信號(hào)之間的關(guān)系分為三個(gè)區(qū)；抗體過(guò)剩，但必須適量 先確定被測(cè)物的正常值，以高于或低于此正常值的50%作為測(cè)定范圍，抗體在此范圍

14、內(nèi)均應(yīng)保持過(guò)量；第35頁(yè)，共46頁(yè)。自動(dòng)檢測(cè)功能，并能對(duì)含過(guò)量抗原的待測(cè)樣品進(jìn)行自動(dòng)稀釋、重新檢測(cè)。第36頁(yè)，共46頁(yè)。三、分析條件的優(yōu)化2、抗原抗體反應(yīng)的溶液 pH6.5 8.5有利于復(fù)合物形成； 離子強(qiáng)度大，復(fù)合物形成快； 緩沖液種類影響復(fù)合物的形成，常用磷酸鹽緩沖液； 3、增濁劑的作用 常用聚乙二醇（ 3%-4%），消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原、抗體分子靠近并結(jié)合形成大分子復(fù)合物，對(duì)終點(diǎn)法可縮短反應(yīng)時(shí)間，速率法可增加反應(yīng)峰值，濃度過(guò)高會(huì)引起非特異性沉淀，形成偽濁度；4、脂血、內(nèi)源性免疫復(fù)合物、單克隆丙種球蛋白血癥 先離心去脂第37頁(yè)，共46頁(yè)。第三節(jié)、臨床應(yīng)用特種蛋白分析

15、儀雙光徑系統(tǒng)，兼顧透射免疫比濁和散射免疫比濁；結(jié)合膠乳增強(qiáng)技術(shù)和速率散射比濁技術(shù)；第38頁(yè)，共46頁(yè)。雙光徑系統(tǒng)第一光徑(14 5), 速率散射法, 激光光源, 波長(zhǎng)670nm, 90度檢測(cè)角, 主要測(cè)定中小分子; 第二光徑(24 6), 速率透射法, 近紅外光源, 波長(zhǎng) 940nm, 180度檢測(cè)角, 主要測(cè)定大分子。 第39頁(yè)，共46頁(yè)。兩種技術(shù)四種方法1、速率散射比濁法2、速率抑制散射比濁3、近紅外顆粒速率透射法4、近紅外顆粒速率抑制透射法中分子 大分子 小分子 散射法-中小分子透射法大分子第40頁(yè)，共46頁(yè)。速率檢測(cè)法的動(dòng)態(tài)分析在反應(yīng)開始的90秒內(nèi)，每隔5秒鐘就記錄一次，每次記錄中進(jìn)行

16、200次讀數(shù), 合計(jì)共3600次讀數(shù)。檢測(cè)相對(duì)時(shí)間的信號(hào)變動(dòng)，記錄特異的信號(hào)變化，排除因污染顆粒、氣泡及非特異性沉淀物引起的干擾性信號(hào)，提高了準(zhǔn)確度。第41頁(yè)，共46頁(yè)。全程動(dòng)力學(xué)空白對(duì)照設(shè)立獨(dú)立的一個(gè)空白對(duì)照杯，全程跟蹤反應(yīng)過(guò)程, 自動(dòng)減去空白對(duì)照杯中得到的信號(hào)，全面排除本底噪音，特別是在測(cè)定低稀釋度的樣本時(shí)，更能確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性 總反應(yīng)特異性反應(yīng)非特異性反應(yīng)第42頁(yè)，共46頁(yè)?？乖^(guò)量自動(dòng)監(jiān)測(cè)免疫比濁法，只有在抗體過(guò)量的條件下，反應(yīng)散射信號(hào)與抗原量的增加才能呈正比關(guān)系。在反應(yīng)末端進(jìn)行監(jiān)測(cè) 第43頁(yè)，共46頁(yè)。第三節(jié)、臨床應(yīng)用一、血清免疫球蛋白及補(bǔ)體測(cè)定IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、C3、C4二、急性時(shí)相反應(yīng)蛋白測(cè)定急性時(shí)相反應(yīng)蛋白（acute phase reaction protein, APRP）:機(jī)體在發(fā)生炎癥、感染、心肌梗死及腫瘤等情況下，血漿濃度發(fā)生顯著變化的一類蛋白質(zhì)，這一現(xiàn)象稱為急性時(shí)相反應(yīng)（APR）。正性APRP: C3、C4、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、C反應(yīng)蛋白等；負(fù)性APRP: 前白蛋白、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等第44頁(yè)，共46頁(yè)。三、藥物濃度測(cè)定光譜法、高效液相色譜法、免疫法速率抑制免疫比濁法競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)，主要用于測(cè)定半抗原和藥物等小分子物質(zhì)。 1