園藝植物生物技術(shù)：第七章--轉(zhuǎn)基因植物課件

1、第七章 轉(zhuǎn)基因植物目錄轉(zhuǎn)基因技術(shù)現(xiàn)狀及其應(yīng)用植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)載體構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化操作轉(zhuǎn)基因鑒定第一節(jié)植物遺傳轉(zhuǎn)化現(xiàn)狀及其應(yīng)用Nature has a rich source of variation轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展1983年華盛頓大學(xué)成功將卡那霉素抗性基因?qū)霟煵?，同?月美國(guó)威斯康星大學(xué)成功將大豆基因轉(zhuǎn)入向日葵，標(biāo)志著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的誕生。1985年，第一批抗病毒、抗蟲(chóng)害和抗細(xì)菌病的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn)。1986年，美國(guó)環(huán)保署允許世界第一例轉(zhuǎn)基因作物抗除草劑煙草進(jìn)行種植。1994年，轉(zhuǎn)基因延熟保鮮番茄“FlavrSavr”獲得美國(guó)食品藥品管理局的批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)銷(xiāo)售，成為世界上第一個(gè)獲許進(jìn)行銷(xiāo)售的轉(zhuǎn)

2、基因食品。轉(zhuǎn)基因植物重要里程碑1983年首例轉(zhuǎn)基因植物培育成功1986年轉(zhuǎn)基因植物獲準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)1994年轉(zhuǎn)基因番茄在美國(guó)批準(zhǔn)上市1996年GMO面積170萬(wàn)ha2012年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積170.3 million ha2012年全球轉(zhuǎn)基因作物種植按作物分-2012按性狀分幾種作物種植GMO比例全球種GMO國(guó)家分布我國(guó)批準(zhǔn)6個(gè)轉(zhuǎn)基因作物商品化抗病毒甜椒（北京大學(xué)）耐儲(chǔ)存番茄（華中農(nóng)大）抗病毒番茄（北京大學(xué)）轉(zhuǎn)CHS基因矮牽牛（北京大學(xué)）抗蟲(chóng)棉（中國(guó)農(nóng)科院研制）抗蟲(chóng)棉（孟山都公司研制）轉(zhuǎn)基因研究涉及的部分園藝作物番木瓜蘋(píng)果柿荔枝龍眼紅薯草莓梨柑橘桃番茄西瓜葡萄Pepper 花菜大白菜李馬

3、鈴薯Production of transgenic plants resistant to diseasesApplication 1Diseases/viral diseasesLimit productionAffect qualityInfluence growth利用植物病毒外殼蛋白基因、病毒復(fù)制酶的部分基因或反義核糖核酸抑制病毒編碼的加工酶，已獲得30多種抗植物病毒的轉(zhuǎn)基因植物研究成果Transgenic papaya resistant to PRSVFresh papaya productiona in state of Hawaii and in Puna districtY

4、earTotalPuna (x 1,000 lb)(PRSV enters Puna) 199255,80053,010199358,20055,290199456,20055,525199541,90039,215199637,80034,195199735,70027,810(transgenic seeds released) 199835,60026,750199939,40025,610200050,25033,950200152,00040,000The yield and quality of Rainbow was exceptional, amounting annually

5、 to 125,000 L/acre vs. 5,000 L/ acre of non transgenic ones Sweet orange overexpressing PR protein from tomato: resistant to phytophthoraApple fire blightfire blight:1000ha apple were killed by FB in Michigan in 2000.Lytic protein (LP)：Royal Gala, Galaxy 和M26轉(zhuǎn)avian LPs SB-37,T-4 lysozyme：Gala轉(zhuǎn)harpin

6、（來(lái)于Fire blight細(xì)菌）NPR1蛋白：過(guò)量表達(dá)Silencing the DIPM kinase which is related to the occurrence of the disease.Production of transgenic plants resistant to pests and insectsApplication 2Aftermath of farm chemical我國(guó)化學(xué)殺蟲(chóng)劑約占農(nóng)藥總量的70%以上，年產(chǎn)量22萬(wàn)噸左右，30%以上用于防治棉鈴蟲(chóng)。1992年至1996年， 24萬(wàn)余人農(nóng)藥中毒。1992年中毒人數(shù)就高達(dá)7萬(wàn)多人，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)100多億

7、元。 利用蘇云金芽孢桿菌（Bt）殺蟲(chóng)蛋白基因CryI和CryIII，分別獲得抗鱗翅目和鞘翅目害蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物（番茄、馬鈴薯、煙草、楊樹(shù)、水稻和棉花等）在美國(guó)，轉(zhuǎn)Bt基因作物的推廣減少了26.9億美元的殺蟲(chóng)劑的使用1986-1998年轉(zhuǎn)基因作物田間試驗(yàn)中，抗蟲(chóng)作物占29%研究成果Bt-cottonChina：1991年單價(jià)抗蟲(chóng)棉，1993年，開(kāi)展雙價(jià)抗蟲(chóng)棉的創(chuàng)新研究 2005年，國(guó)產(chǎn)抗蟲(chóng)棉已累計(jì)推廣9000多萬(wàn)畝，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益150多億元 ,2006年，種植2000萬(wàn)畝India: Bt cotton covers 8.1 m acres in 2006 每畝可減少化學(xué)農(nóng)藥0.5公斤，每畝增加的

8、收益約為140元 Non-Bt cottonBt cottonSource: CAAS抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花獲大面積推廣Numbers of pesticide applications in Bt and non-Bt cotton in Hebei and Shandong in 1999- reduced by 13 applications In 2000: by 12 applications In 2001: by 14 applications Percentage (%) of poisonings reported as numbers of farmers interviewed

9、in Henan in 2000Cabbage looper粉蚊夜蛾 test Diamondback moth小菜蛾 testProduction of transgenic plants resistant to herbicideApplication 3GMO by traits-2012Transgenic soybean1994年5月美國(guó)Monsanto公司耐除草劑“鎮(zhèn)草寧”大豆Round up Ready（農(nóng)達(dá)安）。 Move to greener herbicide Benefits of Glyphosate 草甘磷Tolerance in Crops Can use at

10、any time - can wait until there is a problem Reduced herbicide use Very effective - Weeds very sensitive - GM crop very resistantGM canola surrounded by weeds- glyphosate+ glyphosateProduction of transgenic plants with altered development progressApplication 4延遲果實(shí)成熟利用反義RNA技術(shù)抑制果實(shí)軟化過(guò)程中的關(guān)鍵酶（聚半乳糖醛酸酶或乙烯前

11、體合成酶），可使番茄果在儲(chǔ)存期的軟化延遲。1993年美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的第一個(gè)轉(zhuǎn)基因食品Calgene公司的轉(zhuǎn)基因延熟番茄Flavr Savr（保味）華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系葉志彪教授獲得轉(zhuǎn)基因番茄百日鮮（Bioscience)華番一號(hào)是我國(guó)第一個(gè)商品化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)照轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果乙烯生成減少的蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果：乙烯生成減少70%需更長(zhǎng)時(shí)間軟化硬度：高于CKSSC：高于CK比CK耐貯藏3個(gè)月后不變褐的蘋(píng)果Production of transgenic plants tolerant to abiotic stressesApplication 5Approximately 70

12、% of the genetic potential yield of major crops is lost by environmental factors. (Boyer, Science, 1982, 218: 443-448)Abiotic stressEnhanced growth in transgenic aspen耐鹽番茄適宜保護(hù)地栽培的或露地早春栽培；抗寒、抗鹽、無(wú)限生長(zhǎng)型單株，果高樁型；每果序4-8果、坐果率高、單果重70-100g，糖度5.0-6.0%，Vc含量為41.4mg/100g鮮重；耐貯藏、利于通風(fēng)透光，適于保護(hù)地栽培，產(chǎn)量可達(dá)50008000kg。 將先進(jìn)的抗

13、旱產(chǎn)品送入溫室進(jìn)行篩選；田間試驗(yàn)中領(lǐng)先的產(chǎn)品表現(xiàn)優(yōu)異；繼續(xù)評(píng)估以評(píng)價(jià)抗旱性方面的表現(xiàn)。CONTROL對(duì)照組WITH GENE 含基因CONTROL對(duì)照組WITH GENE 含基因孟山都與巴斯夫合作45抗旱玉米2008年農(nóng)業(yè)進(jìn)步展覽會(huì)：含抗旱基因 對(duì)照組 轉(zhuǎn)基因抗?jié)儾〉母涕倏姑撍蔫譖roduction of transgenic plants with special value or traitsApplication 6Transgenic flowers with different flower color第一個(gè)轉(zhuǎn)基因園藝植物是淡紫色的康乃馨Moondust：把編碼類(lèi)黃酮羥化酶和二氫

14、類(lèi)黃酮還原酶的基因轉(zhuǎn)到白色康乃馨中，在轉(zhuǎn)基因植物中積累了翠雀素，使康乃馨呈淡紫色，改良作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)植物類(lèi)胡蘿卜素代謝工程Shewmaker et al., Plant J, 1999; Lindgren et al., Plant Physiol, 2003; Paine et al., Nat Biotechnol, 2005; Rosati et al., Plant J, 2000; DAmbrosio et al., Plant Sci, 2004; Fujisawa et al., 2008; Zhu et al., PNAS, 2008; Apel and Bock, Plant

15、Physiol, 2009; Maass et al., Plos One, 2009生產(chǎn)特殊類(lèi)胡蘿卜素植物類(lèi)胡蘿卜素代謝工程Mann et al., Nat Biothechnol. 2000; Morris et al., Metab Eng, 2006; Jayaraj, et al., Transgenic Res, 2007; Suzuki et al., Plant Cell Rep, 2007; Zhu et al., PNAS, 2008; Fujisawa et al., J Exp Bot, 2009Golden rice-Carotene Pathway in Plant

16、sIPP異戊二烯焦磷酸GGPPPhytoeneLycopene -carotene(vitamin A precursor)Phytoene synthasePhytoene desaturaseLycopene-beta-cyclase-carotene desaturase Problem:Rice lacksthese enzymesNormalVitamin A“Deficient”RiceGA-20氧化酶部分正義抑制的蘋(píng)果Reduced concentration of GA1 and GA20 in shoot tips and young leaves. The dwarf ty

17、pe can be reversed by GA3.LFY encodes a plant specific transcription factor and is considered a master regulator of floral meristem development.AP1 is a member of the MADS-box gene family of transcription factors ,which play critical roles in development processes across the plant, animal and fungal

18、 kingdoms.FLOWERING LOCUS T (FT) is one of the flowering-time genes in Arabidopsis genes and is characterized as a floral pathway integrator.Genes involved in floral developmentOverexpression of LEAFY in citrus transgenic plants.(A) Transgenic shoot grafted in vitro on a nontransgenic rootstock show

19、ing a precocious terminal flower five weeks after regeneration. (B) Transgenic plant showing a weeping growth habit. (C) Leaves from transgenic plants showing various degrees of curling (top) compared to leaves from nontransformed control plants (bottom). (D) Vegetative shoot from a transgenic plant

20、 showing the reduction of thorns and small curled leaves (right) compared to a vegetative shoot from a nontransformed control plant of the same age (left). (E) Transgenic plant flowering 16 months after its transfer to the greenhouse. (F) Ripened fruit from a transgenic plant grown in the greenhouse

21、.不引起過(guò)敏的蘋(píng)果Transgenic tomato producing insulin按照植物偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)并合成了人胰島素的A鏈和B鏈的編碼序列，并通過(guò)以某種方式連接成為一個(gè)ORF的人胰島素基因（180bp） ，依據(jù)軟件分析使其產(chǎn)物模擬天然的胰島素結(jié)構(gòu)。該基因受控于番茄果實(shí)專(zhuān)一性啟動(dòng)子，在番茄果實(shí)中高效表達(dá)。通過(guò)生吃番茄的口服途徑可改善胰島素依賴(lài)型糖尿病人自體免疫狀況，達(dá)到治療效果。亦可從番茄果實(shí)中純化出人胰島素，做成注射劑型。第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenic technique） 運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)將人工分離和修飾過(guò)的基因?qū)氲侥康纳矬w的基因組中，并使之整合、表達(dá)和

22、遺傳，從而達(dá)到修飾原有植物遺傳物質(zhì)、改造不良的園藝性狀、改造生物的技術(shù)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的特點(diǎn)：1）突破物種界限，從DNA分子水平上有目的地、有效地改造生物。2）按照人們的意志定向的改變生物的遺傳性狀。3）避免在自然情況下會(huì)限制不相關(guān)品種間DNA交換的障礙4）當(dāng)轉(zhuǎn)入的基因整合到染色體或基因組中后，這些基因會(huì)與寄主生物的遺傳物質(zhì)一起向子代傳遞，并產(chǎn)生應(yīng)有的生物學(xué)功能?；蚬こ?“Genetic engineering includes a range of techniques and methods used by scientists to control or modify genes, swi

23、tch them off or move them between two unrelated species.”一般意義上的基因工程是指“重組DNA技術(shù)”或“基因轉(zhuǎn)移技術(shù)”。基因工程的四要素目的基因載體轉(zhuǎn)化方法受體expressed sequenceregulatory sequencessuitable codon usage for the host or target organismprokaryote v eukaryotepost-transcriptional issuescell line v germ line transformation重組DNA篩選分離外源基因載體重組

24、轉(zhuǎn)化子整合基因工程圖解：轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞植物基因工程 植物基因工程具有以下特點(diǎn)： 1）植物基因工程是在基因水平上改造植物的遺傳物質(zhì)，更具有科學(xué)性和精確性，同時(shí)育種速度也大大加快。 2) 植物基因工程能定向改造植物的遺傳性狀，提高了育種的目的性與可操作性。 3）植物基因工程大大地?cái)U(kuò)展了育種的范圍，打破了物種之間的生殖隔離障礙，實(shí)現(xiàn)了基因在生物界的共用性，豐富了基因資源及植物品種。 植物轉(zhuǎn)基因過(guò)程A.從生物有機(jī)體的基因組中，分離出帶目的基因的DNA片段。B.將帶目的基因的外源DNA片段，連接到能自我復(fù)制的載體分子上，形成重組DNA分子。C.將重組DNA分子轉(zhuǎn)到適當(dāng)?shù)闹参锸荏w細(xì)胞內(nèi)。D.篩選獲得了

25、重組DNA的受體細(xì)胞，進(jìn)行繁殖。E.基因的表達(dá)，產(chǎn)生人類(lèi)所需要的物質(zhì)。Plant Genetic Engineering ProcessCellExtracted DNACell divisionTransgenic plantA single geneTransformationPlant cell 植物基因工程的目的基因抗植物蟲(chóng)害基因（如bt基因）抗植物病毒基因（如cp基因）抗植物真菌病害基因（如幾丁質(zhì)酶基因）抗植物細(xì)菌病害基因（如溶菌酶基因）抗非生物脅迫基因（如耐除草劑基因）提高作物產(chǎn)量改良作物品質(zhì)的基因（如種子貯藏蛋白基因）改良植物其他性狀和雄性不育基因（如rol基因、barnase基

26、因）植物醫(yī)藥基因工程轉(zhuǎn)化系統(tǒng)名稱(chēng)載 體轉(zhuǎn)化原理轉(zhuǎn)化方法受體細(xì)胞植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)種質(zhì)細(xì)胞莖尖細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)化法細(xì) 胞生殖細(xì)胞花粉粒卵細(xì)胞花粉管通道法浸 泡 法化學(xué)原理物理原理病毒農(nóng)桿菌PEG法脂質(zhì)體法激光法超聲波法電泳法電激法微注射法基因槍法葉盤(pán)法原生質(zhì)體共培養(yǎng)法共感染法DNARNARi質(zhì)粒Ti質(zhì)粒各種受體原生質(zhì)體植物遺傳轉(zhuǎn)化受體類(lèi)型及特性受體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化率嵌合性操作重復(fù)性愈傷組織基因槍農(nóng)桿菌高較多簡(jiǎn)單組織、器官農(nóng)桿菌較低有簡(jiǎn)單原生質(zhì)體PEG/電擊高無(wú)復(fù)雜生殖細(xì)胞花粉管通道低無(wú)簡(jiǎn)單懸浮細(xì)胞農(nóng)桿菌/電擊較高時(shí)有較復(fù)雜（1）高效穩(wěn)定的再生能力（2）較高的遺傳穩(wěn)定性（3

27、）具有穩(wěn)定的外植體來(lái)源（4）對(duì)選擇性抗生素敏感（5）對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性外植體的選擇（植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)具備條件） 愈傷組織是在受傷的外植體表面產(chǎn)生的脫分化的無(wú)序的分生組織。胚性愈傷組織則是經(jīng)由一定的組織（花藥、子葉、未發(fā)育的胚珠、下胚軸等）在合適的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化而來(lái)，常用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，如香蕉、柑橘、葡萄、水稻、小麥、棉花等。愈傷組織受體系統(tǒng)特點(diǎn):外植體試材廣泛；擴(kuò)繁量大,可獲得較多的轉(zhuǎn)化植株；通過(guò)體胚發(fā)生再生植株，嵌合體少；易于接受外源基因,轉(zhuǎn)化率高；轉(zhuǎn)化的外源基因遺傳穩(wěn)定性差；Fig. af Transformation of embryogenic calli o

28、f cotton and subsequent regeneration. a Embryogenic cotton calli used for transformation. b Enlarged view of embryogenic calli used for transformation. c Co-cultivated cotton calli on selection medium after 6 weeks showing a large number of globular embryo clusters. d Enlarged view of one of the glo

29、bular embryo clusters from c. e Kanamycin (Km)-resistant transformed cotyledonary embryos on embryo maturation medium. f Km-resistant plants in soil pots in the greenhousePlant Cell Rep (2004) 22:465470愈傷組織的分化 直接分化再生系統(tǒng)是指外植體細(xì)胞不經(jīng)過(guò)脫分化產(chǎn)生愈傷組織階段而直接分化出不定芽獲得再生植株。 用葉片、幼莖、子葉、胚軸等為外植體,直接分化的研究已取得許多成功的實(shí)例。直接分化再生系統(tǒng)

30、特點(diǎn):操作簡(jiǎn)單,周期短;轉(zhuǎn)化的外源基因能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的遺傳;更適于無(wú)性繁殖的園藝植物，如果樹(shù)、花卉及 一些木本植物;轉(zhuǎn)化率低于愈傷組織再生系統(tǒng);嵌合體較多。D. GUS-negative citrange shoot regenerating from a GUS-positive callus.C. GFP-positive and negative shoots regenerating close from the same explants. Molecular Breeding 14: 171183, 2004.4C, Non-transformed explants regenerat

31、ed with buds and shoots formed at both ends. Annals of Botany 84: 715723, 1999外植體的分化 原生質(zhì)體是“裸露”的植物細(xì)胞,它同樣具有全能性,能在適當(dāng)?shù)臈l件下誘導(dǎo)出再生植株。 從70年代初首次從煙草原生質(zhì)體成功的培養(yǎng)出再生植株以來(lái),至今已有250多種高等植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得成功,其中包括一些重要的禾谷類(lèi)糧食作物如水稻、小麥、玉米；果樹(shù)類(lèi)作物如柑橘、蘋(píng)果等。原生質(zhì)體再生系統(tǒng)特點(diǎn):原生質(zhì)體被除去了細(xì)胞壁，可直接高效的攝取外源DNA或遺傳物質(zhì),甚至細(xì)胞核；嵌合體更少；易于在相對(duì)穩(wěn)定和均勻的同等控制條件下進(jìn)行準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)化和鑒定

32、；適用于各種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；遺傳穩(wěn)定性更差；周期長(zhǎng)、難度大、再生頻率低。(A) Mesophyll protoplasts isolated from GFP transgenic Valencia plant; (B) hybrid colony expressing GFP after 4 weeks culture; (C) hybrid embryoid expressing GFP after 5 weeks culture; (D) hybrid embryoid expressing GFP after 6 weeks culture. Guo WW & Grosser JW. Pla

33、nt Science 168 (2005) 15411545原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 胚狀體再生系統(tǒng) 植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指二倍體或單倍體細(xì)胞在未經(jīng)融合的情況下,模擬有性合子胚胎發(fā)生的各個(gè)階段而發(fā)育形成一個(gè)新的個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程。 經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生而形成的在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上類(lèi)似于有性胚的結(jié)構(gòu)被稱(chēng)之為體細(xì)胞胚或胚狀體。特點(diǎn):轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率都很高；嵌合體少；胚狀體具有兩極性,可同時(shí)分化出芽和根；利用轉(zhuǎn)基因的胚狀體可生產(chǎn)人工種子；體細(xì)胞胚具有個(gè)體間遺傳背景一致、無(wú)性系變異、小胚的結(jié)構(gòu)完整、成苗快、數(shù)量大等優(yōu)點(diǎn),有利于轉(zhuǎn)基因植株的生產(chǎn)和推廣。 Transgenic peach plants (Prunus pe

34、rsica L.) produced by genetic transformation of embryo sections using the green fluorescent protein(GFP) as an in vivo marker. a. Regenerating buds from calli formed on an embryo section after 4 weeks in culture. b. In vitro rooted shoots. Molecular Breeding 14: 419427, 2004.胚狀體 利用植物自身的生殖過(guò)程，以生殖細(xì)胞如花粉

35、粒卵細(xì)胞為受體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)稱(chēng)之為生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)，也叫種質(zhì)系統(tǒng)。 小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng) 胚性細(xì)胞或愈傷組織細(xì)胞 單倍體植株 直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)采用2-3mm厚的組織薄層（莖段）進(jìn)行培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)芽的分化，獲得再生植株。在柑橘上已應(yīng)用于成年態(tài)培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化及植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系研究領(lǐng)域。薄層細(xì)胞受體系統(tǒng)特點(diǎn)：試驗(yàn)所需要的材料少；外植體的生長(zhǎng)與培養(yǎng)基的組成關(guān)系密切；通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組成，可以從薄層切片上直接誘導(dǎo)芽，勿需經(jīng)過(guò)愈傷階段，遺傳變異相對(duì)較少；周期短，繁殖系數(shù)大。柑橘薄細(xì)胞層培養(yǎng)圖片引自L(fǎng)e Bui Van等由Tran Thanh Van

36、于1973年提出（Nature 246 (1973) 44-45）根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化基本程序（1） Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建（2）受體系統(tǒng)的建立（3）目的基因的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子再生Agrobacterium tumefaciensTi plasmidAgrobacteriumGenomic DNAPlant cellGenomic DNA (carries the gene of interest)+Ti plasmid with the gene of interestGene of interestEmpty plasmidRestriction enzyme ARestriction en

37、zyme AAgrobacteriumTi plasmid with the new genePlant cellcells DNATransgenic plantCell divisionThe new gene+TransformationAgrobacterium tumefaciens 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的生物學(xué)特性 農(nóng)桿菌屬細(xì)菌為格蘭氏陰性的土壤桿菌，植物遺傳工程載體主要為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogennesis)，分別通過(guò)其本身的Ti或Ri質(zhì)粒完成攜帶基因從農(nóng)桿菌到受體的轉(zhuǎn)移。The

38、 Galls Can Be Huge根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的遺傳特性 Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，約有200kb組成。 Ti質(zhì)粒根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類(lèi)不同可分為：冠癭堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農(nóng)桿堿型(agropine)、農(nóng)桿菌素堿型(agrocinopine)或稱(chēng)琥珀堿型(succinamopine)。Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)區(qū)域（1）T-DNA區(qū)：又稱(chēng)轉(zhuǎn)移DNA，是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA。（2）Vir區(qū)：該區(qū)段的基因能激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱(chēng)之為

39、毒區(qū)。（3）Con區(qū)：該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因(tra),調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移，以此稱(chēng)之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)：該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱(chēng)之為復(fù)制起始區(qū)。 Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖冠廮堿合成基因(tmt)生長(zhǎng)素基因(tms)左邊界細(xì)胞分裂素基因（tmr）右邊界冠廮堿代謝基因Vir基因復(fù)制起始位點(diǎn)(ori) T-DNA區(qū)域 T-DNA整合機(jī)理 整合機(jī)理：T-DNA的邊界序列對(duì)于信號(hào)分子的識(shí)別和T-DNA的轉(zhuǎn)移是必需的，左右邊界25 bp的重復(fù)序列被位點(diǎn)特異性的VirD蛋白所識(shí)別，該蛋白具有核酸內(nèi)切酶活性，酶切并釋放T-DNA單鏈，實(shí)現(xiàn)DNA的轉(zhuǎn)移。 毒性

40、區(qū)基因：Vir區(qū)基因，其作用是誘導(dǎo)T-DNA構(gòu)型的改變、轉(zhuǎn)移、定位插入到核基因組中。 （1）農(nóng)桿菌對(duì)受體的識(shí)別； （2）農(nóng)桿菌附著到植物受體細(xì)胞； （3）誘導(dǎo)啟動(dòng)毒性區(qū)基因表達(dá)； （4）類(lèi)似接合孔復(fù)合體的合成和裝配； （5）T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)； （6）T-DNA的整合。 農(nóng)桿菌Ti的T-DNA導(dǎo)入植物基因組整個(gè)過(guò)程包括：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的程序外植體的預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌菌體的活化侵染共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子的篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植株的再生轉(zhuǎn)化子的鑒定外植體預(yù)培養(yǎng)菌液制備侵染共培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分子鑒定田間試驗(yàn)遺傳分析性狀鑒定整合整合 外植體的預(yù)培養(yǎng)：一般以2-3天為宜。預(yù)培養(yǎng)有利于細(xì)胞分裂，從而提高外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化率

41、；馴化作用；減少雜菌污染率；利于外植體與培養(yǎng)基的平整接觸。 外植體的農(nóng)桿菌接種：菌液濃度一般為OD600=0.5-0.7之間；浸泡后的外植體要在無(wú)菌濾紙上吸干，以除去過(guò)量的菌體。 農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)：在固體培養(yǎng)基表面加一層濾紙，有利于控制外植體上農(nóng)桿菌過(guò)度增殖。共培養(yǎng)時(shí)間必須長(zhǎng)于16h，一般為2-3天。在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入As(乙酰丁香酮，細(xì)胞創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子)或采用tomato feeder plates均可提高轉(zhuǎn)化率。 外植體脫菌及選擇培養(yǎng)：常用的脫菌抗生素有羧芐青霉素（carbenicillin）、頭孢霉素（cefotaxine）及羧噻吩青霉素（timentin）。常用的選擇抗生素如Km、

42、HPT、bar等。轉(zhuǎn)化植株的再生轉(zhuǎn)化株的分子鑒定（PCR、Southern blot、Northern blot、Western blot、實(shí)時(shí)定量PCR）轉(zhuǎn)化株的形態(tài)、性狀觀察（株形、分枝、開(kāi)花結(jié)果習(xí)性等）轉(zhuǎn)化株后代遺傳分析根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法整體植株接種共感染法葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：成功率高，效果好；轉(zhuǎn)移的外源基因常為單拷貝整合，很少會(huì)發(fā)生甲基化和轉(zhuǎn)基因沉默，遺傳穩(wěn)定，而且多數(shù)符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律；費(fèi)用低，方法簡(jiǎn)單易操作；寄主范圍廣，幾乎所有的雙子葉植物都可采用此法，尤其近年來(lái)在一些單子葉植物上也取得成功（已有7個(gè)科的20多種單子葉植物轉(zhuǎn)化獲得成

43、功）。 不足之處： 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化主要應(yīng)用于雙子葉植物，還有少數(shù)的單子葉植物；而大多數(shù)單子葉植物，尤其是禾本科作物對(duì)農(nóng)桿菌不敏感，限制了它的應(yīng)用；另外，農(nóng)桿菌侵染后的外植體再生階段脫菌比較困難，需要長(zhǎng)期使用抗生素，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)煩惱。 PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化是Davey等（1980）和Krens等（1985）首先建立。 PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鳥(niǎo)氨酸（pLO)、磷酸鈣及高PH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子。PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法步驟（1）Ti質(zhì)粒DNA提?。?）原生質(zhì)體分離（3）轉(zhuǎn)化培養(yǎng)（4）轉(zhuǎn)化培養(yǎng)同時(shí)加入運(yùn)載DNA（即鮭魚(yú)精DNA或小牛胸腺DNA）（

44、5）離心收集原生質(zhì)體或用鈣離子溶液使PEG逐步稀釋?zhuān)?）將原生質(zhì)體培養(yǎng)于選擇培養(yǎng)基上或不加選擇壓力按一般方法培養(yǎng)（7）當(dāng)細(xì)胞團(tuán)長(zhǎng)到一定大小時(shí)將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至含選擇壓力的培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞PEG法的特點(diǎn)避免嵌合轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)生；對(duì)細(xì)胞傷害少，而且轉(zhuǎn)化順利；其轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體易于選擇轉(zhuǎn)化體；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化是理論研究的極好的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)；受體植物不受種類(lèi)的限制。 PEG法不足之處建立原生質(zhì)體再生系統(tǒng)十分困難，從而阻礙了PEG法的應(yīng)用；轉(zhuǎn)化率低；從原生質(zhì)體再生的無(wú)性系植株變異較大，因此通過(guò)PEG法轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)基因植株將產(chǎn)生更多的無(wú)性系變異。 電擊法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 電擊法是利用高壓電脈沖作用在原生質(zhì)體膜上“電擊穿孔”（

45、electroporation),形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的攝取。 此法在動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用較早并取得很好效果，李寶健等于1985年首次將其應(yīng)用于植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化。 電擊法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化步驟（1）分離原生質(zhì)體加入電擊緩沖液重懸，并離心3分鐘去掉上清液，再加入適量的電擊緩沖液，計(jì)數(shù)，將原生質(zhì)體密度調(diào)節(jié)到1106 2106個(gè)/ml（2）加入10g/ml質(zhì)粒DNA和50g/ml鮭魚(yú)精子DNA，混合后分裝于電擊反應(yīng)槽內(nèi)（3）冰浴5min（4）選擇不同參數(shù)電擊（5）600r/min離心3min除去電擊緩沖液，用液體培養(yǎng)基洗滌（6）將原生質(zhì)體包埋于固體培養(yǎng)基中，28黑暗條件下選擇培養(yǎng) 電擊法特點(diǎn)

46、 電擊法除了同樣具有PEG原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)外，還具有操作簡(jiǎn)便，DNA轉(zhuǎn)化效率較高，特別適于瞬時(shí)表達(dá)的研究。缺點(diǎn)是造成原生質(zhì)體的損傷，使植板率降低，且儀器也較昂貴。 基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 基因槍法（particle gun)又稱(chēng)微彈轟擊法（microprojectile or biolistic bombardment)。最早是由美國(guó)康奈爾（Cornell)大學(xué)的Sanford等（1987）研制出火藥引爆的基因槍。 其基本原理是將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細(xì)胞或組織。微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上，得以表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化。B

47、iolistics Gun “Gene Gun” TechniqueDNA coated golden particlesGene gunCell divisionA plant cell withthe new geneTransgenic plantPlant cellCells DNA基因槍法的特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：無(wú)宿主限制靶受體類(lèi)型廣泛可控度高操作簡(jiǎn)便快速，甚至可以克服無(wú)菌的困難缺點(diǎn)及存在問(wèn)題：基因槍的硬件設(shè)計(jì)尚待改善微彈的表面結(jié)構(gòu)、大小、均一性及承載DNA的量及DNA微粒載體的制備技術(shù)等特定物種、特定組織、細(xì)胞的轟擊條件如何誘導(dǎo)更多的細(xì)胞同時(shí)成為轉(zhuǎn)化和再生感受態(tài)是一個(gè)非常重要的問(wèn)題轟擊后進(jìn)入

48、受體細(xì)胞的DNA生物學(xué)變化及調(diào)控等理論問(wèn)題 花粉管通道法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 是由周光宇等（1983）年建立發(fā)展起來(lái)的 原理：借助植物自身的生殖細(xì)胞（卵細(xì)胞或受精卵）為轉(zhuǎn)化對(duì)象的直接轉(zhuǎn)化技術(shù)，外源基因或DNA可以通過(guò)花粉管通道進(jìn)入受精胚囊，因而稱(chēng)為花粉管通道法（途徑）。 使用范圍：開(kāi)花植物 優(yōu)點(diǎn)： 利用整體植株的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA，無(wú)需人工培養(yǎng)過(guò)程；方法簡(jiǎn)便，一般常規(guī)育種者易于掌握，成本低，適于普及和使用；單子葉、雙子葉植物均可使用，育種時(shí)間短。 缺點(diǎn)： 這一技術(shù)局限于開(kāi)花時(shí)間才能應(yīng)用；必須有遺傳育種和分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)方面的基礎(chǔ)知識(shí)，才能恰當(dāng)?shù)倪M(jìn)行DNA供受體的組合和判斷DNA

49、導(dǎo)入的結(jié)果，達(dá)到分子育種的目的；應(yīng)用總DNA片段的導(dǎo)入，篩選到的子代可能帶有目的性狀基因以外的DNA片段。常用基因轉(zhuǎn)化方法特點(diǎn)比較轉(zhuǎn)化方法農(nóng)桿菌法PEG法電擊法微針注射法基因槍法受體材料完整細(xì)胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體完整細(xì)胞宿主范圍 有無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)組培條件簡(jiǎn)單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡(jiǎn)單嵌合體比例有無(wú)無(wú)無(wú)多操作復(fù)雜性簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜設(shè)備要求便宜便宜昂貴昂貴昂貴工作效率高低低低高單子葉植物應(yīng)用少可行可行可行廣泛農(nóng)桿菌的活化挑單克隆測(cè)OD600收集細(xì)胞用液體MS培養(yǎng)基重懸細(xì)胞將預(yù)培養(yǎng)的外植體放入菌液中共培養(yǎng)100rpm,30min取出外植體在無(wú)菌濾紙上吸干菌液共培養(yǎng)在含有選擇壓力的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)細(xì)胞分化，形成

50、轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)芽生長(zhǎng)生根，形成轉(zhuǎn)化植株P(guān)lant Tissue CultureA Requirement for Transgenic DevelopmentA plant part Is culturedCallusgrowsShootsdevelopShoots are rooted;plant grows to maturity第五節(jié)轉(zhuǎn)基因鑒定轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)鑒定外源基因是否進(jìn)入植物細(xì)胞？進(jìn)入植物細(xì)胞的外源基因是否整合到植物染色體上？整合的方式如何？整合到染色體上的外源基因是否表達(dá)？轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)鑒定方法報(bào)告基因/標(biāo)記基因的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的PCR檢測(cè)外源基因整合的Southern雜交鑒定外

51、源基因轉(zhuǎn)錄的Northern雜交檢測(cè)外源基因表達(dá)蛋白的檢測(cè)生物學(xué)鑒定報(bào)告基因的檢測(cè)報(bào)告基因是明顯區(qū)別于受體細(xì)胞遺傳背景的選擇標(biāo)記，又稱(chēng)選擇標(biāo)記基因。常用的報(bào)告基因NPT-II 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 抗氨基環(huán)醇類(lèi)抗生素CAT 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 抗氯霉素HPT 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 抗潮霉素GUS -葡萄糖苷酸酶基因 產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)GFP 綠色熒光蛋白基因 產(chǎn)生綠色熒光LUC 熒光酶素基因 發(fā)射光子NPT- 活性檢測(cè)目的 ：檢測(cè)Npt-基因在植物組織中的表達(dá)原理： NPT-使ATP分子上的-P轉(zhuǎn)移到抗生素分子上，影響抗生素與核糖體的結(jié)合，從而使抗生素失活。檢測(cè)時(shí)使用放射性標(biāo)記的-32P ATP，

52、通過(guò)-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移，生成放射性的卡那霉素來(lái)檢測(cè)。檢測(cè)方法：點(diǎn)漬法，層析法，凝膠原位檢測(cè)法NPT- 提取物 + -32P ATP 32P磷酸化的卡那霉素放射自顯影cat基因活性檢測(cè)原理： 氯霉素能與原核細(xì)胞50S亞基或真核細(xì)胞線(xiàn)粒體核糖體大亞基結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)生物合成。cat基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶催化?；梢阴oA轉(zhuǎn)向氯霉素，可生成1-乙酰氯霉素、3-乙酰氯霉素、1,3-二乙酰氯霉素三種乙?；a(chǎn)物。乙酰化了的氯霉素不再具有氯霉素活性，失去了干擾蛋白質(zhì)合成的作用。cat基因活性可以通過(guò)反應(yīng)底物乙酰CoA的減少或反應(yīng)產(chǎn)物乙?；让顾氐纳蓙?lái)測(cè)定，常用的方法有硅膠G薄層層析法及DTNB分光光

53、度法。gus基因的檢測(cè)gus基因編碼 -葡萄糖苷酸酶基因，該酶是一種水解酶，能催化許多-葡萄糖苷酯類(lèi)物質(zhì)的水解。檢測(cè)常用底物有3種： 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc） 4-甲基傘形酮酰- -D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG） 對(duì)硝基苯-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）檢測(cè)方法：組織化學(xué)染色定位法X-Gluc 熒光法測(cè)定GUS活性4-MUG 分光光度法測(cè)定GUS活性PNPG組織化學(xué)染色定位法檢測(cè)GUS以X-gluc為底物，在適宜條件下該酶將底物水解成藍(lán)色物質(zhì)，GUSGUS used for promoter analysisgfp基因的檢測(cè)綠色熒光蛋白是一些腔腸動(dòng)物所特有的生

54、物熒光素蛋白。生物熒光素蛋白是指存在于生物體內(nèi)，能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光的蛋白質(zhì)。它可與目的基因構(gòu)成嵌合基因，從報(bào)告基因的表達(dá)了解目的基因表達(dá)情況。檢測(cè)方法：對(duì)于轉(zhuǎn)化細(xì)胞可用藍(lán)光照射，在顯微鏡下分揀發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的細(xì)胞。對(duì)于轉(zhuǎn)化植株，可在激發(fā)光照射下利用解剖照相系統(tǒng)進(jìn)行綠色熒光蛋白檢測(cè)和定位。GFP used forsubcellular localization OSPK1蛋白的亞細(xì)胞定位 制備水稻原生質(zhì)將pUC-OSPK1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中。同時(shí)也將質(zhì)粒pUC-GFP轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中作為對(duì)照 培養(yǎng)原生質(zhì)體 用共聚焦熒光顯微鏡觀察，并照相 不含有OSPK1基因的原生體pUC-GFP

55、 含有OSPK1基因的原生體pUC-OSPK1-GFP 轉(zhuǎn)化對(duì)照質(zhì)粒的原生質(zhì)體整個(gè)細(xì)胞有綠色熒光，而轉(zhuǎn)化含有OSPK1基因質(zhì)粒的原生質(zhì)體的綠色熒光則主要在細(xì)胞的質(zhì)膜上 GFP在水稻原生質(zhì)體中的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果 35S OSPK1 GFP NOS野生型GFP發(fā)射的熒光強(qiáng)度較弱，因此利用突變來(lái)尋找強(qiáng)熒光型GFP基因。GFP肽鏈中組成發(fā)色團(tuán)的氨基酸殘基發(fā)生突變會(huì)引起熒光強(qiáng)度的改變。GFPS65T：Ser65變?yōu)門(mén)hr，在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中熒光活性比野生型強(qiáng)18倍。螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的檢測(cè)熒光素酶可以催化生物體自身發(fā)光，現(xiàn)在研究較多的是熒火蟲(chóng)熒光素酶及細(xì)菌產(chǎn)生的熒光素酶。螢火蟲(chóng)熒光素酶催化的底物是6-羥基喹啉類(lèi)，脫羧后生成激活態(tài)的氧化螢光素；細(xì)菌螢光素酶以脂肪醛為底物，氧化成為脂肪酸。檢測(cè)方法：取被檢材料置小容器內(nèi)，加入適量的組織培養(yǎng)液體培養(yǎng)基、ATP、螢光素，置暗室中放置，用肉眼觀察熒光?；蛏w以X-光片，觀察曝光情況，產(chǎn)生曝光點(diǎn)的樣品是轉(zhuǎn)基因成功的。螢光素酶基因是一個(gè)靈敏的報(bào)告基因,檢測(cè)的靈敏度比CAT高100倍,而且沒(méi)有背景，螢光素酶基因的最大特點(diǎn)是不損害植物,即在整體植物或離體器官內(nèi),基因產(chǎn)物都可測(cè)定，但螢光素酶基因產(chǎn)物易在過(guò)氧化物酶體中積累,在植物體內(nèi)產(chǎn)生光的部位不一定能反映螢光素酶基因的特定表達(dá)部位。Activity 轉(zhuǎn)基因植物的PCR檢測(cè)PCR是在體外快速特異地?cái)U(kuò)增目的