第四章污染物生物效應(yīng)檢測課件

1、第四章污染物生物效應(yīng)檢測 第一節(jié)生物測試及方式 一、生物測試 生物測試（Bioassay）指利用生物反應(yīng)測定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨或聯(lián)合存在時，所導(dǎo)致的影響或危害。實際上就是用生物去測定污染物的危害。 可在分子、細胞、組織、器官、甚至個體和種群多種水平上進行。2污染物毒性生物測試優(yōu)點： 1)生物測試不需特殊儀器、方法簡單。 2)可提供污染物的生物毒性，而常規(guī)的物理和化學(xué)檢測只能測定污染物的濃度。 3）可測定污染物之間的相互作用,以及它們對生物體的綜合效應(yīng),而常規(guī)的物理和化學(xué)檢測則做不到。4）還可了解環(huán)境因素對污染物毒性的影響。如水體pH、溶氧量、氧化還原電位、水體中有機和元機配位體對污

2、染物毒性的影響等。 3生物測試意義： 1）研究多種污染物聯(lián)合作用的生物效應(yīng)。 2）監(jiān)測環(huán)境質(zhì)量的變化。 3）制訂環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準。 4）對制訂排污標(biāo)準，以及對污染物生態(tài)風(fēng)險評價有重要意義。4 但注意： （1）污染物結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、毒作用機理不同，同一種生物對不同污染物的反應(yīng)不同。 （2）不同生物解毒機制、及能力不同，因而不同生物對相同污染物有不同的反應(yīng)。（3）不同發(fā)育階段的生物對同種污染物的反應(yīng)也不同。 （4）受污染毒害的經(jīng)驗也會影響生物對有毒污染物的反應(yīng)。 5（一）生物測試方式 根據(jù)不同的研究要求和目的，可進行不同的測試。 測試方法多樣， 有按時間分的、有按試驗溶液和氣體給予方式分的。1、短期生物測

3、試（Short term bioassays） 指被測試的生物在短時間內(nèi)暴露于高濃度的污染物下，測定污染物對生物有機體的影響。 例：急性毒性試驗，以快速估價污染物的毒性。6 1) 測試目的： （1）快速估計污染物的毒性；（2）評價幾種毒物的相對毒性；（3）評價不同生物對不同條件如溫度、pH的相對敏感性等。 主要用于測定半致死濃度(LC50)、或半抑制濃度(IC50) 或半效應(yīng)濃度(EC50)。 2) 時間設(shè)定 ： 一般小于1周，如 一般水蚤類 2d，藻類 3d，魚類 4d。73) 測試特點 （1） 暴露時間短；僅幾天。（2）污染物濃度高； （3）一般采用靜止式給予有毒溶液或氣體。 但對于下列情

4、況，應(yīng)用流動式給藥： 1）不穩(wěn)定且易揮發(fā)的污染物（濃度會漸低)； 2）BOD較高的污水(低O2)； 3）代謝速率快的受試生物（產(chǎn)生高的代謝產(chǎn)物如CO2和NH3會影響受試生物的代謝。 8 2、長期生物測試（Long term bioassays） 在低濃度下，受試生物長期被暴露于污染物下的測試，又稱全部生活史生物測試，常見有慢性毒性試驗。 1）測定目的 測定在長期污染下，不造成有害效應(yīng)的毒物最大濃度，或最大允許毒物濃度（MATC）。 測定包括毒物對生物生長、生殖、產(chǎn)卵、孵卵、幼體成活等的影響。92）時間確定 （1）對動物而言，需要從一個卵期到下一個卵期或更長的連續(xù)測定； （2）對于更小的生物如浮

5、游生物，要持續(xù)好幾代測試； （3）但對生活史特別長的動物，人們則選擇在整個生活史中最敏感的幾個階段測試。如在魚的發(fā)育早期測定，這種測定又稱部分生活史生物測試。103) 長期生物測試要求 (1)只能采用流動式染毒性。 (2)室內(nèi)試驗條件，如水溫、pH、硬度等必需和自然季節(jié)變化相符。 (3)受試 生物的生長、發(fā)育規(guī)律符合季節(jié)變化。 113、中期生物測試（Intermediate term bioassays） （1 ）目的: 介于短期和長期之間的一類生物測試。如亞慢性毒性試驗。 對毒物的毒作用、靶器官和最大無作用劑量或中毒閾值作出估計。 （2）測試時間：8天之內(nèi)算是短期，8-90天之間中期。 （3

6、）毒物給予方式：無論毒物是溶液還是氣體，給予方式一般采用流動式，少數(shù)可采用靜止式。12（二）受試生物的選擇 1）對毒物敏感性： SO2的敏感植物：紫苜蓿、大麥、棉花、小麥、 三 葉草、 甜菜、萵苣、大豆、向日葵。O3敏感植物：煙草、番茄、矮牽牛、菠菜、土豆、燕麥、丁香、秋海棠、女貞、梓樹。 2）具生態(tài)學(xué)價值或經(jīng)濟價值。3）實驗室內(nèi)易培養(yǎng)和繁殖。4）具清楚的生物學(xué)背景資料如生活史、生長、發(fā)育特點等；5）足夠的數(shù)量。6）對毒物的反應(yīng)的易測性。 此外，個體大小、生活史長短，以及以前受污染情況也需考慮。13二、生物測試標(biāo)準化（一）影響生物測試的因素 1、受試生物：受試生物的種類、生長年齡（生活階段、尺

7、寸大小、脫皮階段）、發(fā)育階段、食物供應(yīng)程度等均影響生物對毒物的敏感性。 2、試驗條件：如試驗水質(zhì)的溫度和含鹽量、水流速度和溶解氧、水域的酸堿度、受試生物的總量，不僅影響生物對毒物的反應(yīng)，而且影響作用于生物的毒物濃度、性質(zhì)和形態(tài)。 3、實驗操作：實驗結(jié)果還受人員操作水平、儀器設(shè)備的精度、測定方法的影響。14（二）標(biāo)準化測試的優(yōu)點 1）增加數(shù)據(jù)的精確度，利于數(shù)據(jù)的比較。 2）測試可以被其它實驗室重復(fù)。 3）篩選不同實驗室一致的實驗結(jié)果。 4）可為環(huán)境標(biāo)準的建立提供可靠的數(shù)據(jù)，如飲用水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準等。15（三）標(biāo)準化的生物測試方法 有水質(zhì)物質(zhì)對蚤類急性毒性測定方法B/T13266-91)、水質(zhì)物質(zhì)對

8、淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法(GB/T13267-91)等。 主要對1）毒物的分析方法、環(huán)境條件的測定方法，2）儀器設(shè)備, 3）生物大小、生物量，4）水的溶解氧和pH, 5）統(tǒng)計方法作出了國家規(guī)定。 但對那些易分解、非常見和混合污染物的測定還很難進行標(biāo)準化測定。16 第二節(jié) 生物毒性試驗一、生物毒性（一）生物毒性的基本概念 1、毒物（Toxicant）和毒性 （1）毒物：在一定條件下，以較小劑量給予有機體時，與生物相互作用后而引起功能或器質(zhì)性損傷的化學(xué)物質(zhì)稱毒物。 或劑量雖微，但積累到一定量時，就能干擾或破壞機體的正常生理功能，而引起暫時或持久性病變，甚至危及生命的化合物，稱毒物。17 （

9、2）毒性(Toxicity): 指毒物產(chǎn)生有害作用的能力。 與下列因素有關(guān)： 1）進入機體的劑量。體內(nèi)潛在性有毒物質(zhì)存在并不意味發(fā)生中毒，通常只有達中毒劑量時，才可引起中毒。 2）進入機體的方式（如經(jīng)口、皮膚或呼吸）。 3）接觸時間及頻率。時間越長、頻率越高，越引起中毒。 18 2、中毒（toxication） 受到毒物作用，引起生物有機體功能和器質(zhì)性損傷后，所出現(xiàn)的疾病狀態(tài)稱中毒。 如有機磷中毒后出現(xiàn)的震顫、出汗、瞳孔縮小等。 中毒是在各種毒物作用下，在局部或全身的綜合表現(xiàn)。 （1）毒效應(yīng)或毒性作用 化學(xué)物引起生物有機體的損傷的總稱為毒性作用或毒效應(yīng)?？捎孟嚓P(guān)生理生化指標(biāo)表示。如有機磷農(nóng)藥對

10、膽堿酯酶活性的抑制；苯抑制造血功能而引起貧血。19 （2）毒物反應(yīng)（reaction） 指接觸化學(xué)物質(zhì)后，表現(xiàn)某種效應(yīng)的個體在一個群體中所占的比例。 （3）毒物危險性和危害性 1）毒物危險性 指某一化學(xué)物質(zhì)在正常生產(chǎn)、使用過程中，能引起有機體發(fā)生中毒的可能性，稱毒物危險性 ，是毒物對個人或群體的毒性效應(yīng)和產(chǎn)生疾病甚至死亡的定量估計。20 2）毒物危害性：指有毒物質(zhì)與有機體接觸和使用過程中，有引起中毒的可能性，稱毒物危害性，用來定性表示毒物對人群健康引起的有害作用。 物質(zhì)危害性的大小一般與物質(zhì)進入體內(nèi)的能力和數(shù)量有關(guān)，揮發(fā)性小，易溶于水或血液中，并能迅速達到中毒濃度的物質(zhì)的危害性大。 21（二）

11、毒性參數(shù) 1、常用毒性參數(shù) （1）致死劑量或致死濃度(LD，lethal dose or LC，lethal concentration) 絕對致死劑量或濃度 （LD100，Absolute lethal dose or LC100 ，Absolute lethal concentration） 指一群動物全部死亡的最低劑量或濃度。 半致死劑量或濃度（LD50，Median lethal dose or LC50， Median lethal concentration） 指能引起一群動物死亡50%的最低劑量或濃度。 22 最小致死劑量或濃度（MLD，Minimum lethal dose，M

12、LC，Minimum lethal concentration）： 能使一群動物僅個別死亡的最高劑量或濃度。 (2)最大耐受劑量和最大無作用劑量 最大耐受劑量或濃度（MTD0，Maximum tolerance dose or MTC0，Maximum tolerance concentration） 能使一群動物雖然發(fā)生嚴重中毒，但全部存活無一死亡的最高劑量或濃度。23 最大無作用劑量（Maximum no effect dose） 污染物對生物產(chǎn)生效應(yīng)隨污染物濃度或劑量的降低而減弱，當(dāng)外來化學(xué)物劑量減到一定量時，生物學(xué)變化已達到0，不能觀察到任何損害作用的最高劑量稱最大無作用劑量。 其是制

13、訂人體每日容許攝入量、最高容許濃度和評定污染物毒性作用的主要依據(jù)。24 最小有作用劑量（Minimal effect level） 指能使有機體發(fā)生某種異常變化所需的最小劑量。其一般大于最大無作用劑量，因此又稱中毒閾劑量。 半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50, Median effect concentration) 指能引起50%受試生物的某種效應(yīng)變化的濃度。 半數(shù)抑制濃度(IC50, Median inhibition concentration) 指能引起受試生物的某種效應(yīng)50%抑制的濃度。25（3）毒作用帶（Toxic effect zone）：是恒量污染物危險性大小的一個指標(biāo)。 急性毒性作用帶：

14、為半致死量與急性毒性最小有作用劑量的比值。 此值愈大，污染物危險性愈小，反之危險性愈大。26 慢性毒性作用帶： 是恒量毒物急、慢性毒性的一個指標(biāo)，急性毒性最小有作用劑量與慢性毒性最小有作用劑量之比。 比值愈小，表明引起急性中毒的危險性相對較大。反之，引起慢性毒性中毒的可能性愈大。272、毒物單位與分級 （1）毒物單位（濃度）：毒物在空氣中的濃度以mg/m3或mg/L表示； 哺乳動物以mg/Kg或ml/kg體重表示；水環(huán)境中的毒物以mg/L或g/L表示。 （2）毒物分級：毒物毒性的大小與半數(shù)致死量成反比，但不同化合物之間毒性差別很大，可達百萬甚至幾千萬倍。 為了加強毒物在生產(chǎn)、運輸、使用和貯存方

15、面的管理；便于制訂和比較環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準；在發(fā)生意外時, 采取相應(yīng)的保護措施，必須對毒物進行分級。 28 1）我國工業(yè)毒物急性毒性分級 29 2）我國農(nóng)藥急性毒性分級 30 3）水生生物評價體系 31二、毒性試驗（一）急性毒性試驗 指研究化學(xué)物質(zhì)大劑量一次染毒或者說24h內(nèi)多次染毒，動物所引起的毒性試驗。 目的：為了在短期內(nèi)了解某物質(zhì)的毒性大小，需做急性毒性試驗(Acute toxicity test) 。 有哺乳動物急性毒性試驗、水生生物急性毒性試驗和蚯蚓急性毒性試驗。321、哺乳動物急性毒性試驗： （1）實驗材料：小鼠和大鼠，若進行毒物皮試實驗，還可用家兔和豚鼠。（2）確定動物全活和全致死量

16、查閱文獻中與受試物的類似物的LD50 (LC50)，一般以3倍之差配制三個劑量組進行預(yù)試驗（1/3 LD50 ， LD50 ,3 LD50 ），每組3只動物，求出全致死量和全活劑量。3334 （3）在預(yù)試驗的全活量和全致死量之間，以各組間距1.2 1.5的“等比級數(shù)”，計設(shè)56個劑量組，進行染毒。觀察2周內(nèi)的死亡情況。 （4）病理解剖檢查：剖檢死亡或瀕死動物及部分存活的動物， 計算LD50或LC50。 （5）依急性毒性分級標(biāo)準，根據(jù)LD50或LC50，評定毒物的毒性， LD50值愈小，毒性愈大。352、水生生物急性毒性試驗 根據(jù)試驗對象，可分為魚類、水蚤類和藻類毒性試驗。 （1）實驗用魚：選擇

17、有區(qū)域代表性、便于實驗飼養(yǎng)、對物質(zhì)敏感的魚苗，如青、草、鰱及鳙四大淡水魚。體長一般小于7 cm為宜。有時還可用體長小于3 cm的金魚。 （2）實驗條件：采用玻璃缸或白搪瓷桶。盛水量以每條2 3L水為宜，pH6.7 8.5， 冷水溫度12 18 ，溫水溫度20 28 ，水溫變化 2 ，水中溶解氧不能低于4 mg/L，可用清潔河水、湖水或放置3天的自來水。3637（3）LC50測定 1）確定魚全活和全致死量： 方法同哺乳動物，也從文獻中查閱與受試物的類似物的LD50 (LC50)，做預(yù)試驗，確定全致死量和全活劑量。 2）以此濃度范圍，按“等對數(shù)間距”確定57個濃度組。每組1020尾魚，染毒4896

18、 h。染毒剛開始8 h內(nèi)經(jīng)常觀察，以后作24、48、72和96小時定期觀察，記錄中毒反應(yīng)和死亡時間。 （實驗期間注意保持水體溶解氧、pH、水溫的穩(wěn)定，并立即取出死魚）。 3）根據(jù)24、48和96 h 各組魚的死亡數(shù)，計算LC50。38（二）亞慢性毒性試驗（Subchronic toxicity test） 人類接觸的環(huán)境污染物水平通常低于急性中毒劑量或濃度，為了得到更接近實際情況的毒作用資料，需進行亞慢性和慢性毒性試驗。 在較長時期內(nèi)（約動物生命周期的1/301/20），使動物每日或反復(fù)多次染毒所進行的實驗。 目的是為對毒物的毒作用機理、靶器官和最大無作用劑量或中毒閾值作出估計。 391、動物

19、選擇 （1）一般選用對毒物敏感的動物種和品系，且應(yīng)與慢性毒性作用試驗中預(yù)計使用的動物相同。 （2）要求選擇兩種試驗動物，嚙齒類和非嚙齒類各一種，嚙齒動物常用鼠和兔，非嚙齒常用狗和貓。這樣可更全面了解受試物的毒草效應(yīng)。40（3）動物大小、只數(shù)和雌雄 選用健康、年幼的動物。小鼠約1417g，大鼠5080g，家兔和貓體重約12 kg，狗體重為58 Kg。各動物體重不應(yīng)超過組平均體重的20%。 大鼠各組不少于20只，兔、貓和狗較大動物不少于46只。 雌雄各半。 412、染毒劑量和實驗期限 （1）染毒劑量:一般用LD50或LC50的1/80 1/50作為亞慢性試驗劑量，也設(shè)三個劑量組。1）高劑量組：能引

20、起明顯的中毒反應(yīng)，但又不引起很多動物死亡為高劑量組。2）低劑量組：不引起任何中毒反應(yīng)為低劑量組。3）中間劑量組：介于二者之間。 （2）實驗期限:試驗期限隨目的和要求或動物大小而異。大鼠可90天，較大動物可46月。42 3、染毒途徑 主要經(jīng)胃腸道、呼吸道和皮膚接觸。注意：染毒途徑應(yīng)與預(yù)期進行的慢性毒性作用試驗相一致。 4、指標(biāo)觀察與檢查： 3個 （1）綜合指標(biāo)觀察：1）觀察動物的一般活動、癥狀和死亡情況。 2）每周稱重一次，記錄飼料或飲水量，計算生長率（各組每周攝入食量與體重增加量之比）。3）各臟器鮮重與單位體重的比重（臟器系數(shù)）。43 （2）血液及生化檢查： 主要指血清、肝和腎功能檢驗。 常規(guī)

21、項目包括血紅蛋白、紅、白細胞數(shù)、血小板數(shù)、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清尿素氮等。 （3）病理組織學(xué)檢查： 尸檢死亡和瀕死的動物，以及實驗結(jié)束后的被處死的動物。主要對肝、腎、睪丸等器官進行檢查。必要時還需進行組織化學(xué)和電鏡檢查。44 5、試驗評價 對受試物的主要毒作用、靶器官和最大無作用劑量及中毒閾劑量作出初步估價，并為進一步開展慢性毒性試驗提供依據(jù)。 45（三）慢性毒性試驗(哺乳動物)（Chronic toxicity test） 以低劑量外來化合物，長期與試驗動物接觸，觀察其對試驗動物所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)的試驗。 目的是確定最大無作用劑量，為制訂人體每日允許攝入量(ADI，Allowable daily

22、intake)和最高容許濃度(MAC，Maximum allowable concentration)提供毒理學(xué)依據(jù)。 有哺乳動物、水生生物慢性毒性試驗。 461、試驗動物和分組 1）試驗動物的年齡應(yīng)低于亞慢性試驗。 一般選用斷奶動物，如出生后3周的小鼠，體重約10 12g，出生后34周的大鼠，體重5070g。 2）試驗動物雌雄各半。 其它與亞慢性試驗相同。47 2、染毒劑量和實驗期限 根據(jù)亞慢性試驗，取其最低中毒劑量的1/10、1/20和1/50或LD50的1/1001/20中取34個劑量作為慢性試驗劑量。 （1）高劑量組：能引起明顯的中毒反應(yīng)為高劑量組。 （2）低劑量組：不引起中毒反應(yīng)為低

23、劑量組。 （3）中間劑量組：介于二者之間。 試驗期限：一般112月，若是致癌實驗則需18 24月。483、染毒途徑 經(jīng)胃腸道、呼吸道和皮膚接觸同亞慢性試驗4、觀察指標(biāo) 基本同亞慢性試驗，此外： （1）在試驗的第1個月，每周稱體重一次，在46個月期間，每2周稱體重一次，以后每4周稱體重一次。 （2）每2月進行一次血液及其它生長指標(biāo)(生長率、臟器系數(shù))測定。 （3）對病理檢查作半定量評定，即隨染毒時間的延長，器官形態(tài)結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，需根據(jù)病變程度加以分級評分。 49505、試驗評價:評價受試物在低劑量長時間接觸有機體時所引起的毒性作用。有2個方面： 1）依據(jù)敏感觀察指標(biāo)，出現(xiàn)異常的最小閾劑量，找出

24、該受試物的慢性毒作用的最大無作用劑量，為受試物能否可被應(yīng)用或為制訂其在環(huán)境中的衛(wèi)生標(biāo)準，提供依據(jù)。 2）通過對動物的一般觀察及其對各臟器的病理學(xué)檢查，對受試物的致癌性評定提供依據(jù)。51（四）蓄積毒性試驗 1、 低于中毒閾劑量的外來化合物，反復(fù)多次地與機體持續(xù)接觸，經(jīng)一定時間后使機體出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)，即為蓄積毒性作用(Cumulative toxicity action)。 （1）物質(zhì)蓄積：環(huán)境污染物不斷進入有機體，若吸收量大于排出量，使其在體內(nèi)的量逐漸積累增多。 （2）功能蓄積：不斷進入有機體的污染物反復(fù)作用于機體，引起機體一定結(jié)構(gòu)或功能的變化，并逐漸累積加重，最后導(dǎo)致出現(xiàn)損害作用。522、

25、試驗方法（1）蓄積系數(shù)法（Cumulative Coefficient method） 蓄積系數(shù)（Cumulative Coefficient）：指多次給受試物后，引起50%受試動物出現(xiàn)某種毒效應(yīng)的總劑量 ( ) ，與一次給受試物后引起50%受試動物出現(xiàn)同一毒效應(yīng)的劑量（ ）的比值。 比值愈大，說明引起50%動物出現(xiàn)某種毒效應(yīng)的使用劑量較大，藥物代謝作用強，而蓄積作用較小，反之，表示蓄積作用愈強。53 54有兩種實驗方法測定K1）固定劑量每天連續(xù)染毒法 對受試動物以1/101/20 LD50的固定劑量，每天進行染毒一次，觀察記錄動物死亡情況。 當(dāng)染毒累計達5個LD50以上時，若受試動物死亡數(shù)未

26、超過半數(shù)，此時的蓄積系數(shù)已大于5，表明該受試動物的蓄積作用不明顯。 552）劑量定期遞增染毒法 取一組受試動物，每天染毒一次，以4天為一期，開始的第一期每天染毒劑量為1/10 LD50,隨后染毒劑量每隔4天按1.5倍遞增一次。 56 每天記錄動物的死亡情況，若連續(xù)染毒已達20天，此時,每天的染毒劑量0.5 LD50(=1.54LD50/10)，累計總劑量達(1+1.5+1.52+1.53+1.54) 4 LD50/10 = 5.30LD50。 如果受試動物死亡未達到50%,則表示該受試物的蓄積作用不明顯，試驗可停止。如果受試動物出現(xiàn)死亡達50%，就可算出染毒系數(shù)K。57 （2）20天蓄積試驗法

27、 按的LD50 的1/20、1/10、1/5、1/2和0隨機分成5組，每天對動物進行染毒，連續(xù)20天，各組總劑量分別為0、1、2、4、10 LD50。觀察停藥7天內(nèi)的死亡情況。 1）如1/2 LD50組有死亡，且各劑量組呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，則受試動物有較強的蓄積作用。 2）若1/20 LD50組有死亡，且各劑量組呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，則為中等蓄積作用。 3）若1/20 LD50組無死亡，且各劑量組無劑量-反應(yīng)關(guān)系，則為無明顯蓄積作用。 58（3）受試物生物半減期測定法 生物半減期（T 1/2）：指一種外來化合物在體內(nèi)的量或濃度下降到原來濃度或量的一半所需的時間。T 1/2越大，表明在體內(nèi)存留時間越長

28、，蓄積作用越大。 測定方法：機體接觸污染物后，在間隔一定時間內(nèi)分別測定血液、尿液、器官組織中該物質(zhì)的濃度，然后求出T 。 （y1和y2分別是t1和t2時間測得該物質(zhì)的濃度）59 第三節(jié) 生物致突變、致畸和致癌效應(yīng)檢測一、生物致突變 1、突變：生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生了基因結(jié)構(gòu)的改變稱為突變（mutation）。 可分為基因突變和染色體突變兩大類，此兩類突變本質(zhì)上無差異，只是染色體突變可憑光學(xué)顯微鏡觀察。 602、突變意義 （1）農(nóng)業(yè)作物育種：在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)作物就是通過定向突變篩選獲得優(yōu)良品種。 （2）從理論上講，突變可能會出現(xiàn)有益的后果，但由于概率極小，且無法鑒別和控制，所以，外來化學(xué)物對人類引

29、起的致突變可能有很大的潛在危險。 所以，從毒理學(xué)角度，突變一般認為是外來化合物毒性作用的表現(xiàn)。61 3、致突變試驗試驗方法 致突變試驗：可分基因點突變試驗、染色體畸變試驗和DNA損傷試驗等，可在活體或體外進行。 有（1）體外基因突變試驗，（2）細胞遺傳學(xué)實驗，（3）體內(nèi)基因突變試驗，（4）DNA損傷試驗等。 62（一）體外基因突變試驗（In vitro mutation test） 1、鼠傷寒沙門氏菌試驗法 （1）基本原理 將一種營養(yǎng)缺陷型如不能合成組氨酸的鼠傷寒沙門氏菌和化學(xué)致突變物接觸，若此化合物是致突變性的，則可使此突變微生物發(fā)生回復(fù)突變，重新成為野生型，而能在不含或少含His的培養(yǎng)基中

30、生長。據(jù)此鑒定化合物的致突變作用。 為使受試物在體外測試中獲得同活體類似的代謝活性，在培養(yǎng)基中常加入哺乳動物肝細胞的微粒體和受氫系統(tǒng)。63（2）方法優(yōu)缺點 優(yōu)點：方法簡單；快速，一般在48 h內(nèi)可得出結(jié)論；費用低；靈敏，檢測結(jié)果與動物致癌性相符率達90%。 缺點：1）微生物的遺傳信息含量低，僅為哺乳動物的1/6。2）微生物DNA修復(fù)系統(tǒng)沒有哺乳動物復(fù)雜而精巧。3）微生物無免疫功能。4）對于不在肝臟代謝轉(zhuǎn)化的化合物，如蘇鐵素，不能檢測其突變性。642、哺乳動物體細胞株突變試驗 基本原理：有些哺乳動物突變細胞株系，當(dāng)與化學(xué)致突變物接觸后會發(fā)生回復(fù)突變，代謝發(fā)生改變，依此確定毒物的致突變性。 常用細

31、胞突變系：中國地鼠肺細胞V79、中國地鼠卵巢細胞株CHO和小鼠淋巴瘤L5178Y細胞株等。65（1）肺細胞V79和卵巢細胞株CHO細胞突變株系 由于嘌呤堿類似物如6-巰基嘌呤可抑制DNA的合成，正常細胞株系生長會受到抑制。而 V79和CHO細胞突變株系由于缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)，當(dāng)在培養(yǎng)基中加入某些嘌呤堿類似物如6-巰基嘌呤等時，它們?nèi)阅苌L。 當(dāng)V79和CHO細胞突變系與這些嘌呤堿類似物接觸后，會發(fā)生回復(fù)突變成正常株， 生長受到抑制，說明發(fā)生了致突變。 66 （2）小鼠淋巴瘤L5178Y細胞株 此細胞株系缺乏胸苷激酶(TK), 如在培養(yǎng)基中加入細胞毒素5-溴脫氧尿苷

32、，仍能生長。 但當(dāng)此種細胞系與致突變物接觸后會發(fā)生回復(fù)突變，又轉(zhuǎn)化為正常細胞，而恢復(fù)對此毒素的利用，而抑制其生長。說明發(fā)生了致突變。67（二）細胞遺傳學(xué)實驗 (Cytogenetics Test) 1、 染色體畸變試驗(Chromosome aberration test) 利用光學(xué)顯微鏡直接觀察生物體細胞在受致突變物作用后,染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化。 (1)離體試驗：常用中國地鼠卵巢細胞株CHO （缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)和人類外周血（指進入血液循環(huán)的血液，即平時所采血），檢測卵巢細胞株CHO和人類淋巴細胞的染色體變化。 (2)體內(nèi)試驗：常檢查骨髓細胞、胸腺、脾、精原細胞的染色體的

33、畸變。 68CHO細胞系或人類淋巴細胞染色體畸變分析 1）選用細胞培養(yǎng)液如DMEM、RPM或1640任一種，加入化學(xué)致突變物，在3下，培養(yǎng)CHO（缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)細胞24 h或人類淋巴細胞為72 h。 2）在收獲細胞前2 h，向培養(yǎng)液中加入秋水仙堿，以終止細胞分裂，使細胞分裂同步于分裂中期。 3）離心得到沉淀細胞，然后制片鏡檢有無染色體畸變。 4）觀察染色體有無斷裂、缺失、易位、形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)等畸變， 以及出現(xiàn)多處斷裂的百分率。6970染色體畸變結(jié)果評定 確定受試物能否引起染色體損傷或數(shù)目的改變，以及要確定有這些改變的細胞能否存活一個細胞周期以上。 1）一些小缺失和相互易位的

34、畸變，因其可能長期存在而比大缺失有更大的危險性。 2）染色體斷裂、缺失、易位、形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)等是染色體開放性斷裂的結(jié)果，但也可能是斷裂后修復(fù)的結(jié)果。 3） 有些化合物只作用于細胞分裂某一時期，故試驗時要注意收獲時間。 712、微核試驗（Micronucleus test） （1）微核形成 核膜受損：在受化學(xué)致突變作用下，若核膜受損，核物質(zhì)會向外突出延伸，形成一個或幾個規(guī)則圓形或橢圓形小體，稱微核。 紡錘體受傷：由于紡錘體受傷或染色體的無著絲點斷裂，受傷染色體在分裂后期仍停留在細胞質(zhì)，而形成微核結(jié)構(gòu)。 有動物細胞微核率試驗、細胞培養(yǎng)微核試驗和蠶豆根尖微核試驗等。7273 （2）動物細胞微核率試驗

35、1）骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 以頸椎脫臼處死動物，用小牛血清將骨髓細胞沖洗入離心管。離心，棄去上清液，留少量血清懸浮細胞后進行涂片。甲醇固定、Giemsa染色（核染色）后進行觀察。 每只動物要求觀察計數(shù)1000個嗜多染紅細胞，求出出現(xiàn)微核細胞的頻率。742）外周血淋巴細胞微核試驗 取人或動物的外周血23滴(骨髓外血），于盛有1.5 ml Tris-NH4Cl緩沖液的離心管中，混勻后置于37 下保溫5 h，使紅細胞溶解。 取5滴溶解液，混勻后離心，棄上清液，于沉淀物中再加 5 ml固定液，放置10 min后離心，棄上清液，取沉淀物涂片，鏡檢。 75二、致畸效應(yīng)（一）基本概念1、致畸作用（Tera

36、togenesis） 胚胎的細胞分化和器官形成不正常，而造成組織器官上的缺陷，并出現(xiàn)肉眼可見的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常稱畸形。致畸物通過母體作用于胚胎，引起胎兒畸形的現(xiàn)象稱致畸作用。 目前已知1000多種環(huán)境因素可引起動物及人的畸胎。60年代初，孕婦因服用“反應(yīng)?！倍鴮?dǎo)致近萬名畸形兒。 許多國家對一些藥物、農(nóng)藥、食品添加劑、防腐劑以及工業(yè)化學(xué)品規(guī)定應(yīng)經(jīng)過致畸試驗。 7677 2、致畸作用的毒理學(xué)特點 (1) 不同發(fā)育階段的胚胎對致畸物有不同的敏感性，一般在胚胎形成早期，對致畸物最敏感。致畸物在接觸胚胎時，可因胚胎處于不同發(fā)育階段而引起不同的畸形。 (2) 不同種系的動物，由于代謝和胎盤結(jié)構(gòu)的不同，對致畸物

37、呈現(xiàn)不同的敏感性。 （3）致畸作用劑量-反應(yīng)曲線很陡，最大無作用劑量與引起胚胎死亡最低劑量僅相差23倍。 783、化學(xué)致畸作用機理 (1) 母體正常代謝過程受到破壞 致畸物使母體正常代謝過程受到破壞，使子代細胞在生物合成過程中缺乏必需的物質(zhì)，而影響胚胎的正常發(fā)育。(2)生殖細胞分裂過程的障礙 致畸物可干擾細胞的分裂過程,引起生殖細胞減數(shù)分裂或合子的細胞有絲分裂過程的障礙,導(dǎo)致細胞死亡,胚胎出現(xiàn)畸形。 79 (3)突變引起胚胎體細胞發(fā)育異常 致畸物可使胚胎的體細胞發(fā)生突變, 有時還可引起酶分子的氨基酸組成發(fā)生改變,而引起代謝功能的缺陷, 胚胎致畸。 (4)通過抑制或破壞重要代謝酶的活性起作用 這

38、些致畸物雖不影響生殖細胞減數(shù)分裂或細胞有絲分裂或誘發(fā)染色體突變，但可通過抑制或破壞對細胞生長分化較為重要的酶的活性,如DNA聚合酶、核糖核苷酸還原酶等活性，而影響胚胎的正常發(fā)育。80（二）試驗方法 致畸試驗：是檢測某些環(huán)境污染物能否通過妊娠母體引起胚胎畸形的一種動物試驗法。 1、動物選擇要求： (1) 選擇與人類代謝相似的動物，并具與人類相似的胎盤結(jié)構(gòu)，如胎盤層數(shù)和厚度。 (2)妊娠期短, 利于觀察。 (3) 產(chǎn)仔多, 以獲得足夠的標(biāo)本。(4)此外,還應(yīng)符合試驗動物的一般要求,如體型小、易馴服、繁殖以及價廉。 一般選擇大鼠和小鼠和家兔。812、劑量設(shè)定 (1) 受試物劑量的大小，應(yīng)根據(jù)試驗時給

39、予受試物的次數(shù)及連續(xù)時間的長短而定，若試驗期間只給一次，此時劑量稍大，反之則小。 （2）高劑量組，以不使母體產(chǎn)生明顯中毒而導(dǎo)致流產(chǎn)為限度。一般可以LD50的1/31/2為最高劑量組，LD50的1/30 1/100為低劑量組。 （3）試驗動物數(shù)：均以經(jīng)交配確定已受精的雌性動物為計數(shù)對象，每組不少于15 20只，家兔7 8只。823、受試動物的處理 （1）動物受孕：選擇一批性成熟，未交配過的雌鼠和雄鼠，以一雄一雌或二雌一雄比例，同籠過夜，次日清晨檢查雌鼠是否受孕。查到日為孕期0天，次日為第一天，孕期約1月。 （2）藥物處理方法和時間：一般多采用灌胃方法，在胚胎敏感期給藥。 若過早給予可影響受精卵著

40、床，過遲則對發(fā)育成熟的胚胎往往不能顯示致畸作用。834、試驗動物的解剖（1）解剖時間：預(yù)計自然分娩前12天為宜， 以防止胎仔自然分娩后被吃或被咬傷?？闪?/4的動物待其自然分娩，并將胎仔喂養(yǎng)到斷奶，進行仔細觀察和檢查。（2）解剖檢查 1）胎仔外部檢查：如活胎數(shù)、早、晚期死胎數(shù)和吸收胎數(shù)；對活胎要檢查性別、體重、身長、尾長及全窩胎盤總重量等。84 2）胎仔的骨骼檢查 先用75%90%乙醇-1%KOH固定至肌肉透明; 再用茜素紅染色25d，至骨骼染成桃或紫紅色; 再經(jīng)透明處理后，檢查骨骼的形態(tài)、大小、數(shù)量有無異常及骨化程度。 3）胎仔內(nèi)臟檢查 經(jīng)外觀檢查后的活胎仔，按隨機法，將胎仔數(shù)的1/21/3

41、置于Bouin氏液中固定12周后，取內(nèi)臟和軟組織如腭裂、腎等，用徒手切片法制片，觀察結(jié)構(gòu)變化。 P126，表3-11（外觀畸形）；表3-12（骨骼畸形）；表3-13（臟器畸形）。85 5、致畸作用的評價 為科學(xué)的評價受試物有無致畸作用。應(yīng)注意： (1) 試驗結(jié)果中出現(xiàn)的畸形率高低, 須從出現(xiàn)畸胎的孕仔率、胎仔發(fā)生畸形率、單項畸形率、總畸形率等多方面進行統(tǒng)計綜合分析；比較試驗組與對照組有無差異；有無劑量-反應(yīng)關(guān)系；而后才能作用評定。 (2) 同種動物重復(fù)試驗和多種動物試驗的結(jié)果一致,才能得出一致的結(jié)論。 86 (3)生物在正常情況下也有變異，有時難以區(qū)分。但一般致畸率高、有特異性、且有劑量-效應(yīng)

42、或反應(yīng)關(guān)系，應(yīng)作致畸論。 (4)不同種系的動物對同種致畸物的致畸作用可能有差異。當(dāng)在其它動物上試驗的結(jié)果，和從臨床觀察、流行病學(xué)調(diào)查等如果也獲得同樣的結(jié)果，才能下正確的結(jié)論。 87三、致癌效應(yīng)（一）基本概念 目前的中國癌癥診斷率6人/min，其中有1 人得肺癌。據(jù)估計人類腫瘤有80%90%與環(huán)境因素有關(guān)，其中化學(xué)因素有關(guān)者占80%85%，因此，化學(xué)致癌作用極其重要。 化學(xué)物質(zhì)（有機、無機、合成）引起腫瘤的過程稱化學(xué)致癌作用。能誘發(fā)腫瘤的化學(xué)物質(zhì)稱化學(xué)致癌物。88癌細胞的主要特征 1、喪失細胞接觸性生長抑制特性，惡性增長不死細胞。 2、形態(tài)顯著改變的變態(tài)細胞。 3、細胞膜上的糖蛋白減少，易在體內(nèi)

43、分散和轉(zhuǎn)移。為粘著性降低的擴散細胞。 89癌變誘發(fā)因子： 1、物理致癌因子：紫外線、X射線、輻射等。 2、化學(xué)致癌因子：1）無機物：砷化物、鉻化物、鎘化物、石棉等。2）有機物：聯(lián)苯胺、烯環(huán)烴、亞硝胺、黃曲霉毒素等。 3、病毒致癌因子： 肝炎病毒：肝癌， Rous肉瘤病毒 90 世界衛(wèi)生組織下屬的“國際癌癥研究中心”對900多個因素進行評估，公布116種明確致癌物和66種可能致癌物（2016年搜狐網(wǎng)）。其中，明確致癌物中有： （1）食品類：酒精、煙草、發(fā)霉谷物或堅果（黃曲霉素）、檳榔果、烤熏食品（苯并芘）、火腿、培根等加工類肉食、自來水中的亞硝基二甲胺。 （2）環(huán)境類：空氣污染（PM2.5) 、電離輻