時(shí)間分辨熒光免疫分析ppt課件

1、5-2 時(shí)間分辨熒光免疫分析鄭鵠志西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院開展歷程1979年，可標(biāo)志抗體的Eu3+-二酮體-EDTA1983年，建立時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)，用于測定HCG和磷酸酯酶A“鑭系元素時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)及儀器的配套研討獲2003年度國家科技提高二等獎(jiǎng)一、時(shí)間分辨熒光免疫分析特點(diǎn)1.熒光衰減時(shí)間長鑭系元素?zé)晒馑プ儠r(shí)間常見熒光物質(zhì)熒光壽命熒光物質(zhì)熒光壽命Eu3+714 s非特異性熒光背景1-10 ns人血清白蛋白4.1 ns人球蛋白、血紅蛋白3.0 ns細(xì)胞色素C3.5 nsFITC4.5 ns丹磺酰氯14 ns苯胺萘磺酸16 ns稀土螯合物104 -106 ns2. Stokes位移大 熒光

2、物質(zhì)激發(fā)波長發(fā)射波長Stokes位移Eu-(-NTA)3340 nm613 nm273 nmSm-(-NTA)3340 nm600 nm260 nmTb-(PTA)3295 nm490/543 nm195/248 nmDy-(PTA)3295 nm573 nm278 nm鑭系元素發(fā)射峰窄優(yōu)點(diǎn)靈敏度高10-18mol/孔原子標(biāo)志多標(biāo)志技術(shù)二、時(shí)間分辨熒光免疫分析體系非均相時(shí)間分辨熒光免疫分析均相時(shí)間分辨熒光免疫分析一非均相時(shí)間分辨熒光免疫分析時(shí)間分辨固相免疫分析解離加強(qiáng)熒光免疫分析酶放大免疫分析1.時(shí)間分辨固相免疫分析靈敏度普通不高實(shí)例加拿大Cyber Fluor的FIAgen系統(tǒng)Eu3+-BC

3、PDA為標(biāo)志物2.解離加強(qiáng)分析原理表示圖1雙功能螯合劑EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物一端與鑭系離子螯合，一端與抗原/抗體銜接近中性時(shí)，螯合物足夠穩(wěn)定酸性條件下，鑭系離子迅速、徹底釋放Eu-DTTA運(yùn)用最廣泛2加強(qiáng)液加強(qiáng)原理圖普通加強(qiáng)百萬倍-NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2復(fù)合物TOPO：熒光加強(qiáng)協(xié)同劑Triton X-100：外表活性劑，構(gòu)成膠束醋酸：酸性介質(zhì)3酶放大酶催化底物，生成的產(chǎn)物與溶液中鑭系離子、螯合劑生成熒光強(qiáng)、壽命長的三元復(fù)合物ALP酶放大免疫分析表示圖雙標(biāo)志測定AFP和-hCG-NTA作為螯合劑340 nm 激發(fā)，Eu:615 nm, 820 s；Sm:

4、643 nm, 88 s二均相免疫分析基于時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移無需洗滌、分別、加加強(qiáng)液TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大發(fā)射615nm，供體APC：別藻藍(lán)蛋白，最大發(fā)射665nm，受體能量轉(zhuǎn)移效率最高的供體/受體對時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析表示圖三、時(shí)間分辨免疫分析方法夾心法競爭法間接法捕獲法生物素-親和素放大法1. 夾心法雙抗體夾心法雙抗原夾心法2. 競爭法3. 間接法間接法測定HCV抗體4. 捕獲法捕獲法測定抗-CMV IgM5. 生物素-親和素法生物素-親和素檢測PAPP-A四、運(yùn)用1. 腫瘤標(biāo)志物檢測2. 傳染病檢測3. 糖尿病檢測4. 激素檢測5. 細(xì)胞活性檢測1.腫

5、瘤標(biāo)志物AFP測定：雙抗體夾心法固相包被抗體參與樣品或規(guī)范品參與Eu標(biāo)志抗體參與加強(qiáng)液測定熒光靈敏度：0.17 U/ml2. 傳染病檢測梅毒螺旋體抗體檢測：雙抗原夾心法強(qiáng)陽性血清和正常人血清分別作為陰陽對照陰性對照、陽性對照和樣品參與板上，孵育參與銪標(biāo)志抗原，孵育參與加強(qiáng)液，檢測熒光符合中國藥品生物制品鑒定所結(jié)果3.糖尿病檢測C-肽檢測：雙抗體夾心法抗體包被微孔板參與規(guī)范品或樣品參與銪標(biāo)志抗體加強(qiáng)液，檢測熒光靈敏度：0.08ng/ml4.激素檢測三碘甲狀腺原氨酸T3：競爭法微孔板中參與抗體規(guī)范品或樣品、銪標(biāo)志T3參與加強(qiáng)液，測定熒光靈敏度：0.21ng/ml5.細(xì)胞活性檢測測定細(xì)胞活性原理圖T：靶細(xì)胞E：效