川楝素的提取及其生物活性的測定(共7頁)

1、川楝素的提取及其生物(shngw)活性的測定實習(shx)目的： 1）增強(zngqing)學生的動手實踐能力，把課本所學的知識運用到生產(chǎn)實踐當中，達到學以致用的目的。2）讓學生真正了解天然產(chǎn)物的意義、內(nèi)容、范圍、特點及其應(yīng)用的過程。3）培養(yǎng)學生的社會生產(chǎn)經(jīng)驗，為以后的社會生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。實習時間：2013年6月10日2013年6月12日生產(chǎn)實習基地西農(nóng)大學生科創(chuàng)實驗基地（西農(nóng)生物質(zhì)資源化學利用實習基地、陜西省資源化學與可持 續(xù)利用工程研究中心中試基地、西農(nóng)愛康企業(yè)（楊凌）產(chǎn)品研發(fā)與檢測實驗室、西農(nóng)陜西省科學院制藥廠.植物提取車間）川楝素的發(fā)展背景川楠素是1955年四川中藥研究所根據(jù)我國古代文獻

2、記載、傳統(tǒng)醫(yī)學及民間流行使用情況, 在尋找代替進口藥物山道年驅(qū)蛔藥物時從幾種楠屬植物中發(fā)現(xiàn)的。在臨床治療的配合下, 四川省中藥研究所第三研究室從1953年起, 開始探索川辣的驅(qū)蛔有效成份,1955年從韌皮部中分離出一種有效成份晶休, 定名為川楝素（Toosendonin）該品為白色針狀晶體, 無色、無臭、味苦。易溶于乙醇甲醉乙酸乙脂丙一酮、二氧六環(huán)、吡啶等, 微溶于熱水、氯仿、苯、乙醚，難溶于石油醚。熔點在含一分子結(jié)晶水時為178180 , 乙醉中結(jié)晶產(chǎn)物為238240 , 薄層上分單一的兩個色點的熔點為243245 。四川省中藥研究所顧月翠等用紙層分析光光度側(cè)定法來定性定里分析川辣素。以乙二

3、醇作固定相, 苯一丙酮一乙二醇（9：1：飽和） 作移動相, 紙層析分離, 用對二甲氨基苯甲醛硫酸試劑顯色。并發(fā)現(xiàn)川株素層析圖譜始終存在有兩個點而推測其有互變異構(gòu)現(xiàn)象。鐘熾昌等通過化學反應(yīng)及光譜分析, 證明川株素為一吠喃三菇類化合物。初步確定了它的化學結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型（圖1） 川楝素的研究(ynji)現(xiàn)狀目前，提取川楝素的方法主要(zhyo)有：有機溶劑浸取法、連續(xù)溶劑萃取法等。前一方法中直接用有機溶劑浸漬川楝韌皮粉，提取時間長；后一方法采用80的水首先浸提川楝韌皮粉，再用氯仿萃取水提取濃縮液中的川楝素，該方法以水為溶劑(rngj)，大大降低了提取成本，川楝素的提取率為0.25-0.3%，但存在浸

4、取時間長，能耗大等缺點。隨著川楝素的廣泛應(yīng)用，其需求量也越來越大，因此找到一種新的川楝素提取方法也越來越迫切。超聲波是頻率高于20HZ，并且不引起聽覺的彈性波?，F(xiàn)普遍認為其空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機械作用是超聲技術(shù)在植物有效成分提取中的三大理論依據(jù)。超聲作用可以使常溫常壓不能發(fā)生的化學反應(yīng)在空化作用下發(fā)生，甚至使非常堅硬的固體被粉碎?？刂埔欢ǖ某曨l率和強度，空化作用產(chǎn)生的極大壓力造成生物細胞壁及整個生物體破裂，而且整個破碎過程在瞬間完成，同時超聲波產(chǎn)生的振動作用加強了細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散及溶解。被浸取的物質(zhì)在被破碎瞬間生物活性保持不變，同時提高破碎速度和提取率。超聲波協(xié)助提取方法具有方便、快速、

5、簡單、安全等優(yōu)點，人們廣泛利用超聲波技術(shù)提取環(huán)境中的重金屬、植物樣品中的重金屬及有效成分。 六、實習內(nèi)容設(shè)備結(jié)構(gòu)圖具體實習(shx)內(nèi)容2.1 材料(cilio)與試劑20kg川楝子，80%的工業(yè)(gngy)乙醇，乙酸乙酯，石油醚，NaCl，Na2SO4，氯仿，甲醇，28人工海水孵化28h的鹵蟲1525頭。2.2 主要儀器中草藥熱回流提取機組（陜西省三原昌泰有限責任公司）、R1002B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（規(guī)格 10L，上海申生科技有限公司）、RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮升化儀器廠）、SHB-3 循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）、FA2004 電子天平（上海舜字恒平科學儀器有限公司 senc

6、o）、DG/20-002A 臺式干燥箱（中華人民共和國重慶試驗設(shè)備廠）、XSZ-4G 生物顯微鏡（重慶COIC）、移液槍。2.3 實驗步驟2.1.1 提取工藝流程介紹在進行提取之前，負責車間人首先先帶我們熟悉了一下車間的整體情況以及實驗操作要點。給我們詳細的講述了整個車間的操作流程，包括機械控制、進出料、冷卻水走向以及料液走向等。在參觀的過程中，我們看見了一套完完整整的管路系統(tǒng)。在整個系統(tǒng)中，冷卻水始終是下進上出，用來加熱的油也是下進上出。各種管道相互交錯組成了一個非常復雜的管路。提取的裝置是一個很大的提取罐，工業(yè)上用的是6t的橢圓形提取罐，但本次試驗采用的是500L的一般的提取罐，提取罐上面

7、有三個進口，分別為物料進口、溶劑進口和回流口。注意在操作過程中不要觸碰到運輸油的管道。2.1.2 提取首先將20kg的川楝子、80%的乙醇溶液按1：10的比例加入到提取罐中。由于時間原因，略去了3h的浸泡階段(jidun)，直接開始加熱提取，加熱是通過320#的油加熱夾層中的蒸汽實現(xiàn)的，68開始回流。每次提取(tq)維持兩個小時，共提取了兩次。2.1.3 濃縮(nn su)正規(guī)的濃縮應(yīng)該是在濃縮罐里進行的，但由于此次的料液量比較少，故分批在一個較大的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上對粗提液進行濃縮，冷卻液用的是乙醇，其效果比水冷卻好。濃縮進行了兩天。故我們的萃取實驗用的是前面班級的提液。2.1.4 萃取石油醚萃取

8、：用200mL石油醚對濃縮液進行萃取，萃取兩次。分液漏斗中上層為石油醚相，金黃色油層，下層水相為紅棕色溶液。乙酸乙酯萃取：用200mL工業(yè)乙酸乙酯對經(jīng)石油醚萃取之后的水相進行萃取，萃取三次，分液漏斗中上層為乙酸乙酯相，橙黃色油層，中層為乳狀液（分液漏斗搖晃過于激烈的緣故），下層為水相，紅棕色溶液。每次得到的乙酸乙酯相飽和NaCl溶液洗滌，除去乙酸乙酯剩余的水分。分別對最終的石油醚相、乙酸乙酯相、水相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行旋蒸除去石油醚、乙酸乙酯、水相至膏狀。石油醚相和乙酸乙酯相旋蒸后剩余的物質(zhì)放在蒸發(fā)皿中自然晾干，水相旋蒸后剩余的放在干燥箱中烘干。2.1.5 生物活性測定稱取3.6g石油醚、3.4g

9、乙酸乙酯、2.6g水相中的物質(zhì)與PCR管中，經(jīng)過處理后，分別用DMSO進行溶解，配制成200mg/mL的溶液。由于水相中物質(zhì)的溶解度比較小，所以需用超聲波清洗儀進行處理，促進其溶解。準備三個96孔板，分別標明：石油醚相、乙酸乙酯相和水相。在標有石油醚相的孔板上取前三列為陽性對照（純的川楝素對鹵蟲的致死實驗，也分為100ppm，50ppm，10ppm）。接下來每三列為一個小組，共三組。每個孔板上的每一個小組中第一列為100ppm的混合液，第二列為50ppm的混合液，第三列為10ppm的混合液，100ppm：10L配好的溶液+190L鹵蟲液；50ppm：5L配好的溶液+195L鹵蟲液；10ppm：

10、1L配好的溶液+199L鹵蟲液）。在石油醚相板中設(shè)了四組對照，第一組為10L DMSO+190L鹵蟲液；第二組為5L DMSO+195L鹵蟲液；第三組為1L DMSO+199L鹵蟲液；第四組為200L鹵蟲液。在96孔板上面加液時，全部用移液槍進行。 孔板上面的混合液和鹵蟲配完后，在室溫下放置24個小時，然后分別將三個孔板放入顯微鏡下面數(shù)死去海蝦的數(shù)量，再將孔板至于60左右的干燥箱中進行高溫處理后，數(shù)出海蝦的總數(shù)，得到的數(shù)據(jù)如下表1-4所示。并且對三相用15:1的氯仿-甲醇展開劑進行TCL色譜分析，結(jié)果如圖3，純的川楝素中出現(xiàn)兩個斑點。石油醚相比乙酸乙酯相展開得快，水相基本上沒怎么展開。 圖 3

11、 TLC 色譜分析(s p fn x)圖表 1 石油醚相板石油醚相板陽性對照第二組100ppm50ppm10ppm100ppm50ppm10ppm123789A9/94.5/56/813/175.5/72/8B7/73/32/29/177.5/93.5/5C8.5/96/74.5/910/1410/183/8D2/23/34.5/52.5/76.5/123/10E3/33/30/019/2110/144.5/17F11/113.5/47/711/144/85/9平均死亡率%99.07 93.87 83.00 67.60 65.51 40.75 表 2 乙酸乙酯相板 乙酸乙酯相板第二組100pp

12、m50ppm10ppm789A8/102/28/8B13/133/33/3C11/116/610.5/11D9/912/157/9E11/123/310/10F13/133/43/3平均死亡率 % 95.28 92.50 95.54 表3 水相板水相板第二組100ppm50ppm10ppm789A2.5/50/40/7B1/170/50/16C0/140.5/91.5/5D0/70/51/8E1/31/110.5/22F2/170/21/20平均死亡率 % 16.83 2.44 8.30 表4 對照(duzho)試驗對照組100ppm50ppm10ppm鹵蟲液平行實驗0.17 0.25 0.0

13、7 0.00 0.10 0.25 0.13 0.05 0.25 0.10 0.20 0.05 平均死亡率17.22 20.00 13.49 3.03 計算公式：活性用校正(jiozhng)死亡率表示： 校正(jiozhng)死亡率=（處理組死亡率-對照組死亡率）/(1-對照組死亡率)100% 表5 校正死亡率校正死亡率陽性對照不同濃度處理（第三組）/ppm10050101005010石油醚相% 99.0793.87 83.0060.8656.8931.51乙酸乙酯相%94.3090.2394.84水相%-0.47-21.95-6.00實驗結(jié)果與誤差分析實驗結(jié)果由實驗(shyn)數(shù)據(jù)及計算結(jié)果可

14、知，對海蝦的致死率由高到低依次(yc)為，乙酸乙酯相、石油醚相、水相。并且(bngqi)會隨著濃度的增大致死率增大。說明川楝素主要存在乙酸乙酯相中。水相的校正死亡率均為負值，原因可能為：水相中含有促進海蝦生長的物質(zhì)。誤差分析1.當濃度為100ppm和50ppm時，與陽性對照組的致死率很接近，但濃度為10ppm時，與陽性對照組相差很大?？赡苁且驗闈舛忍?，移取液體時，給實驗帶來了誤差。2.川楝素的不完全浸取，提取液轉(zhuǎn)移過程中存在損失，干燥過程中川楝素的部分失活；3.旋蒸移液過程、萃取過程中，部分溶液損失，造成實驗誤差；4.海蝦的吸取不具有代表性、每個孔板內(nèi)海蝦數(shù)量不定、顯微鏡下觀察時間過長，溫度過高導致海蝦的死亡；5.配置的溶液濃度有點大，海蝦少，造成海蝦致死率高等均對實驗結(jié)果造成了一定的不準確性。6.在數(shù)海蝦數(shù)量時，由于每個人數(shù)的標準都不一樣，所以造成實驗結(jié)果產(chǎn)生誤差。4.實驗總結(jié)與體會 本次天產(chǎn)加工實習我們完成了對川楝素的提取及生物活性測定，對與實驗流程有了熟悉的了解。并且通過三天的熟悉觀察完成了設(shè)備結(jié)構(gòu)圖，很有成就感。第一次做生物活性測定實驗，