基因工程復(fù)習(xí)重點(共25頁)

1、安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2011級生物技術(shù)專業(yè)（僅供參考） 基因工程(jyn gngchng)復(fù)習(xí)重點第一章 緒論(xln)1.克隆(k ln)：當(dāng)它作為名詞使用時，是指從一個祖先通過無性繁殖方式產(chǎn)生的后代，或具有相同遺傳性狀的DNA分子、細胞或個體所組成的特殊的生命群體；當(dāng)它作為動詞使用時，是指從同一祖先生產(chǎn)這類同一的DNA分子群或細胞群的過程。因此，基因工程也可稱為基因克隆或DNA分子克隆。 2.基因工程誕生于1973年。3.在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中，理論上的三大發(fā)現(xiàn)及技術(shù)上的三大發(fā)明對基因工程的誕生起到了決定性的作用。1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)（1）40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA而不是

2、蛋白質(zhì)。 （2）50年代明確了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機理。（3）60年代確定了遺傳信息的傳遞方式，即中心法則的建立和遺傳密碼子的破譯。2）技術(shù)上的三大發(fā)明（1）利用限制酶和連接酶體外切割和連接DNA片段。（2）質(zhì)粒改造成載體以攜帶DNA片段克隆。（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的使用打開真核生物基因工程的一條通路。4.基因工程：對不同生物的遺傳物質(zhì)-基因，在體外進行剪切、組合和拼接，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后通過載體(質(zhì)粒、噬菌體、病毒等)轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細胞內(nèi)，進行無性繁殖，并使所需要的基因在細胞中表達，產(chǎn)生出人類所需要的產(chǎn)物或組建成新的生物類型。五個方面的工程技術(shù)系統(tǒng)（基因、細胞、酶、微生物發(fā)酵

3、、生化工程）是相互依賴、相輔相成的，但系統(tǒng)中基因工程占主導(dǎo)地位。5.基因工程研究內(nèi)容包括以下幾個主要步驟：（1）從現(xiàn)有的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等方法，獲得帶有目的基因的DNA片段。（2）在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成能夠自主復(fù)制的重組DNA分子。（3）將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適宜的受體細胞，并使其一起增殖。（4）從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞克隆。（5）由篩選出來的受體細胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進一步分析研究使用。（6）將分離到的目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入受體細胞，使之在新的遺傳背

4、景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。6.基因工程的四大要素：目的基因、工具酶、載體、受體。7.1976年6月23日，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）正式公布了“重組DNA研究的安全準(zhǔn)則”。 8.我國的基因工程相關(guān)法規(guī)：1990年制定基因工程產(chǎn)品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)；1993年發(fā)布基因工程安全管理辦法；1996年發(fā)布農(nóng)業(yè)生物基因工程安全管理實施辦法；2001年發(fā)布農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例 第二章 基因工程的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)1.操縱子：由幾個功能(gngnng)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因成簇排列而組成的一個基因表達的協(xié)同單位，稱為操縱子。如：調(diào)節(jié)(tioji)基因、啟動子、操縱基因、結(jié)構(gòu)(jigu)基因共同組成

5、一個操作子。 2.內(nèi)含子：是一個基因中非編碼DNA片段，它分開相鄰的外顯子。 3.外顯子：是一個基因中編碼蛋白序列。嚴(yán)格地說，外顯子是指保留在初級mRNA中不被剪切掉的區(qū)域，包括5非翻譯區(qū)(5UTR)、編碼序列和3非翻譯區(qū)(3 UTR)。 4.GT-AG法則：序列分析表明，幾乎每個內(nèi)含子5端起始的兩個堿基都是GT，3端最后兩個堿基總是AG，由于這兩個堿基的高度保守 性和存在的廣泛性，有人把它稱為GT-AG法則，即5 GT AG 3。 5.衛(wèi)星DNA：真核生物基因組中高度重復(fù)的DNA，有一些2030bp的極短序列，且以數(shù)千個拷貝的串連方式排列，這種序列稱為衛(wèi)星DNA。（在染色體DNA片段的氯化銫

6、密度梯度離心中，由于浮力密度的不同，這種重復(fù)序列在主帶DNA附近出現(xiàn)的衛(wèi)星帶，因此稱之為衛(wèi)星DNA。）6. Poly（A）尾巴在基因工程操作中的作用： A、用Poly（T）作為合成cDNA第一鏈的引物； B、用Poly（T）純化柱從總RNA中分離mRNA。7.可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化。 可阻遏調(diào)節(jié)是指基因平時都是開啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)和酶的工作過程中，但由于一些特殊代謝物或化合物的積累將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達，所以稱為可阻遏基因。8.基因工程操作中應(yīng)注意的真核生物與原核生物的差異基因結(jié)構(gòu)的差異啟動子和

7、RNA聚合酶的差異蛋白質(zhì)的翻譯后修飾加工（前體切割、二硫鍵、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、乙?；⒘蛩峄?、丙烯酸化、豆冠酸化、軟脂化）基因表達的調(diào)節(jié)（表達量）載體的差異蛋白質(zhì)的純化方便結(jié)構(gòu)基因是可以轉(zhuǎn)錄成為各種RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接行使功能，或者轉(zhuǎn)錄 成信使RNA(mRNA)然后翻譯成多肽鏈，最終形成各種功能蛋白質(zhì)和酶。 從廣義上講，任何一種能夠調(diào)節(jié)或限制其他基因活性的基因都可叫做調(diào)節(jié)基因，一般情況下則是指基因產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)別的基因活性的基因(如阻遏基因等)。首先轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后由mRNA翻譯成阻遏蛋白質(zhì)或激活蛋白質(zhì)，通常也稱為轉(zhuǎn)錄因子或反式作用因子。它們通常結(jié)合到

8、結(jié)構(gòu)基因的非編碼區(qū)的順式元件上起調(diào)控作用。 10.具有相同遺傳信息的個體細胞間其所利用的基因并不相同，有的基因活動是維持細胞基本代謝所必需的，而有的基因則在一些分化細胞或受到外界刺激的細胞中活動。前者稱為管家基因，如編碼核糖體蛋白、線粒體蛋白、糖酵解酶等的基因；而后者被稱為奢侈基因。11.假基因是多基因家族中的成員，因其堿基順序發(fā)生某些突變而失去功能，不能表達或表達異常，生成無生物活性的多肽。12.基因組是指一個生物體、細胞器或病毒的全部(qunb)基因。原核(yun h)生物基因組僅由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，含有一個復(fù)制起點，它的基因組就是(jish)它的整個染色體。但對于二倍體的高等

9、生物，能維持配子體正常功能的最低數(shù)目的一套染色體構(gòu)成的一個基因組。對于植物細胞而言，則有3個基因組，即染色體基因組(核基因組)、線粒體基因組和葉綠體基因組。13.堿抽提法提取質(zhì)粒DNA（1）原理DNA雙鏈在強堿條件下變性為DNA單鏈，而單鏈在中性條件下又可復(fù)性為雙鏈。閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復(fù)性快；染色體線性DNA和（或）有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。（2）所用試劑溶菌酶【在堿性條件（pH8）下有活性?！浚耗芩饩w細胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中 的-1，4糖苷鍵。 葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲

10、透壓，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。EDTA ：Mg2+、Ca 2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDSNaOH：強堿，提供pH12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。 SDS：溶解細胞膜蛋白和細胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA 酶）變性沉淀。 NaAc-HAc緩沖液（冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8）：用來中和NaOH變性液，使 DNA復(fù)性?！靖邼舛鹊腘aAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀?！恳掖迹河糜诔恋鞤NA。（DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán) 境。）RNase A ：降解R

11、NA，以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。TE緩沖液 ：DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制?！綯ris-HCl不含金屬離子（不同于 磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解?！糠?氯仿: 蛋白變性劑，進一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會殘留 在DNA溶液中。 （現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。14.計算DNA濃度：ssDNA：ssDNA=33（OD260OD310）稀釋倍數(shù)dsDNA：dsDNA=50（OD260OD310）稀釋倍數(shù)ssRNA：ssRNA=40（OD260OD310）稀釋倍數(shù)15.衡量提取DNA

12、的純度OD260/OD280 1.8 可能有RNA污染OD260/OD280 1.8 可能有蛋白質(zhì)污染16.帶電荷的分子在電場中會以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動，速度稱為電泳遷移率。17.瓊脂糖凝膠電泳的原理(yunl)：溴化乙錠（EB）是扁平分子(fnz)，能插入DNA堿基之間， 300nm紫外光照射(zhosh)下能發(fā)紅色熒光。與已知濃度的DNA電泳帶熒光強度對比，就可以估計出DNA含量。18.相同分子量的DNA： 閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開環(huán)狀最慢。19.瓊脂糖凝膠的分辨力：空隙大小決定其分辨分子大小的能力?？障缎?，分辨率高：小分子較易通過，而大分子難通過

13、； 空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。20.影響DNA瓊脂糖凝膠電泳遷移率的因素有哪些？（1）DNA分子的大小。（2）DNA的構(gòu)象。（3）瓊脂糖濃度。（4）溴化乙錠使DNA遷移率下降15%。（5）電壓。（6）電泳緩沖液的成分及濃度。21.聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。（瓊脂糖凝膠電泳：分離30050000bp；聚丙烯酰胺凝膠電泳：分離11000bp）22.核酸的分子雜交：Southern blot-用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。Northern blot-用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。原位雜交-對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性

14、菌落。23.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)是利用酶促反應(yīng)在體外指導(dǎo)特定DNA序列擴增的方法，以熱變性的雙鏈DNA分子為模板，利用引物和四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）為原料在DNA聚合酶的作用下大量擴增了特定的DNA片段。 1986年 H.A. Erilish從嗜熱水生菌分離出耐高溫的Taq DNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段（37)，PCR技術(shù)才進入實用階段。1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反應(yīng)中，使PCR自動循環(huán)儀成為可能。PCR技術(shù)的原理：模板DNA變性引物DNA復(fù)性引物DNA延伸引物：人工合

15、成的單鏈DNA小片段，堿基順序分別與所要擴增的模板DNA雙鏈的5端相同。引物為什么優(yōu)先與模板互補配對？（濃度高，配對序列短）PCR的特點：（1）特異性強 （2）敏感性高 （3）快速(kui s) （4）簡便(jinbin) （5）可以(ky)擴增mRNA Taq DNA聚合酶的特點：（1）熱穩(wěn)定性，最適溫度高（為75-80）；（2）具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但沒有35外切酶活性；（因此不能修復(fù)錯誤的堿基配對！）（3）Taq的PCR產(chǎn)物3端往往帶有一個A；（4）Taq DNA聚合酶的激活劑，金屬離子敏感（尤其是Mg2+）。 Pfu DNA Polymerase：有3 5的外切酶活性，5

16、 3外切酶活性。是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA 聚合酶中出錯率最低的。但PCR產(chǎn)物為平端！ 影響 PCR的因素：（1）DNA聚合酶活性 （2）引物（3）模板（純度、模板的量）（4）dNTPs（5）Mg 2+ 的濃度引物設(shè)計應(yīng)注意的問題有：1）引物的位置：與待擴增的模板DNA區(qū)段的兩3端序列互補（5端相同）；2）引物的長度：一般引物設(shè)計為長1530bp；3）盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力，堿基隨機分布,一般G+C%含量宜在45-55%左右；4）避免形成引物二聚體；5）避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列；6）3端堿基最好選T,C,G而不選A,這樣有利于延伸；7）3端必須與模板正確配

17、對，5端可以不配對，5端根據(jù)需要可設(shè)計成某個內(nèi)切酶的切點順序、RNA聚合酶識別序列、突變位點或生物素標(biāo)記等，方便于以后操作。注引物的Tm值手工計算：Tm=（G+C)4 + (A+T)2標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 100ul 25ul1. 引物 各0.1umol2. 4種dNTP 各200umol/L3. 10 buffer 10ul 2.5ul4. 模板DNA 0.12ug 0.0250.5ug5. Taq酶 2.5u 0.625u6. Mg2+ 1.5mmol/L7. ddH2O 加至100ul 加至25ul如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。需要合成多

18、種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物。套嵌引物：設(shè)計多組引物，結(jié)合位點依次位于前一組引物之間。增加擴增產(chǎn)物的特異性。PCR技術(shù)的延伸技術(shù)：熒光實時定量PCR 【Realtime PCR（或TaqMan PCR）】 借助于熒光(ynggung)信號來檢測(jin c)PCR產(chǎn)物(chnw)。可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，準(zhǔn)確地確定Ct值，從而根據(jù)Ct值確定起始DNA的拷貝數(shù)，做到真正意義上的DNA定量。 Ct值：樣品到達閾值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 （2）反向PCR 擴增兩個引物外側(cè)的未知序列。技術(shù)關(guān)鍵：把線性DNA模板轉(zhuǎn)變成環(huán)形分子。（3

19、）不對稱PCR 用于擴增單鏈DNA，單鏈DNA更適于測序。技術(shù)關(guān)鍵：兩個引物的濃度相差100倍。（4）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR) 擴增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。 技術(shù)關(guān)鍵：利用反轉(zhuǎn)錄酶，把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。（5）巢式PCR（Nest-PCR）（6）原位PCR(in-situ PCR)（7）錨定PCR（anchored PCR）定義：擴增已知序列側(cè)翼未知序列的一種PCR方法，未知的3端添加一同聚物尾（polyG），以互補的同聚物引物（polyC）和按已知序列設(shè)計的引物一起作PCR擴增。關(guān)鍵：利用末端轉(zhuǎn)移酶在未知一端創(chuàng)造引物結(jié)合位點。（8）長片段

20、PCR（ Long PCR）（9）多重PCR（ multiplex PCR）定義：又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)。 （10）RAPD【隨機擴增多態(tài)性DNA (Random amplification polymorphism DNA, 簡稱RAPD標(biāo)記)】定義：用一個（有時用兩個）隨機引物（一般6-10個堿基）非定點地擴增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴增片段。AFLP【擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism, 簡稱AFLP 標(biāo)記）】（12）RFLP【限制

21、性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism, 簡稱RFLP 標(biāo)記）】（13） SSR簡單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat, 簡稱SSR標(biāo)記）微衛(wèi)星序列重復(fù)，是由一類由幾個核苷酸（15個）為重復(fù)單位組成的長達幾十個核苷酸的重復(fù)序列，長度較短，廣泛分布在染色體上。 （14）ISSRISSR（inter-simple sequence repeat）重復(fù)序列的間隔序列的擴增（15） SSCP分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single-Strand Conformation Polymorphism)PCR技術(shù)的應(yīng)用：（1）擴

22、增某一段DNA （2）基因(jyn)的體外誘變（3）基因組的比較(bjio)研究 24.雙脫氧(tu yng)鏈終止法原理：（1）DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按堿基配對的原則進行的。 （2）脫氧核糖的連接是以35磷酸二酯鍵。 （3）復(fù)制反應(yīng)可以在體外進行。 （4）2和3雙脫氧的ddNTP會使復(fù)制反應(yīng)終止。 （5）各堿基隨機終止產(chǎn)生所有不同長度的產(chǎn)物。（6）根據(jù)電泳條帶的先后次序，讀出合成鏈堿基序列，互補配對推出模板鏈堿基序列。技術(shù)要點：（1）制備單鏈DNA模板（2）特殊的DNA多聚酶不能有53和35的外切酶活性；與模板的親和力高，不會提前脫離模板。（3）制備2和3雙脫氧的ddNTP（dNTP

23、/ ddNTP = 100 / 1）（4）制備一小段單鏈引物（DNA或RNA）注化學(xué)裂解法讀出的序列就是要測的序列。Sanger測序法讀出的序列是新合成的互補鏈序列。第三章 基因工程的工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶1.定義：一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（48bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。2.限制作用：指一定類型的細菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。這是維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。修飾作用：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。這是宿主細胞識別自身遺傳物

24、質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的作用機制。3.類型：I 型、II型、III型4. II型限制性內(nèi)切酶（分離的第一個酶是Hind ）（1）識別位點序列: 未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。與 DNA的來源無關(guān)。（2）切割位點: 識別位點處。（3）同裂酶：識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。 完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。 不完全同裂酶：識別位點相同，但切點不同。（4）同尾酶：識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。注：同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。（5）如果改變反應(yīng)條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（*）活性。EcoR I和BamH I等都

25、有*活性。（6）s型限制性內(nèi)切酶移動切割：s型限制與修飾系統(tǒng)，與型具有相似的輔因子要求，但識別位點是非對稱，也是非間斷的(不是從識別位點序列中間斷裂），長度為 4-7bp ，切割位點可能在識別位點一側(cè)的20bp范圍內(nèi)。在離它的不對稱識別位點一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。應(yīng)用(yngyng)：基因表達系列分析(fnx)技術(shù)(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)是以DNA序列測定為基礎(chǔ)分析全基因組表達(biod)模式的技術(shù)。任何長度超過9-10個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此，根據(jù)某個序列占總標(biāo)簽數(shù)的比例可分析所對應(yīng)基因的表達頻

26、率。5.命名：（1）用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。（2）用一個右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoR I）。（3）如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoR I，EcoR V。（4）限制酶前面要帶上R（Restriction)， 修飾酶前面要帶上M（Modification）。（現(xiàn)已省略）。6.識別序列的長短與切割頻率：識別序列越長，切割頻率越小（越短，越大）7.相鄰序列效應(yīng)：大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶對只含識別序列的寡核苷酸是不具催化活性。 位點偏愛：不僅側(cè)翼序列長短與限制性核

27、酸內(nèi)切酶的切割效率有關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)側(cè)翼序列的核苷酸組成與切割效率也有關(guān)系。8.影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1）DNA的純度 2）DNA的甲基化程度 3）溫度（大多數(shù)是37 ，少數(shù)要求40-65 ）4）緩沖液 9.完全消化：內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。局部消化：只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。（通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。）10. 幾種常用限制酶識別位點：二、DNA連接酶1.兩種DNA連接酶：（1）大腸桿菌連接酶（只能連接粘性末端）（2）T4噬菌體的連接酶（不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端）2.連接條件：（1）必須是兩條雙鏈DNA；（2）DNA 3

28、端有游離(yul)的-OH，5端有一個磷酸(ln sun)基團（P）；（3）需要(xyo)能量：動物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中：NAD+3.影響連接反應(yīng)的因素：1）插入片段與載體的濃度比例 插入片段濃度高，至少21。增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。2）反應(yīng)溫度（一般1416）三、DNA聚合酶1.常用的DNA聚合酶的共同特點：把dNTPs連續(xù)地加到引物的3OH端。A、都以dNTP為底物。B、都需要Mg2+激活。C、聚合時必須有模板鏈和具有3-OH末端的引物鏈。D、鏈的延伸方向都為53。主要區(qū)別：持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。2.用枯草桿菌蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶I

29、 可以切掉N端的53外切酶活性部分，就成為Klenow fragment。3.切口平移法：DNA聚合酶I 同時具備53外切酶活性和53的聚合酶活性（以及35外切酶活性）。53外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在切口的上一段DNA的3一側(cè)補上一個新的核苷酸。4.放射性標(biāo)記的優(yōu)點：制作簡單、高比放射性、放射自顯影效果好。 缺點：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、對人體有害、要求在專門 實驗室操作。5.地高辛的識別抗地高辛抗體，生物素的識別親和素6.常用的兩種偶聯(lián)酶：辣根過氧化物酶（HRPO）、堿性磷酸酶（AP）作用：催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程中發(fā)

30、出熒光（或生成有色的產(chǎn)物）。7.用非放射性標(biāo)記的探針檢測原理：探針DNA用生物素或地高辛標(biāo)記。親和素或地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個發(fā)光或顯色反應(yīng)。親和素或地高辛抗體與生物素或地高辛結(jié)合。四、DNA修飾酶（一）末端(m dun)脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的特性： 需要(xyo)3OH、二甲(r ji)胂酸緩沖液； 不需要模板； 底物可以是單鏈DNA、3OH突出的雙鏈DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以； 隨機添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。T4多核苷酸激酶的功能：催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5-OH 端。不論5-OH端突出與否。（三）堿性磷酸酶1.種類

31、：細菌性堿性磷酸酶（BAP）：從大腸桿菌中分離出來，具有抗熱性。 小牛腸堿性磷酸酶（CIP）：從小牛腸中純化出來，SDS中加熱68可完全失活。2.特性：催化脫掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。3.功能：防止線性化的載體份子自我連接（四）S1核酸酶1.特性：（1）高度單鏈特異性（2）反應(yīng)條件： 低水平Zn2+ pH4.04.32.功能：（1）催化單鏈RNA或DNA降解。（2）切掉雙鏈核酸中的單鏈區(qū)。（3）降解限制酶切形成的單鏈突出端。（4）不能降解雙鏈DNA或RNA-DNA雜交鏈?；蚬こ梯d體質(zhì)粒載體的容量相對較小，受轉(zhuǎn)化率、拷貝數(shù)的影響。M13噬菌體包裝DNA分子的能力可達其DNA長度的6倍。

32、6407bp*6噬菌粒能插入10kb的外源DNA。載體的最大克隆容量是23kb。（實際上為15kb）柯斯質(zhì)粒45kb。（最少不能低于30kb）細菌人工染色體克隆容量可達300kb。載體的定義 廣義上通常把能攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具叫載體。在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫載體?；蚬こ虒d體的要求（1）具有對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性，可提高載體導(dǎo)入受體細胞的效率。（2）具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制原點或整合位點，使得外源基因可在受體細胞中大量繁殖或穩(wěn)定遺傳。（3）具有多種單一的核酸酶切位點(多克隆位點)，可用于外源基因的插入，同時不影響載體的擴增和繁殖。（4）

33、具有合適的選擇標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測。（5）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移，避免基因的非控制性擴散，給人類造成危害。載體的種類1）按來源基因工程中常用的載體有5類：質(zhì)粒、單鏈DNA噬菌體M13、噬菌體的衍生物、柯斯質(zhì)粒、動物病毒 2）按功能分：克隆載體-克隆一個基因或DNA片段 表達載體-用于一個基因(jyn)的蛋白表達 整合(zhn h)載體-把一個基因插入到染色體組中一、質(zhì)粒載體(zit)1.質(zhì)粒：是獨立于染色體以外能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。2.氯化銫密度梯度離心結(jié)果自上而下依次為：蛋白質(zhì)、ocDNA/L-DNA、cccDNA、RNAs3.質(zhì)粒的類型：1）依據(jù)質(zhì)粒自身傳遞

34、的性質(zhì)分類在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：接合型質(zhì)粒-能自我轉(zhuǎn)移 非接合型質(zhì)粒-不能自我轉(zhuǎn)移2）依據(jù)可否引起宿主細胞出現(xiàn)新性狀分類顯性質(zhì)粒：宿主細胞由于含有質(zhì)粒而獲得新性狀隱蔽質(zhì)粒：宿主細胞含有此類質(zhì)粒而無異樣性狀3）依據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制特性分類A. 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。B. 松弛型質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。4.質(zhì)粒的不親和性：能同寓于一細胞中的不同質(zhì)粒稱為親和性質(zhì)粒。不能同寓于一細胞中的不同質(zhì)粒稱為不親和性質(zhì)?；虿幌嗳菪再|(zhì)粒。親緣關(guān)系密切的質(zhì)粒一般屬于不親和性質(zhì)粒，如野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒往往屬于不親和性質(zhì)粒。 5.第一個用于基

35、因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長9.1 kb。6.人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體（3）失控的質(zhì)粒載體（4）插入失活型質(zhì)粒載體（5）正選擇的質(zhì)粒載體（6）表達型質(zhì)粒載體7.利用質(zhì)粒載體將真核生物基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進行表達,該質(zhì)粒載體應(yīng)具備哪些元件?1）普通載體元件：復(fù)制起始點ORI、選擇標(biāo)記、 多克隆位點MCS2）大腸桿菌操縱子元件：阻遏基因I、操縱基因O、啟動基因P、核糖體結(jié)合位點序列（SD）、 轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)8. pBR322：F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。9.藍白斑選擇原理：1） Xgal2） -半乳糖苷酶Xg

36、al顯色反應(yīng)：-半乳糖苷酶能把無色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一個深藍色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍。3） lacZ的肽互補 -肽（ lacZ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段（11-41氨基酸）。 lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能。 受體菌lacZ突變 受體菌基因組的-半乳糖苷酶基因的氨基(nj)端有缺失（缺失肽）， 不能形成(xngchng)4聚體的活性酶，不能分解Xgal 。 載體(zit)lacZ與互補pUC質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼肽與這個缺失突變的-半乳糖苷酶“互補”，使它能形成4聚體。又能分解Xgal。產(chǎn)生藍色物質(zhì)。 互補的插入失活pUC載體上LacZ的5端有一段多克隆

37、位點(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ的合成。不能互補。4） IPTG的誘導(dǎo)作用IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ 的C端部分和載體的lacZ肽都表達。從而互補。但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生肽！IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：MCS無插入時，互補，藍菌斑；MCS有插入時，不互補，白菌斑。穿梭質(zhì)粒載體：人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。TA克隆載體：研制出的一種線形質(zhì)粒，其3端各帶一個不配對脫氧胸腺嘧啶核苷（T），采用該質(zhì)粒可將PCR產(chǎn)物以TA連接的方

38、式直接進行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的載體被稱為TA克隆載體。（原理：Taq酶特點）質(zhì)粒載體增加寄主新陳代謝負(fù)荷：復(fù)制負(fù)荷轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷 （使寄主細胞生長減緩；丟失質(zhì)粒的細胞反而會成為優(yōu)勢群體。）原噬菌體：整合到細菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細 菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。M13噬菌體沒有包裝限制：M13噬菌體包裝DNA分子的能力可達M13DNA長度的6倍。6407bp*6噬菌粒載體：由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點結(jié)合而成的新型載體系列。16.噬菌體展示：將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達于噬菌體的外表面。17.cos位點：DN

39、A兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點。18.pBluescript SK/KS（+/-）區(qū)分：SK：表示lacZ的轉(zhuǎn)錄方向是沿MCS上的 SacI KpnI KS：反向（ KpnI SacI ，MCS相反）+（f1+）：單鏈復(fù)制起始方向背離lacZ，能回收lacZ的編碼鏈（+）-（f1-）：能回收lacZ的非編碼鏈（-）19.噬菌粒載體的包裝：輔助噬菌體：自身的復(fù)制起點發(fā)生了突變，復(fù)制效率低下，但感染細菌后能表達出外殼蛋白和復(fù)制蛋白，幫助噬菌粒載體復(fù)制。噬菌體包裝：外殼蛋白和復(fù)制蛋白輔助噬菌體ssDNA噬菌粒載體載體(zit)的體外包裝（1）定義(dngy)：在試

40、管中與噬菌體的頭部和尾部(wi b)蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細菌，把重組DNA注入受體菌中。（2）噬菌體外殼蛋白的合成E 基因：的E基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的70%）。D基因：的D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與 DNA 進入頭部和頭部的成熟有關(guān)（只占20%）。注噬菌體體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的75%-105%（3651kb）之間。21.cosmid載體（粘粒）1）組成： DNA：cos序列和控制包裝的序列。pBR322：質(zhì)粒的復(fù)制子；抗藥性基因；幾個限制性酶的單一位點。2）特點：具有噬菌體的特性：在寄主細胞內(nèi)形成環(huán)化DNA（但不能形成新的噬菌體

41、顆粒而溶菌）?？寺⊥庠碊NA后可以體外包裝成噬菌體顆粒。具有質(zhì)粒載體的特性：大多帶有pMB1或ColE1的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。方便的選擇：有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點。高容量的克隆能力：45kb（最少不能低于30kb）。3）應(yīng)用cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)，叫“柯斯克隆”（cosmid cloning）。理論依據(jù)：cos位點：包裝識別。“多聯(lián)體”復(fù)制：噬菌體的生命周期中，會產(chǎn)生數(shù)百個DNA通過cos位點連接的“多聯(lián)體”分子。Ter體系：在包裝的時候，噬菌體具有位點特異的末端酶體系（Ter體系），識別cos位點，把多聯(lián)體切成單個DNA長度。包裝限制

42、：兩個cos位點之間，必須保持3845kb的DNA，Ter體系才能識別。野生型 噬菌體DNA的75105。22.酵母人工染色體（YAC）的特點：（1）只能在酵母細胞中擴增。（2）克隆容量大，為230kb-1700kb。（3）構(gòu)建原理，按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。YAC的組成結(jié)構(gòu)：（1）著絲粒區(qū)（CEN）（2）端粒（TEL）（3）復(fù)制起點（ORI）（4）克隆位點（5）在酵母中的標(biāo)記基因（6）在細菌中操作的復(fù)制起點ori和抗生素標(biāo)記Ampr 23.染色體復(fù)制和遺傳的三個基本(jbn)組件：DNA復(fù)制(fzh)起始點（ori）、著絲粒（cen）、兩個(lin )端粒（tel）24.F質(zhì)粒的特點：（1）單拷貝復(fù)

43、制。（2）克隆容量可達300kb。（3）比較穩(wěn)定。 （4）便于提純。目的基因的獲取目的基因：準(zhǔn)備要分離、改造、擴增或表達的基因1.關(guān)于亞磷酸三酯法：化學(xué)合成的方向：35；核苷酸單體的磷酸基團在3端；亞磷酸三酯法的磷為3價磷，需要氧化。2.寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點：1）直接合成基因：mRNA的含量很低，很難作cDNA 有些基因比較短，化學(xué)合成費用較低2）合成引物（20mer左右）3）合成探針序列4）定點突變合成5）合成人工接頭或銜接物6）合成DNA芯片3.銜接物：用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點序列的平端雙鏈。人工接頭：用化學(xué)合成法合成的一段不等長雙鏈DNA序列，一

44、頭平末端、另一頭粘性末端（為某種酶切所產(chǎn)生的粘性末端）。4.基因文庫：將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片段，并將所有這些片段都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細胞中保存和擴增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。5.基因組文庫的大?。阂粋€文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln (1-p)ln (1-f )P：文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）F：插入載體的DNA片段的平均長度占整個基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）文庫的查詢：用目的基因探針與文庫中的重組載體進行Southern blot雜交。6.cDNA：

45、以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA。cDNA library：利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。7.cDNA文庫的特點：（1）不含內(nèi)含子序列。 （2）可以(ky)在細菌中直接表達。 （3）包含了所有編碼(bin m)蛋白質(zhì)的基因。 （4）比DNA文庫(wnk)小的多，容易構(gòu)建。cDNA文庫的大?。阂粋€cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln (1-p)ln (1-1/n)P：文庫包含了完整mRNA的概率（99%）1/n：某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例N：所需的重組載

46、體數(shù)（克隆數(shù)）8.cDNA的合成： cDNA第一鏈合成 逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用Oligo dT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。 降解mRNA模板 用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。 cDNA第二鏈合成 剩下的cDNA單鏈的3末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。 去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu) 用核酸酶S1可切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（會導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉）。9.妙用RNaseH 這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片段。小片段正好成為DNA

47、聚合酶的引物，用來合成岡崎片段。 DNA Pol I除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。10. mRNA消解雜交原理：羥基磷灰石柱結(jié)合DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。 從表達A蛋白和不表達A蛋白的組織細胞中分別提取和分離總mRNA。 將表達A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。 不能雜交的cDNA就包括特異表達的A基因的cDNA單鏈。 用羥基磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進行擴增、克隆、測序。11. mRNA差異顯示PCR（DD RT-PCR）（1）3端的錨定引物 Oligo(dT)引物

48、的3端加兩個核苷酸（倒數(shù)第二個不再是T）。（2）12種錨定引物（3）5端的隨機引物（4）隨機引物與錨定引物成對擴增（5）隨機-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較 不同(b tn)組織的240組引物組合(zh)PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。選擇(xunz)有差異的帶，進一步PCR作探針。篩選文庫，找到差別基因的全長序列。12.cDNA差示分析法：1）cDNA模板制備；2）用DpnSau 3A分別消化兩組cDNA，再接上接頭R，經(jīng)補平末端后作為下一步PCR擴增的模板；3）加入根據(jù)R設(shè)計的一對引物，利用PCR技術(shù)使兩組的cDNA片段得以富集后，再用DpnSau 3A去除cDNA兩端的R；4）消減雜交。將上一步

49、獲得的tester的cDNA接上新的接頭J，按tester:driver為1：100的 比例混合兩組cDNA，在一定的反應(yīng)體系中解鏈并進行充分的雜交反應(yīng)，這樣便有3種 形式的雜交體形成，即A driver：driverB driver：testerC tester：tester；5）利用PCR反應(yīng)使tester的特異基因得以富集。A不能擴增、B線性擴增、C 指數(shù)擴增。13.盒式PCR（Cassette PCR）是利用Cassette(人工合成的帶有適當(dāng)限制性內(nèi)切酶粘末端較長的雙鏈DNA分子)和Cassette上的引物，特異性擴增目的基因組DNA未知區(qū)域的一種有效的方法。 14.RACE技術(shù) R

50、ACE（Rapid Amplification of cDNA ends）是一種通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA 第一條鏈后用PCR技術(shù)擴增出某個特異位點到3或5之間的未知序列的方法,分別稱為3-RACE或 5-RACE。錨定(Anchored PCR)和反向PCR都可以用于RACE技術(shù)，經(jīng)典RACE就是基于錨定PCR技術(shù)原理設(shè)計的，而高特異性的RACE是借助于反向PCR技術(shù)。15.轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法 轉(zhuǎn)座子是一類可以在同一條染色體不同位點或不同染色體間轉(zhuǎn)移的一段特殊的DNA。 圖位克隆法：根據(jù)目的基因在基因組上的位置特性而不是其編碼產(chǎn)物來進行基因克隆。1

51、7.染色體步移：利用與目的基因緊密連鎖的標(biāo)記DNA片段為探針篩選基因組文庫，用已獲得的陽性克隆的DNA片段的末端DNA為探針繼續(xù)篩選，如此進行下去，直到獲得含目的基因兩側(cè)序列為止。18.染色體步移往往因為得不到重疊克隆而被打斷造成前功盡棄或因為基因組的復(fù)雜性高而遇到重復(fù)序列改變步移方向誤入歧途。如能找到與目的基因的物理距離小于基因組文庫的平均插入片段的長度的緊密連鎖的分子標(biāo)記，就可以通過篩庫直接獲得含目的基因的大片段克隆，接著從中分離出目的基因。這樣就完全避開了步移，這種方法稱為染色體登陸。 19.酵母雙雜交系統(tǒng)1）作用：有效地分離能與一種已知的靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)2）原理：結(jié)構(gòu)域（Doma

52、in）合作： 許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個在結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上也相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成。例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4；實驗發(fā)現(xiàn)-只要DNA binding domain（DNA-BD）與Active domain（AD）靠近就能夠表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活活性。拆開(chi ki) Domain：用重組(zhn z)DNA技術(shù)(jsh)把GAL4的兩個Domain分開，就喪失了激活效應(yīng)基因的能力。重組Domain： 用重組DNA技術(shù)把這兩個Domain分別與兩個不同的多肽連接。觀察報告基因表達：通過效應(yīng)基因是否被激活來檢查：在體內(nèi)，蛋白A與蛋白B是否能結(jié)合。.如果蛋白A與蛋白

53、B不能相互結(jié)合 GAL4的DB domain與AD Domain也不能靠近，所以仍然不能啟動效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。.如果蛋白A與蛋白B能相互結(jié)合GAL4的DB domain與AD Domain也能靠近，所以能啟動效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄?；虻闹亟M與轉(zhuǎn)移外源DNA載體DNA重組分子原核細胞真核細胞擴增或表達表達連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細胞一、齊平末端的連接1. 直接連接 5端與3端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接；T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的10%。2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法 原理：DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3-OH端

54、加上脫氧核苷酸。加尾堿基互補：分別給載體和插入片段加上互補的核苷酸。（2）銜接物(linker)連接 linker：用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點序列的平端雙鏈。 linker的作用：用T4 DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個人工粘性末端。（3）DNA接頭 (adapter)連接法 adapter：一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）。 adapter的作用：用T4DNA連接酶連到平端DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。二、PCR產(chǎn)物(chnw)的連接1. 在引物的5端設(shè)計(shj)酶切位點（1）設(shè)計原則：符合載體的多克隆位點；避

55、免(bmin)與所擴增的DNA片段內(nèi)部酶切位點重復(fù)。（2）帶酶切位點的引物的結(jié)構(gòu)：3端1520bp與模板互補； 5端610bp是某個內(nèi)切酶的識別序列。（5端多余的35bp起保護堿基作用）2. 與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個3端一般都有一個A（2）平末端載體兩個3端各加一個T三、DNA體外連接應(yīng)注意的事項1.插入片段與載體的酶切位點互補相同的粘性末端才能有效地連接；盡量避免平端連接；決不能進行非粘性末端連接。2. DNA插入的方向正確用雙酶切：由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。3. 插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼：尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼

56、的時候，更要注意。4. 防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片段的用量 （2）用堿性磷酸酶處理載體四、感受態(tài)大腸桿菌的制備1.目的：增加受體菌細胞膜的通透性。2.菌種：使用喪失了限制體系的大腸桿菌。3.制備原理：用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。4.制備過程（了解）五、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌1.外源DNA導(dǎo)入細菌的幾種方法：（1）轉(zhuǎn)化（transformation）：大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection）：大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）：借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細菌的過程。2.轉(zhuǎn)化率：每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細菌克隆數(shù)

57、。 3.轉(zhuǎn)化方法：（1）熱休克法：簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（2）電轉(zhuǎn)化法：轉(zhuǎn)化效率高六、感受態(tài)細胞 （1）生長狀態(tài)：制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。（2）必須在冰冷的條件下制備。（3）CaCl2處理：要充分，使細菌細胞膜失去一些蛋白。（4）儲存感受態(tài)菌要在-70以下。（5）使用感受態(tài)菌時必須梯度融化。（融化后一般不能再次凍存使用）七、cI857基因突變的噬菌體 cI857基因是個溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細菌后，在32下培養(yǎng)細菌時能夠保持溶源性。 但當(dāng)溫度升高到4445時，就會導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。 但由于(yuy)該噬菌體的S基因上有一

58、個(y )突變，所以細菌還不裂解。 S和R是控制寄主細菌發(fā)生(fshng)溶菌作用的兩個基因，故稱溶菌基因。 八、互補型噬菌體 在cI857基因突變的噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。 噬菌體1：外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。 噬菌體2：外殼蛋白基因D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。九、導(dǎo)入植物細胞1.葉盤法 2.電擊法 3.基因槍法十、導(dǎo)入哺乳動物細胞1.磷酸鈣沉淀法 2.脂質(zhì)體載體法 3.顯微注射法4. DEAE葡萄糖轉(zhuǎn)染法 5.病毒介導(dǎo)重組體克隆的篩選和鑒定一、pBR32

59、2抗菌素標(biāo)記選擇1.四環(huán)素：抑制細菌生長，但不殺死細菌。2.氨芐青霉素抗性基因：產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（藍灰色）褪色。3.環(huán)絲氨酸：殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌。 注：如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸 平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。二、-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點。受體菌基因組中有突變的-半乳糖

60、苷酶基因（ 片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達。載體和受體菌基因組可以互補形成完整有功能的-半乳糖苷酶。三、根據(jù)插入基因的表型選擇1.彌補缺陷 2.增加新性狀四、DNA電泳檢測法 1.直接電泳檢測法 2.酶切電泳篩選法五、PCR擴增檢測法1.原理：PCR能在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片段。2.過程：（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片段引物作PCR。（3）電泳PCR產(chǎn)物。（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物的長度是否(sh fu)與外源基因一致。六、核酸(h sun)雜交檢測法 1. Southern blotting 2. Northern blottin