分子流行病學(xué)進(jìn)展與其在疾病預(yù)防控制中的實(shí)際應(yīng)用

1、分子流行病學(xué)進(jìn)展與其在疾病預(yù)防控制中的實(shí)際應(yīng)用Molecular Epidemiology and its Application in Disease Prevention & Control分子流行病學(xué)的定義（Molecular Epidemiology）分子流行病學(xué)是闡明疾病和健康狀態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志（或分子事件）在人群和生物群體中的分布及其影響因素，并研究防制疾病、促進(jìn)健康的策略與措施的科學(xué)。應(yīng)用先進(jìn)的技術(shù)測(cè)量生物學(xué)標(biāo)志的分布情況，結(jié)合流行病學(xué)現(xiàn)場(chǎng)研究方法，從分子或基因水平闡明疾病的病因及其相關(guān)的致病過程。Cancer傳統(tǒng)流行病學(xué)（宏觀、群體）Exposure傳統(tǒng)流行病學(xué)和分子流行病學(xué) ？

2、分子流行病學(xué)傳統(tǒng)流行病學(xué)分子流行病學(xué)傳統(tǒng)流行病學(xué)與分子流行病學(xué)的關(guān)系（EDC模型）（Schulte,1993）暴露疾病暴露疾病 ？ 前瞻性研究回顧性研究Medical Practice etiology diagnosis treatment prevention分子流行病學(xué)？Gene discovery &CharacterizationSNPsHaplotypesHuman Genome ProjectHapMap Project 分子流行病學(xué)的特點(diǎn) 與傳統(tǒng)流行病學(xué)不同 研究的水平不同 所解決的問題不同 與分子生物學(xué)的區(qū)別 研究對(duì)象不同（人群） 研究?jī)?nèi)容和方向不同（強(qiáng)調(diào)與宏觀暴露的關(guān)系）

3、研究方法不同（流行病學(xué)思維和方法）宏觀與微觀相結(jié)合！ 分支 腫瘤分子流行病學(xué) 傳染病分子流行病學(xué) 分子流行病學(xué)的發(fā)展趨勢(shì) 研究手段越來越多,技術(shù)越來越成熟研究?jī)?nèi)容(生物標(biāo)志物)越來越豐富應(yīng)用范圍越來越廣（病因、危險(xiǎn)度評(píng)估、早期診斷、個(gè)體化治療） 生物標(biāo)志（biological markers, biomarkers）是可以測(cè)量的、能代表生物結(jié)構(gòu)和功能的大分子物質(zhì)，如DNA、RNA (miRNA)或抗原、抗體、蛋白質(zhì)（酶）等。分子流行病學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容：生物標(biāo)志一、暴露標(biāo)志（exposure marker）（一）外暴露標(biāo)志主要指環(huán)境因素暴露，包括生物性因素和非生物性因素1、生物性病原因子的鑒定2

4、、病原生物進(jìn)化變異規(guī)律（進(jìn)化樹）3、環(huán)境化學(xué)污染物（非生物因素）暴露（二）內(nèi)暴露標(biāo)志1、傳染性疾?。?感染狀況、抗原抗體檢測(cè)、病原體基因監(jiān)測(cè)2、慢性非傳染性疾病 內(nèi)暴露劑量、 生物效應(yīng)劑量?jī)?nèi)暴露劑量包括對(duì)化學(xué)毒物、飲食中的營(yíng)養(yǎng)素和可能致癌劑以及微生物感染的測(cè)定。例如：吸煙 - 血或尿中的煙草代謝產(chǎn)物可替寧濃度（Cotinine）多環(huán)芳烴 - 尿中的1- 羥基芘水平飲食暴露- 黃曲霉毒素B1(AFB1)和尿中N-亞硝基化合物（ N - nitroso compounds）的濃度、血液中營(yíng)養(yǎng)素水平工作暴露和環(huán)境污染 - 血清或脂肪組織中的殺蟲劑DDT（dichloro-diphenyl-trich

5、loroethane）、多氯聯(lián)苯PCBs（polychlorinated biphenyl）、二氧雜芑（Dioxins）環(huán)氧化物含量吸煙和環(huán)境污染 - 尿中的致突變因子（mutagenicity）的測(cè)定。體內(nèi)劑量標(biāo)志可替嚀（Cotinine）香煙中的尼古丁體液鉛環(huán)境中的鉛體液和組織（發(fā)、指甲、牙齒）二氯二苯二氯乙烯二氯二苯三氯乙烷脂肪組織黃曲霉素食物原料體液生物學(xué)標(biāo)志環(huán)境暴露物質(zhì)生物材料1-羥基芘 尿液多環(huán)芳烴(PAHs)生物有效劑量標(biāo)志DNA加合物 苯并（a）芘、亞硝胺 白細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志環(huán)境暴露物質(zhì)生物材料蛋白質(zhì)加合物（血紅蛋白） 環(huán)氧乙烯 紅細(xì)胞二、效應(yīng)標(biāo)志（effect marker）傳

6、染病 酶學(xué)的改變，血液生化（免疫）指標(biāo)的變化 病原體基因的整合慢性非傳染性疾?。ㄎｋU(xiǎn)性預(yù)測(cè)） 主要是基因毒性標(biāo)志物，包括癌基因激活、點(diǎn)突變和染色體異常 基因表達(dá)異常和代謝異常 基因突變或染色體畸變 生物學(xué)效應(yīng)標(biāo)志染色體誘變化學(xué)物畸變白細(xì)胞姊妹染色體單體交換白細(xì)胞微核（micronuci）上皮點(diǎn)突變誘變化學(xué)物HGPRT*白細(xì)胞胸苷激酶白細(xì)胞癌基因激活 化學(xué)致癌原苯并（a）芘組織原嘌呤比例升高鉛紅細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志環(huán)境暴露物質(zhì)生物材料乙酰膽堿脂酶降低有機(jī)磷殺蟲劑 血漿三、易感性標(biāo)志（環(huán)境-基因）（一）遺傳性疾病 HNPCC, BRCA1/2（二）慢性?。ㄒ赘行苑肿訕?biāo)志物） DNA修復(fù)通路（肺癌、腸癌）

7、 代謝酶系統(tǒng)（膀胱癌）（三）傳染病 免疫系統(tǒng)（HLA） 炎癥通路 1抗胰蛋白酶 吸煙肺氣腫N-乙?；D(zhuǎn)移酶 芳香胺膀胱癌生物學(xué)標(biāo)志*暴露 疾病芳香烴羥化酶 吸煙 肺癌宿主易感性標(biāo)志（非傳染病）傳染病慢性丙肝病人中，HLA-B44出現(xiàn)頻率高達(dá)30%以上對(duì)白喉毒素敏感的基因定位在5號(hào)染色體長(zhǎng)臂對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒敏感性基因定位在19號(hào)染色體長(zhǎng)臂What is a SNP? 基因多態(tài)性A mutation in the DNA sequence with a frequency of 1%遺傳性多態(tài)性標(biāo)志物 人類基因組計(jì)劃研究結(jié)果表明，不同個(gè)體的基因99.9%是一樣的，但在序列上有極小(0.1%)的遺傳

8、差異，其中主要是 SNP。 SNP是指在人群中出現(xiàn)的頻率1%的先天突變。SNP存在于整個(gè)人類基因組中，可能每100300bp就存在一個(gè)SNP，估計(jì)總數(shù)在數(shù)百萬個(gè)。 研究表明，正是這0.1%的差異授予你我他特有的表型；這個(gè)小小的差異還與個(gè)體對(duì)疾病(包括腫瘤)的易感性、對(duì)藥物的反應(yīng)性差別有密切關(guān)系。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)人類基因組計(jì)劃(HGP)基因組多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(SNPs)Human Genome Project BiologyResponseDiseasePreventionCollins et al., Nature, 2003

9、SNPsSNPS=Single Nucleotide Polymorphisms人類基因組計(jì)劃單核苷酸多態(tài)與人類個(gè)體差異單核苷酸多態(tài)與個(gè)體疾病易感性差異CancerExposureCancer-freeCIR by 70 yrsM: 15.9% F: 9.5%(Peto, BMJ, 2000)Genetic susceptibility?Screening, prevention研究問題 1: Why only 20% smokers develop lung cancer?SNPs？NSCLCNo responseResponseChemotherapySNPs & Chemosensiti

10、vitySNPs？研究問題 2: Why some lung cancer patients have no response to chemotherapy?基因檢測(cè)-危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)從科學(xué)研究臨床實(shí)踐人類基因組流行病學(xué) 1998年由Khoury和Dorman提出人類基因組流行病學(xué)(human genome epidemiology, HuGE)的概念，定義：應(yīng)用流行病學(xué)與基因組信息相結(jié)合的研究方法，開展以人群為基礎(chǔ)的研究，評(píng)價(jià)基因組信息（基因或基因變異及其相應(yīng)編碼的產(chǎn)物）對(duì)人群健康和疾病的流行病學(xué)意義。分子流行病學(xué)常用技術(shù)及方法核酸技術(shù)（DNA & RNA）核酸體外擴(kuò)增 （PCR）核酸電泳圖譜

11、核酸酶切電泳圖譜 （RFLP）擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）核酸分子雜交 有原位雜交、斑點(diǎn)雜交、轉(zhuǎn)印雜交（包括Southern blot檢測(cè)DNA和Northern blot檢測(cè)RNA）等。核酸序列分析蛋白質(zhì)技術(shù) 蛋白質(zhì)分離鑒定技術(shù)主要有：電泳、凝膠電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印雜交（Western blot）、色譜分析、蛋白質(zhì)測(cè)序等。酶學(xué)技術(shù) 包括定性和定量檢測(cè)，要求一定的條件。多位點(diǎn)酶電泳（multilocus enzyme electrophoresis, MEE）法。免疫學(xué)技術(shù)： 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、熒光免疫試驗(yàn)（FIA）、放射免疫試驗(yàn)（RIA）、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)（ICC）等；色譜（質(zhì)譜

12、）技術(shù)： 高效液相色譜技術(shù)HPLC）、液相蛋白色譜技術(shù)（FPLC）等。PCR-RFLPPCR-SSCP, PCR-based resequencingReal-time PCRMatrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight (MALDI) mass spectrometryDynamic allele-specific hybridization (DASH)DNA-chip analysisDHPLC單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)技術(shù)illumina 高通量基因分型平臺(tái)SNPstream基因分型系統(tǒng)Automated Liqu

13、id HandlerSpectroPREPTMNanoliter DispenserSpectroJETTMMALDI-TOF Mass SpectrometerSpectroREADERTMAutomated AnalysisSpectroTYPERTMMiniaturized BiochipSpectroCHIPTMMassARRAYIntegrated Components核酸分子雜交蛋白質(zhì)檢測(cè)鑒定系統(tǒng)SDS酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）高效液相色譜(HPLC, LC/MS/MS)Accessible Genome and GeneticVariation databaseAfforda

14、ble High-throughputPlatform Service分子流行病學(xué)在疾病預(yù)防和控制中的應(yīng)用（一）病因的探討及病因致病機(jī)制的研究 1、傳染病病因及流行規(guī)律的探討 研究已知或新發(fā)傳染病的病原體和流行特點(diǎn) 病原學(xué)診斷（基因診斷）、基因分型 研究分布特點(diǎn)，傳染源追蹤和傳播途徑確定 觀察病原體在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間和消長(zhǎng)規(guī)律丙型肝炎病毒基因分型Simmonds雙等級(jí)基因命名系統(tǒng) 病原體基因分型不同基因型HCV，其臨床表現(xiàn)以及對(duì)抗病毒治療的敏感程度有顯著差異。1b型對(duì)干擾素治療的持續(xù)應(yīng)答率為20%，而非1b型對(duì)干擾素治療的持續(xù)應(yīng)答率可達(dá)60-70%。1a, 1b 2a, 2b, 3a1a, 1b

15、2a, 2b, 2c, 3a45a1b1b, 61b, 3a1b, 3a3b4Clinical Microbiology Reviews, 2000, 13(2) 223-235HCV 1b型是我國(guó)主要流行型1a, 1b, 2b, 3a2a如SARS 在廣東流行可分三個(gè)階段:早期由病人分離到的SARS 病毒與果子貍分離到的SARS 病毒高度同源,因此懷疑SARS 是一種動(dòng)物來源的疾病。上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志2005SARS病毒來源及變異分析中期SARS 病毒分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 病毒傳播力強(qiáng), 超級(jí)傳播事件發(fā)生多。后期SARS 病毒堿基缺失可達(dá)幾百個(gè)，病毒的傳播力大大減少。案例：1990年7月，美國(guó)佛羅里

16、達(dá)州一名AIDS婦女，懷疑在當(dāng)?shù)匾谎揽圃\所手術(shù)時(shí)感染了HIV，因?yàn)樵撛\所的牙科醫(yī)生也是一名AIDS患者。隨后當(dāng)?shù)匦l(wèi)生部門對(duì)該牙醫(yī)診治過的一千余名患者進(jìn)行HIV檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)7名HIV感染者有在該診所的就診史。那么這7名HIV感染者是否與該牙醫(yī)有關(guān)呢？傳染病傳播途徑分析Science 1992針對(duì)這一問題可采取的分析方法：1、傳統(tǒng)流行病學(xué)分析方法：接觸者調(diào)查，分析感染者可能的危險(xiǎn)行為如輸血、靜脈吸毒、不潔性交史等。2、分子流行病學(xué)方法：比較HIV病毒基因序列的差異，分析不同病例感染株遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近。Science 1992與牙醫(yī)感染株的遺傳變異性比較與對(duì)照感染株的遺傳變異性比較病人D當(dāng)?shù)貙?duì)照牙醫(yī)及

17、病人A,B,C,E,G病人F進(jìn)化樹分析以結(jié)核為例：與結(jié)核病人密切接觸，感染和發(fā)病的危險(xiǎn)增加。這些接觸者與源病例之間，是否產(chǎn)生了結(jié)核分枝桿菌的傳播？開展結(jié)核病成“簇”性研究，可以從分子角度解答這樣的問題。成簇的過程就是用聚類分析對(duì)分離株的基因進(jìn)行分型或分群的過程，可以分析結(jié)核病的傳染源和傳播途徑。揭示傳染病傳播機(jī)制結(jié)核桿菌DNA指紋圖譜有助于基因分型 流行病學(xué)常用結(jié)核桿菌基因分型方法IS6110-RFLPSpoligotyping MIRU-VNTR Bauer等對(duì)丹麥1549株結(jié)核菌進(jìn)行IS6110為基礎(chǔ)的DNA指紋分析，成簇率49%。同樣方法檢測(cè)格陵蘭島成簇率為79%。J Clin Micr

18、obiol,1998Beijing家族結(jié)核菌株在全球的分布 江蘇省北部地區(qū)(蘇北) 在2003年1-7月爆發(fā)了較大規(guī)模的無菌性腦膜炎,涉及范圍之廣、發(fā)病人數(shù)之多,在國(guó)內(nèi)較少見。不明原因疾病爆發(fā)調(diào)查疾病暴發(fā)原因分析問卷調(diào)查收集基本資料血清學(xué)檢測(cè)病原體分離培養(yǎng)Echo30 型腸道病毒感染病毒序列測(cè)定和比對(duì)均為Echo30型腸道病毒。進(jìn)化樹分析顯示分離株與國(guó)外1999年和2000年分離株的親緣關(guān)系最近；但自成一簇，與國(guó)外毒株存在地區(qū)差別。2、非傳染病的病因及病因致病機(jī)制的研究 例：載脂蛋白與心血管疾病 HBV感染與肝癌（基因組整合） EBV感染與鼻咽癌 HPV感染與宮頸癌 HP感染與胃癌 心腦血管病

19、的研究 載脂蛋白與心血管疾病 四組老年人apooA-I、apoB-100與apoA-I/apoB-100比值人群類別 檢測(cè)例數(shù) apoA-I（mg/dl） apoB-100（mg/dl） apoA-I/apoB-100 對(duì)照組 冠心病組 146 141.651.9 113.935.8* 1.400.7*高血壓組 90 135.132.9* 107.059.2* 1.441.07*高血壓并冠心病組57 140.231.3 110.934.2* 1.410.8*注：病例組與對(duì)照組相比*；*P0.01 HBV肝癌正常人HBV感染正常:HBV肝癌AUC: 99.90.1%2/5靈敏度:特異度:HBV:

20、HBV肝癌AUC: 99.20.6%MiRNA 譜(Profile)例：惡性腫瘤的形成過程及其影響因素前致癌物終致癌物DNA損傷基因突變癌前病變惡性腫瘤活化解毒凋亡增生修復(fù)損傷遺傳易感性因素（二）疾病易感性的測(cè)定 （傳染病和非傳染?。y(cè)定疾病易感性，可以進(jìn)行高風(fēng)險(xiǎn)人群篩選，采取更有效的預(yù)防和控制措施 高危險(xiǎn)易感基因（高外顯性） 連鎖研究(linkage!) 如BRCA1、BRCA2與乳腺癌（40-80） 一般人群中頻率T) (DNA pol, PARP domain ) Arg399Gln (GA) (PARP domain)EXON 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

21、 14 15 16 17 XRCC1 5UTRATG3UTR-77TCExon6 Arg194Trp Exon10 Arg399Gln+1 -77TXRCC1 promoter -1152+93LuciferaseXRCC1 promoter -1152+93LuciferasepGL3-77CpGL3p77Tp77CKpnINheIChromosome: 19q13.21246-bp 5764% VariableCases (n=710)Controls (n=710)P value No.%No.%Age (years)0.7100 6037452.736651.5 6033647.334

22、448.5Sex0.7207Male52073.251372.3Female19026.819727.7Smoking status0.0001Non-smokers23132.537052.1Ever-Smokers47967.534047.9XRCC1 T-77C0.0003T allele119884.4126489.0C allele22215.615611.0XRCC1 C194T0.8389C allele98169.198669.4T allele43930.943430.6XRCC1 G399A0.4488G allele104073.2102272.0A allele3802

23、6.839828.0Distribution of Select Variables and XRCC1 Variant Alleles in Lung Cancer Cases and Cancer-free Controls XRCC1 T-77C Polymorphism and Lung Cancer RiskXRCC1 GenotypeCases(710)Controls(710)AdjustedOR (95%CI)No %No %XRCC1 T-77CTT (ref.) 500 70.4558 78.61.00CT198 27.9148 20.91.51 (1.17-1.94) C

24、C 12 1.7 4 0.62.98 (0.93-9.59) CT/CC210 29.6152 21.41.55 (1.21-1.98) C allele 222 15.6156 11.0P = 0.0003Hu Z, Shen H. Pharmacogenetics & Genomics 2005 15(7): 457-64. XRCC1 T-77C and Cumulative SmokingPack-years of smoking -77TT -77CT/CCAdjusted ORHu Z, Shen H. Pharmacogenetics & genomics 2005 15(7):

25、 457-64. P value for the test of additive gene-smoking interaction: This significant association with lung cancer was validated in another independent case-control study in a Chinese populationHao et al. 2006 OncogeneGWAS（三）疾病防治措施的研究 1、傳染病的預(yù)防 （1）新疫苗的研制核酸疫苗（2）研究疫苗預(yù)防效果與疫苗無應(yīng)答的關(guān)系，如對(duì)乙肝疫苗低應(yīng)答或無應(yīng)答人群中，白種人和日本

26、人攜帶HLA-DR3和HLA-DR7比率較高；而中國(guó)人HLA-DR14-DR52基因的攜帶率較高 （3）疫苗株引起的感染2、非傳染病的防治作為抗氧化劑的胡蘿卜素可減少或防止DNA的損傷葉酸可改變DNA甲基化或減少染色體斷裂 （四）疾病診治效果和預(yù)后評(píng)價(jià)1、治療效果評(píng)價(jià) 從分子水平研究藥物治療后體內(nèi)某些指標(biāo)的變化情況（傳染病和非傳染?。?、疾病預(yù)后的評(píng)價(jià) 胃癌病人nm23基因、P27KIPI基因、TGF-BRI基因表達(dá)與生存率的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌組織內(nèi)上述基因高表達(dá)組手術(shù)后3年和5年生存率均高于低表達(dá)組或陰性組 我國(guó)2000年全國(guó)流調(diào)結(jié)核菌耐藥狀況初始耐藥：18.6% 初始耐多藥率：7.6%獲得

27、性耐藥：46.5% 獲得性耐多藥率：17.1%總耐藥：27.8% 總耐多藥率：10.7%miR-196a2 rs11614913 多態(tài)性與肺癌生存率 (CC vs CT/TT)Hu Z Shen H. Journal of Clinical Investigation, July, 2008(A) MMP9 Arg279Gln and NSCLC survival (P = 0.03); (B) MMP9 Arg668Gln genotypes and NSCLC survival (P = 0.01); (C) Combined effect of MMP9 Arg279Gln and Arg668Gln on NSCLC survival (P = 0.007)Arg279GlnArg668GlnABCJin GShen H. Int J Cancer, 2009The 4 miRNAs Expression and NSCLC Patients Survival of all Sample SetsNumber of high-risk miRNAsPatientsN=303DeathsN=113MST (Months