基因表達(dá)和基因重組精選

1、 基因重組(zhn z)和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering第 十 四 章共一百頁概論(giln)共一百頁基因重組：不同的DNA分子間發(fā)生共價(jià)連接(linji)形成重組DNA 分子。重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段共一百頁重組(zhn z)DNA技術(shù)發(fā)展史共一百頁pSC101EcoRIBoyer 和Cohen的實(shí)驗(yàn)(shyn)Boyer 和Cohen的實(shí)驗(yàn)(shyn)pR6-5大腸桿菌共一百頁pSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基因(jyn)DNA連接酶重組(zhn z)DNA分子共一百頁培養(yǎng)(piyng)平

2、皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素卡那霉素基因大腸桿菌(d chn n jn)共一百頁人體生長激素釋放(shfng)激素(SS)抑制(yzh)和調(diào)節(jié)多種激素的作用從動(dòng)物腦中提取:5mg-50萬只羊腦基因工程9升大腸桿菌 培養(yǎng)液共一百頁 SS基因(jyn)基因(jyn)載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表SS共一百頁第 一 節(jié)DNA的重組(zhn z) DNA Recombination共一百頁DNA重組(zhn z)接合(jih)作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction)轉(zhuǎn) 座 (transposition)同源重組 (homologous

3、recombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specific recombination)共一百頁發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過(tnggu)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。 一、同源(tn yun)重組共一百頁二、細(xì)菌(xjn)的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合(jih)作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。共一百頁可接合(jih)質(zhì)粒如 F 因

4、子(F factor) 質(zhì)粒 細(xì)菌(xjn)染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子共一百頁（二）轉(zhuǎn)化(zhunhu)作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞(xbo)或培養(yǎng)的受體細(xì)胞(xbo)獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。 共一百頁例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段(pin dun)被另一細(xì)菌攝取。共一百頁共一百頁（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhun do)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生(fshng)在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。共一百頁噬菌體的生活史溶菌生長(shngzhng)

5、途徑(lysis pathway)溶源菌生長途徑(lysogenic pathway)例共一百頁共一百頁第 二 節(jié) 重組(zhn z)DNA技術(shù)DNA Recombination Technique 共一百頁相關(guān)概念DNA克隆(k ln)工具酶目的基因基因載體基本原理 重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系本節(jié)主要(zhyo)內(nèi)容共一百頁一、重組DNA技術(shù)相關(guān)(xinggun)概念 克隆(clone)來自同一始祖的相同(xin tn)副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一） DNA克隆共一百頁技術(shù)水平：分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 細(xì)

6、胞克隆個(gè)體(gt)克?。▌?dòng)物或植物）共一百頁DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源(tn yun)的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 共一百頁生物(shngw)技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)(biod)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(genetic e

7、ngineering) 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。共一百頁（二）工具(gngj)酶 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性(jin xn)磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶共一百頁重組DNA技術(shù)中常用(chn yn)的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具

8、有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基共一百頁限制性核酸(h sun)內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識(shí)別(shbi)DNA的特異序列, 并在識(shí)別(shbi)位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H共一百頁作用與甲基化

9、酶共同構(gòu)成細(xì)菌(xjn)的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身DNA。分類、（基因工程技術(shù)(jsh)中常用型）共一百頁第一個(gè)字母取自產(chǎn)生(chnshng)該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名(mng mng)Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶共一百頁類酶識(shí)別序列(xli)特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口(qi ku) ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG共一百頁Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCC

10、CTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口(qi ku)粘端切口(qi ku)共一百頁同功異源酶來源不同的限制酶，但能識(shí)別(shbi)和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst共一百頁有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別(shbi)序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTA

11、G GATCT A同尾酶共一百頁（三）目的(md)基因目的(md)基因需要克隆的DNA片段。編碼某種蛋白質(zhì)研究某基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究某基因與疾病的關(guān)系共一百頁 按照人的愿望(yunwng)設(shè)計(jì)和建造非天然的基因表達(dá)體系。某功能蛋白宿主細(xì)胞基因工程(jyn gngchng)產(chǎn)品重組體目的基因共一百頁 cDNA： 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與mRNA互補(bǔ)的DNA鏈。 基因組DNA： 代表一個(gè)細(xì)胞(xbo)或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。共一百頁（四） 基因(jyn)載體定義：為攜帶目的基因(jyn)，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子?？寺≥d體(cloning vector)

12、-為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體。表達(dá)載體(expression vector)-為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體。常用載體 質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA 共一百頁宿主細(xì)胞基因載體共一百頁載體(zit)的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上(yshng)的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)）即多個(gè)單一酶切位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。共一百頁 存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。 具有自我復(fù)制功能(gngnng)。 帶有抗性基因及表型識(shí)別等遺傳性標(biāo)記物。 經(jīng)改造后具有多克隆位點(diǎn)。 舉例：pBR322質(zhì)粒質(zhì)

13、粒共一百頁共一百頁宿主(szh)細(xì)胞 ori共一百頁抗Amp宿主(szh)細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基共一百頁多克隆位點(diǎn)+共一百頁多種酶切口多克隆位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶單一酶切口共一百頁多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制(fzh)起始點(diǎn)遺傳(ychun)標(biāo)記Amppolylinker基因載體共一百頁共一百頁共一百頁噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入(ch r)型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克隆）噬菌體(phage) M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)(xtng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列共一百頁 粘性(zhn xn)質(zhì)粒(cosmid)共一百頁酵母人工染色體 (yeast artifici

14、al chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動(dòng)物病毒(bngd)DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他(qt)共一百頁二、重組(zhn z)DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá) 共一百頁 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過 程共一百頁（一）目的基因(jyn)的獲取1. 化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列(xli)或其產(chǎn)物的氨基酸序列(xli) 。2.基因組DNA文庫(genomic DN

15、A library)3. cDNA文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) （見第22章） 共一百頁* 化學(xué)合成法獲取目的(md)基因由已知氨基酸序列(xli)推測可能的DNA序列(xli)共一百頁組織(zzh)或細(xì)胞染色體DNA基因(jyn)片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合* 從基因組DNA文庫獲取目的基因共一百頁共一百頁 cDNA文庫 以 mRNA 為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成(hchng)與mRNA互補(bǔ)的DNA，再復(fù)制

16、成雙鏈 cDNA，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得cDNA文庫。DNAmRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA共一百頁mRNA的提取(tq)與純化從mRNA制備(zhbi)cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈cDNA文庫法共一百頁cDNA基因重組轉(zhuǎn)化核酸探針cDNA文庫(wnk)共一百頁共一百頁 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lin sh fn yng)（PCR）共一百頁目的(md)基因基因(jyn)載體重組體（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建共一百頁（三）外源基因與載體(zit)的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同(b tn)限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接共一百頁Ba

17、m H切割(qig)反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連同一(tngy)限制酶切位點(diǎn)連接共一百頁不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端(m dun)）的連接Eco R切割(qig)位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。共一百頁2. 平端連接適用(shyng)于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端共一百頁目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連

18、接酶15C重組體載體自連目的基因 自連共一百頁3. 同聚物加尾連接在末端(m dun)轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。共一百頁5335載體(zit)DNA5335目的(md)基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15C重組體共一百頁4. 人工接頭(linker)連接由平端加

19、上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性(zhn xn)末端，而進(jìn)行粘端連接。 共一百頁人工(rngng)接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R共一百頁受體菌條件(tiojin)安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(zhunhu) (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌共一百頁（五）重組(zhn z)體的篩選 1. 直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法原位雜

20、交Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等共一百頁(插入(ch r)失活法)抗藥性標(biāo)記選擇共一百頁共一百頁互補(bǔ)(h b)共一百頁 互補(bǔ)(h b)的檢測共一百頁原位雜交共一百頁Southern印跡(yn j)共一百頁雞的肌球蛋白的克隆(k ln)和檢出共一百頁重組DNA技術(shù)操作過程可形象(xngxing)歸納為 小 結(jié)分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩選重組體 共一百頁重組DNA技術(shù)(jsh)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化

21、體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交共一百頁表達(dá)體系的建立(jinl)表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆(k ln)基因的表達(dá)共一百頁1. 原核表達(dá)體系 （E.coli表達(dá)體系最為常用）標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn)E.coli表達(dá)體系的不足 不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成(xngchng)不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白共一百頁大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)(biod)和分泌共一百頁共一百頁優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)(bi

22、od)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)染 將表達(dá)(biod)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 2. 真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞共一百頁表達(dá)載體(zit)pFASTBACI 的物理圖譜共一百頁共一百頁（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因(jyn)定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)(yxu)的關(guān)系（二）生物制藥共一百頁 重組DNA醫(yī)藥(yyo)產(chǎn)品產(chǎn) 品功 能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF, EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO, 酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂共一百頁基因診斷(genetic diagnosis)是利用分子