導(dǎo)向性人干擾素α2a工程菌的高密度發(fā)酵

1、導(dǎo)向性人干擾素2a工程菌的高密度發(fā)酵 作者：孟潔如，顏真，趙寧，張英起 【關(guān)鍵詞】 大腸桿菌 【Abstract】 AIM: To optimize the pilotscale fermentation procedure of E.coli producing tumor targeted human IFN2a and to obtain high cell density and high level expression of the aim protein. METHODS: The effects of the rang of pH, dissolved oxygen, cult

2、ure time, induction time and the manner of feeding were analyzed with 10 L of fermentation tank. RESULTS: Under the established conditions, we performed a threetime repeated fermentation. The final cell density was A600 nm 25-30 and more than 50 g of wet bacteria per liter could be obtained. The exp

3、ression level of recombinant protein was higher than 3.2109 U/L. CONCLUSION: The results show that the established fermentation procedure is stable, of short cycle and with high expression, which lays the basis for further purification and largescale production of IFN2aNGR. 【Keywords】 fermentation;

4、IFN; Escherichia.coli 【摘要】 目的：優(yōu)化大腸桿菌表達(dá)導(dǎo)向性人干擾素2a的中試發(fā)酵工藝，以獲得工程菌的高密度發(fā)酵和目的蛋白的高表達(dá). 方法：采用發(fā)酵罐發(fā)酵，對(duì)影響工程菌生長和目的蛋白表達(dá)的條件，如pH值、活化時(shí)間、誘導(dǎo)時(shí)間、溶氧范圍及補(bǔ)料流加方式等進(jìn)行優(yōu)化. 結(jié)果：根據(jù)優(yōu)化條件，連續(xù)三批重復(fù)發(fā)酵10 L工程菌，最終菌體密度均達(dá)A600 nm 2530，菌體獲得量均可達(dá)濕重50 g/L以上，目的蛋白表達(dá)量均為3.2109 U/L以上. 結(jié)論：此發(fā)酵工藝具有周期短、產(chǎn)量高以及重復(fù)性穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，為下游純化和進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 發(fā)酵；干擾素；大腸桿菌 干擾

5、素(IFN)是一種生物學(xué)活性相當(dāng)復(fù)雜的細(xì)胞因子,具有抗病毒活性、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞增殖、抗腫瘤血管生成以及與多種淋巴因子協(xié)同作用等多種生物功能1-3. NGR是通過噬菌體展示技術(shù)篩選出的, 可以特異性地與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上的CD13分子結(jié)合的多肽4. 為了進(jìn)一步提高IFN2a的抗腫瘤活性，同時(shí)降低毒副作用，減少用藥量，我中心研制和開發(fā)了一種新型導(dǎo)向性人IFN2a,即將IFN2a與NGR基因重組，并表達(dá)IFN2aNGR融合蛋白，通過NGR與CD13的結(jié)合作用，使IFN2a在腫瘤組織的新生血管處富集，針對(duì)性地發(fā)揮抗腫瘤和抑制腫瘤血管形成的作用. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明, 它比天然基因工程人IFN2a的抗

6、腫瘤作用增強(qiáng),毒副反應(yīng)下降5,并具有更廣泛的適應(yīng)證.具有廣闊的應(yīng)用前景.為保證進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn),本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)工程菌DH5/pBV220IFNN的表達(dá)和生長規(guī)律進(jìn)行研究, 建立了一個(gè)適用于工業(yè)化的高密度、高表達(dá)的發(fā)酵工藝. 1材料和方法 11材料 111菌種和質(zhì)粒宿主菌DH5由本中心保存. 重組質(zhì)粒pBVIFN2aNGR(以下簡稱IFNN)由本中心構(gòu)建和保存，在天然IFN2a基因的3端融合一段含有13個(gè)氨基酸的NGR編碼序列，受PLPR雙重啟動(dòng)子控制，在42時(shí)能誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá). 112培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基用于試管種子培養(yǎng)，2YT培養(yǎng)基用于三角搖瓶培養(yǎng)，半合成培養(yǎng)基用于10 L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料培

7、養(yǎng). LB培養(yǎng)基中含有（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；半合成培養(yǎng)基中含有（g/L）：磷酸鹽適量（KH2PO4K2HPO4Na2HPO412H2O=247），（NH4）2SO4 1.8, NH4Cl 0.3，蛋白胨4.5, 酵母粉2.25, 甘油適量, 和微量元素（MgSO47H2O 0.3）；補(bǔ)料基質(zhì)中含有（g/L）：甘油適量，酵母粉5，蛋白胨10，MgSO47H2O 0.6. 用5 mol/L NaOH溶液，將溶液的pH值全部調(diào)為7.0. 培養(yǎng)基和補(bǔ)料在121高壓滅菌20 min，各種培養(yǎng)基中都加入氨芐青霉素溶液至100 mg/L. 113儀器NBSML8000發(fā)酵罐，美國

8、NBS公司；JL21型冷凍高速離心機(jī)為美國Beckman公司產(chǎn)品. 12方法 121發(fā)酵用菌種的篩選取一管冷凍保存的甘油菌，用接種環(huán)接種于LB平板上，37培養(yǎng)過夜，挑單克隆菌種于含有5 mL LB培養(yǎng)液的試管中，30培養(yǎng)至A600 nm為0.40.6時(shí)，升溫至42再培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，采用WISHVSV系統(tǒng)以細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)生物學(xué)活性，以活性指標(biāo)推測(cè)表達(dá)情況. 將表達(dá)量最高的克隆作為發(fā)酵用種子，分裝冷凍保存，每批發(fā)酵取出一管，以保證菌種的穩(wěn)定性. 122工程菌的培養(yǎng)取一管經(jīng)篩選出的并冷凍保存的甘油菌，經(jīng)活化后取1 mL接種于含100 mL LB培養(yǎng)基中30培養(yǎng)8 h，再取1 mL接種于

9、100 mL 2YT培養(yǎng)基中，30生長8 h. 取400 mL接種于10 L發(fā)酵罐中，30培養(yǎng)6 h，42誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h. pH控制在7.0左右，當(dāng)pH值低于該值時(shí)，用補(bǔ)加氨水來控制；活化溫度控制在30；誘導(dǎo)溫度控制在42；溶解氧控制飽和度在30%以上，當(dāng)溶解氧降至該值以下，可通過提高通氣量和攪拌速度以提高溶解氧. 整個(gè)發(fā)酵過程中，通過改變pH值、活化和誘導(dǎo)時(shí)間、溶解氧濃度和補(bǔ)料的流加，觀察工程菌的生長和目的蛋白的表達(dá). 123結(jié)果分析工程菌密度的測(cè)定6：752型分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長A值，測(cè)定范圍在0.30.7之間. 由于干擾素在原核表達(dá)載體中的表達(dá)量普遍較低，約為1%2%，對(duì)表達(dá)產(chǎn)

10、物行SDSPAGE無法辨認(rèn)新生條帶，但是表達(dá)產(chǎn)物具有較高的體外殺傷活性，所以，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定我們采用國際通用的WISHVSV系統(tǒng)細(xì)胞病變法檢測(cè)其抗病毒活性. 步驟如下：WISH細(xì)胞在含抗生素和谷氨酰胺的100 mL/L FSC，pH 7.4的Eagles培養(yǎng)液中37培養(yǎng). 待細(xì)胞呈單層生長后，消化傳代繼續(xù)培養(yǎng). 將消化的WISH細(xì)胞，按1000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板. 37孵箱培養(yǎng)過夜. 換入用含50 mL/L FCS的Eagles液稀釋的不同濃度的IFN裂菌上清，繼續(xù)培養(yǎng)，次日用含20 mL/L FCS的Eagles培養(yǎng)液按11030稀釋的VSV病毒培養(yǎng)液，換入細(xì)胞培養(yǎng)板，37培養(yǎng)24

11、h，觀察結(jié)果，以50%細(xì)胞保護(hù)的IFN稀釋度為IFN效價(jià). 2結(jié)果 21pH對(duì)工程菌的生長和目的蛋白表達(dá)的影響三個(gè)罐批控制pH值分別為6.5，7.0和7.5，其他的參數(shù)保持一致，結(jié)果表明(Tab 1)，pH值控制在7.5時(shí)，IFNN的表達(dá)量和收菌量都最低；pH值為6.5時(shí)表達(dá)量與pH值為7.0時(shí)相當(dāng)，但是收菌量低，pH值為7.0時(shí)表達(dá)量和收菌量均較高.表1不同pH值或溶解氧濃度對(duì)工程菌的生長和IFNN表達(dá)的影響（略） 22溶解氧濃度對(duì)工程菌生長和目的蛋白表達(dá)的影響溶解氧濃度是通過改變攪拌速度和通氣中的純氧含量對(duì)其進(jìn)行調(diào)整和補(bǔ)償. 將溶解氧分別固定在40%60%，30%60%，20%60%，結(jié)果

12、顯示(Tab 1)，20%60%時(shí)，收菌量最低，而表達(dá)量在3個(gè)不同范圍內(nèi)相當(dāng)，因此，應(yīng)當(dāng)將溶解氧維持在30%以上，從而保證工程菌的產(chǎn)量. 23活化時(shí)間對(duì)工程菌生長和目的蛋白表達(dá)的影響工程菌活化不同時(shí)間以后，進(jìn)行相同時(shí)間的溫度誘導(dǎo). 結(jié)果顯示(Tab 2), 活化4 h后，進(jìn)行溫度誘導(dǎo)，收菌量和表達(dá)量都最低；活化8 h以后，雖然收菌量最高，但是目的蛋白表達(dá)量較低，因此，活化6 h最經(jīng)濟(jì)有效. 24誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)工程菌生長和目的蛋白表達(dá)的影響經(jīng)活化6 h以后，對(duì)工程菌進(jìn)行溫度誘導(dǎo)，每隔1 h取樣，測(cè)菌密度A600 nm，同時(shí)留樣進(jìn)行活性檢測(cè)(Tab 2), 結(jié)果表明，誘導(dǎo)4 h的收菌量和目的蛋白表達(dá)量

13、均較高.表2不同培養(yǎng)時(shí)間或活化時(shí)間對(duì)工程菌的生長和IFNN表達(dá)的影響（略） 25補(bǔ)料流加方式對(duì)工程菌生長及表達(dá)的影響發(fā)酵的全過程中不加補(bǔ)料，則由于碳源和氮源的供給不足，而收菌量和表達(dá)量均很低；不分批補(bǔ)料為從培養(yǎng)4 h開始，以100 mL/h的速度對(duì)補(bǔ)料進(jìn)行流加，由于活化6 h后，細(xì)菌呈指數(shù)生長，而不分批的補(bǔ)料供給無法滿足加速生長的細(xì)菌的需要，所以收菌量和表達(dá)量都不高；分批補(bǔ)料流加為：培養(yǎng)4 h開始補(bǔ)料，47 h補(bǔ)料速度為100 mL/h，710 h補(bǔ)料速度為200 mL/h. 這樣的補(bǔ)料供給模式既維持了適量的碳源和氮源濃度，又降低了有毒代謝物的積累,最終可獲得58.4 g/L的濕菌,其目的蛋白

14、的表達(dá)也可達(dá)4109 U/L. 26由高密度培養(yǎng)工程菌DH5/pBV220IFNN生產(chǎn)IFNN在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們確定了如下的發(fā)酵方案：采用半合成培養(yǎng)基，溶氧在30%左右，pH在6.57，接種后30培養(yǎng)6 h，迅速升溫至42，再繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h. 發(fā)酵前3 h不加補(bǔ)料，47 h流加速率為100 mL/h，710 h為200 mL/h. 10 h后收獲菌體. 發(fā)酵的前一階段細(xì)菌的生長速率很高，但隨后細(xì)菌生長較為緩慢. 細(xì)菌最終的密度為A600 nm在2530 (Fig 1)，IFNN的表達(dá)量也維持在3.2106以上(Fig 2),每升發(fā)酵液最終可含有50 g以上的濕菌，菌體經(jīng)鹽酸胍裂解、離子

15、交換層析和親和層析純化后純度達(dá)到95%以上，每升發(fā)酵液可得到近12.5 mg純品，達(dá)到臨床樣品的質(zhì)量要求. 3討論 重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)是增加重組蛋白產(chǎn)率的最有效的方法，高密度發(fā)酵在增加菌密度的同時(shí)提高蛋白的表達(dá)量，從而有利于簡化下游的純化操作. 重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)受表達(dá)系統(tǒng)、培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式、發(fā)酵條件控制等多種因素的影響7，8，在實(shí)際操作中，需要對(duì)各種因素進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳的發(fā)酵工藝. 發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究可通過每次改變一個(gè)因素或同時(shí)改變幾個(gè)參數(shù)來進(jìn)行，然后運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析尋找它們之間的相互作用，本研究中，我們對(duì)單因素逐個(gè)優(yōu)化，最終達(dá)到對(duì)整個(gè)工藝的優(yōu)化. 我們采用建立的中試發(fā)酵工藝，連續(xù)

16、發(fā)酵三批10L罐發(fā)酵工程菌，其結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，最終菌體密度均達(dá)A600 nm 2530，菌體獲得量均達(dá)濕質(zhì)量濃度50 g/L以上，目的蛋白表達(dá)量均為3.2109 U/L以上,發(fā)酵總時(shí)間在10 h左右. 培養(yǎng)基為重組大腸桿菌的生長和合成產(chǎn)物提供了碳源、氮源、無機(jī)鹽等物質(zhì)基礎(chǔ)9. 其中，碳源的選擇至關(guān)重要，對(duì)于大腸桿菌，高濃度的葡萄糖將造成乙酸鹽的堆積，降低工程菌產(chǎn)量和表達(dá)量. 因此，選用甘油作為碳源較好. 發(fā)酵中另一個(gè)重要因素就是外源蛋白最佳的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)10. 誘導(dǎo)后，攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞生長速率顯著降低，而不帶質(zhì)粒的細(xì)胞則不受影響. 因此，提前誘導(dǎo)使菌體和目的蛋白的產(chǎn)量降低，同時(shí)也增加了染菌

17、的機(jī)會(huì). 而誘導(dǎo)較晚雖可以獲產(chǎn)量高的菌體量，但細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的時(shí)間則減少. 補(bǔ)料的流加方式直接影響著發(fā)酵的效果. 分批補(bǔ)料培養(yǎng)的特點(diǎn)是，在培養(yǎng)過程中不斷補(bǔ)充培養(yǎng)基，使菌體在較長時(shí)間里保持穩(wěn)定的生長速率，從而達(dá)到高密度生長. 但是在補(bǔ)料流加過程中，既不能加入得過快，也不能加入得過慢. 過慢則無法滿足逐漸增加的菌體生長需要，同時(shí)也使培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的抑制性副產(chǎn)物大量積累；而過快則使攜帶目的蛋白的質(zhì)粒沒有充裕的時(shí)間復(fù)制，降低目的蛋白的表達(dá)量；而且快速的細(xì)菌生長還易引發(fā)質(zhì)粒的不穩(wěn)定性. 有報(bào)道表明，大腸桿菌通過分批補(bǔ)料發(fā)酵，每升培養(yǎng)液最高可得到50 g干菌種，A600 nm可達(dá)125左右11. 在我們

18、實(shí)驗(yàn)中，嚴(yán)格控制補(bǔ)料流加的速度，在有效提高菌體產(chǎn)量的同時(shí)提高目的蛋白表達(dá)量. 【參考文獻(xiàn)】 1 Eric J, Frank GH. Interferon in oncological practice: Review of interferon biology, clinical applications, and toxicities J. Oncology, 2001; 6: 34-55. 2 孫衛(wèi)民， 王惠琴. 細(xì)胞因子研究方法學(xué)M. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 1999：588-592. 3 Pfeffer LM, Dinarello CA, Herberman RB, et al. Bi

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