采用抗體庫技術(shù)篩選抑制肺癌的功能性抗體

1、采用抗體庫技術(shù)篩選抑制肺癌的功能性抗體 作者：胡海，冉宇靚，陳立釗，遇 瓏，孫立新，楊治華【摘要】 目的 研制抑制肺癌細(xì)胞功能性單抗，為治療肺癌提供靶向治療劑，并為分離獲得肺癌相關(guān)的分子靶標(biāo)打下基礎(chǔ)。方法 從新鮮人肺癌組織分離腫瘤細(xì)胞免疫Bal b/c小鼠，免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后接種于甲基纖維素，制備大容量功能性抗體庫。采用活細(xì)胞熒光、ELISA、免疫組化、腫瘤增殖、侵襲、黏附、動(dòng)物體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)等方法篩選鑒定抑制腫瘤細(xì)胞的功能性單抗。結(jié)果 本次融合共獲得了1573株雜交瘤克隆，在能與肺癌細(xì)胞膜反應(yīng)的314株克隆中，154株與正常肺組織不反應(yīng)或低反應(yīng)。功能性篩選發(fā)現(xiàn)41株單抗顯著地

2、抑制肺癌細(xì)胞增殖，24株能抑制肺癌細(xì)胞對(duì)Matrigel的侵襲，15株能抑制肺癌細(xì)胞與Collagen I的黏附，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了2株單抗能在體內(nèi)抑制肺癌移植瘤的生長。結(jié)論 采用大容量功能性抗體庫技術(shù)成功獲得了多株具有抑制肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的功能性單抗，其中2株可能具有靶向治療肺癌的應(yīng)用潛力。 【關(guān)鍵詞】 肺癌；抗體庫；功能性單抗；靶向治療 肺癌是最為常見的惡性腫瘤之一，在歐美等發(fā)達(dá)國家,其發(fā)病率在各種常見腫瘤中居首位1。我國亦是肺癌的高發(fā)國家，每年死于肺癌的人數(shù)超過40萬，且有明顯的逐年遞增趨勢(shì)。盡管近年來肺癌的治療手段有了較大提高，但是患者的5年生存率仍低于15%2。近年來美國FDA批

3、準(zhǔn)Herceptin和Avastin等單抗靶向藥物作為一線抗癌藥方案用于乳腺癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的治療，已在臨床上取得了顯著的療效，為腫瘤治療提供了一種全新的策略。本研究采用本室建立的高通量研制篩選功能性單抗的技術(shù)方法，獲得了多株能顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖的功能性單抗，為治療肺癌提供了有潛在應(yīng)用價(jià)值的抗體靶向治療劑。 1 材料和方法 1.1 材料 小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0細(xì)胞，肺癌細(xì)胞系GLC82（肺腺癌）、NCIH520（肺鱗癌）為本室保藏。6周齡Bal b/c小鼠購自中國藥品生物制品檢定所。 M199、M1640、DMEM、IMEM培養(yǎng)基均購自Gibco BRL公司； 胎牛血清（Fetal bo

4、vine serum, FBS）系Hyclone 生產(chǎn)；biotin馬抗小鼠IgG、IgM、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG、IgM 均購自Vector公司；tublin兔多抗為Santa Cruz 生產(chǎn)；FITC標(biāo)記的羊抗兔 購自Vector 公司；Cy3標(biāo)記avidin 購自Jackson公司; PVDF膜由Millipore生產(chǎn)；DAPI購自Sigma公司；單抗亞類檢測(cè)試劑盒均由SouthernBiotech公司生產(chǎn)；SP法免疫組化試劑盒購自福州邁新公司；Westernblot試劑購自普利萊公司。 1.2 方法 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SP2/0細(xì)胞采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；肺癌細(xì)胞

5、系GLC82和NCIH520采用含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。 1.2.2 動(dòng)物免疫 采用臨床分離的肺癌新鮮組織標(biāo)本(鱗癌、腺癌各一個(gè)) 分離單個(gè)細(xì)胞，以11065106細(xì)胞/（只次）的劑量免疫5只Bal b/c小鼠，連續(xù)免疫12個(gè)月。 1.2.3 免疫熒光 活細(xì)胞免疫熒光：將9000/孔腫瘤細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，37、5%CO2溫箱培養(yǎng)2天。細(xì)胞約70%匯合后，用PBS洗滌每孔中的細(xì)胞后加入一定濃度的一抗，室溫孵育1 h，含1%BSA的PBS洗滌5次，每次5 min；加入60l含0.5g/ml biotin標(biāo)記二抗或60l含0.5g/ml FITC標(biāo)記抗體室溫孵育30min，1%BS

6、A的PBS洗滌5次，每次5min；加入 60l 11000稀釋的Cy3Avidin，室溫孵育30min后，PBS洗滌5次，每次5min；最后用含10g/ml DAPI的50%甘油50l封閉。對(duì)于固定細(xì)胞間接免疫熒光，在加入一抗前細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定10min，0.2% Triton X100通透5min，后續(xù)試驗(yàn)操作同活細(xì)胞免疫熒光。上述實(shí)驗(yàn)中，每種單克隆抗體重復(fù)做3孔。 1.2.4 細(xì)胞融合 待免疫小鼠血清滴度達(dá)到160 000以上時(shí)，取1108 免疫小鼠脾細(xì)胞與2107處對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞系SP2/0融合。融合后接種30個(gè)于鋪有甲基纖維素的直徑35mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)。置濕盒中于5%C

7、O2 、37溫箱中培養(yǎng)。 1.2.5 免疫組織化學(xué) 免疫組化采用SP法。雜交瘤上清采用15和125兩個(gè)稀釋度。操作程序嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，鏡下陽性細(xì)胞10%定為陰性。 1.2.6 ELISA 采用SouthernBiotech的單抗亞類ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定篩選獲得的單抗亞型，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。 1.2.7 肺癌細(xì)胞增殖測(cè)定 采用MTT法檢測(cè)免疫小鼠血清對(duì)人肝癌內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。并同時(shí)采用RTCESTM(Real Time Cell Electronic Sensing System ) 細(xì)胞增殖測(cè)定儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單抗對(duì)人肝癌內(nèi)皮增殖的作用3，詳細(xì)按廠家說明進(jìn)行操作。在細(xì)胞接

8、種后816 h，加入12稀釋的雜交瘤上清或SP2/0對(duì)照上清（陰性對(duì)照），繼續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長情況。細(xì)胞增殖進(jìn)入平臺(tái)期前終止實(shí)驗(yàn)，根據(jù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算雜交瘤上清對(duì)細(xì)胞生長抑制的影響，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次。 1.2.8 抗體的侵襲抑制試驗(yàn) 100g/cm3 的BD Matrigel包被Corning Costar transwells的多孔的聚碳酸酯膜，37、5%CO2溫箱中包被30min后，每孔4104人肺癌細(xì)胞系GLC82接種于transwells中。接種細(xì)胞后在transwells中加入15稀釋的雜交瘤上清或SP2/0對(duì)照上清。在37 、5%CO2 培養(yǎng)24h后，鏡檢觀察腫瘤細(xì)胞穿過多孔的聚碳酸酯膜

9、后，刮除多孔的聚碳酸酯膜上層未穿過的腫瘤細(xì)胞。然后用11的甲醇/丙酮溶液固定膜上細(xì)胞20min。侵襲的細(xì)胞用DAPI染核，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。每張膜觀察4個(gè)不同的100倍視野，并經(jīng)SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 1.2.9 抗體的黏附抑制試驗(yàn) 96孔培養(yǎng)板經(jīng)100g/cm3的Collagen I包被，37、5%CO2溫箱中包被30min后，每孔4104人肺癌細(xì)胞系GLC82接種于96孔培養(yǎng)板，接種細(xì)胞后在6孔培養(yǎng)板中加入15稀釋的雜交瘤上清或SP2/0對(duì)照上清。在37、5%CO2 培養(yǎng)1h后，每孔加入250l無血清1640培養(yǎng)基振蕩洗滌，每次5min，共計(jì)洗滌3次，

10、以洗去未黏附的腫瘤細(xì)胞。隨后，使用MTT法測(cè)定黏附細(xì)胞數(shù)，經(jīng)SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次。 1.2.10 體內(nèi)抑瘤試驗(yàn) 將BALB/C裸鼠分為抗體治療組，正常鼠IgG為對(duì)照組，每組6只。將人肺癌細(xì)胞系GLC82按100萬細(xì)胞/只小鼠的比例接種所有各組的BALB/C裸鼠皮下。接種后5天（已能捫及腫瘤時(shí)）開始腹腔注射純化抗體進(jìn)行治療。注射劑量200g/(次只)，治療第一周，每天1次，連續(xù)5天，以后每周2次。20天時(shí)處死小鼠，測(cè)瘤重，計(jì)算腫瘤生長抑制率。 2 結(jié)果 2.1 小鼠免疫血清的測(cè)定 從食管癌新鮮組織標(biāo)本中分離單個(gè)細(xì)胞，免疫Balb/c小鼠5只，分別于免疫后3、5、9、1

11、1、13個(gè)月從小鼠尾靜脈取血分離血清。免疫后9個(gè)月時(shí)固定細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)小鼠血清的抗體滴度為120 000160 000。其中4號(hào)小鼠血清滴度最高，為160 000，見圖1a。此后兩次采血檢測(cè)免疫血清的抗體滴度不再顯著升高，準(zhǔn)備融合。 用MTT 法檢測(cè)這只小鼠免疫第9個(gè)月的免疫血清對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果如圖1b。隨著血清濃度的增加，免疫血清對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用增加，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。150稀釋的免疫鼠血清對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖的抑制達(dá)43%，而150稀釋的正常鼠血清對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖沒有明顯的抑制作用，表明該免疫血清中含有能顯著抑制人肺癌增殖的功能性抗體。 2.2 細(xì)胞融合及陽性克隆

12、的篩選 待免疫小鼠血清中的抗體滴度不再升高時(shí)，取滴度最高的4號(hào)小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，融合細(xì)胞接種40個(gè)含有HAT選擇培養(yǎng)液的甲基纖維素培養(yǎng)基的平皿中。培養(yǎng)812天后，從培養(yǎng)皿中挑取孤立的較大的細(xì)胞集落，共計(jì)挑取2652個(gè)單集落細(xì)胞克隆，接種30個(gè)96孔培養(yǎng)板，最終從中獲得了1573個(gè)單克隆。以tublin作為細(xì)胞膜是否被通透的對(duì)照，采用活細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)篩選了1573個(gè)雜交瘤克隆上清與2種肺癌細(xì)胞系GLC82和NCIH520的反應(yīng)。如果對(duì)照tublin的免疫熒光陽性則說明細(xì)胞膜已經(jīng)被通透，抗tublin的抗體分子進(jìn)入了細(xì)胞；如果tublin為陰性，說明細(xì)胞沒有被通透，抗體無法進(jìn)

13、入細(xì)胞內(nèi)，見圖2。因此，這時(shí)的陽性反應(yīng)表明該抗體是與細(xì)胞膜上的蛋白結(jié)合，即此抗體的抗原是膜蛋白，此抗體也可能作為抗肺癌靶向治療的抗體。最終我們獲得了314個(gè)與2種肺癌細(xì)胞膜均呈陽性反應(yīng)的克隆。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了上面314個(gè)陽性克隆的雜交瘤上清與正常肺組織的反應(yīng)性，結(jié)果獲得了154個(gè)與正常肺組織不反應(yīng)或低反應(yīng)的單抗克隆。 2.3 抗肺癌單抗抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和黏附 采用腫瘤細(xì)胞增殖測(cè)定、DB Matrigel侵襲測(cè)定及Collagen I黏附實(shí)驗(yàn)對(duì)經(jīng)過活細(xì)胞免疫熒光及免疫組化篩選獲得的154株克隆單抗進(jìn)行功能性的篩選，鑒定這些單克隆抗體對(duì)GLC82細(xì)胞增殖、侵襲、黏附的影響。有41株

14、單抗能明顯抑制肺癌細(xì)胞GLC82的增殖，其中抑制率最高的單抗9C10達(dá)到55%3%；24株單抗能抑制GLC82對(duì)Matrigel的侵襲，其中抑制率最高的單抗4E2達(dá)到68%8%；15株單抗抑制肺癌細(xì)胞GLC82對(duì)Collagen I的黏附，其中抑制率最高的單抗14A12達(dá)到50%11%。其中154株單抗中有4株單抗（9D12、5A3、6C4、15E11）對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和黏附均有一定的抑制。圖3顯示了部分單抗對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲及黏附的影響。 2.4 功能性單抗的亞類鑒定 采用單抗亞類檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了其中25株具有功能的單抗的亞類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有5株IgG1、4株IgG2a、1株IgG2

15、b、8株 IgM。還有2株為混合克隆。 2.5 抗肺癌單抗顯著抑制肺癌移植瘤生長 選擇對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲最強(qiáng)的單抗各1株，進(jìn)行了體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)。在單抗治療起始后20天（接種腫瘤后25天）處死動(dòng)物，獲各組腫瘤稱瘤重，計(jì)算各組的平均瘤重。正常鼠IgG治療組平均瘤重為0.8430.320，9C10治療組的平均瘤重為0.4260.306，4E2治療組的平均瘤重為0.4660.266，9C10和4E2對(duì)腫瘤瘤重的抑制率分別為49.4%和47.9%，其P值均小于0.05，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明這2株抗體在體內(nèi)均能顯著抑制人肺癌的生長，見圖4。 3 討論 近年來，靶向腫瘤細(xì)胞功能基因/蛋白靶標(biāo)的治療策略越來

16、越受到人們的重視，并且取得了較大的 A.9C10單克隆抗體抑制GLC82細(xì)胞的增殖;B.4E2單克隆抗體抑制GLC82細(xì)胞對(duì)Matrigel的侵襲;C.12F7單克隆抗體抑制GLC82細(xì)胞對(duì)I型膠原黏附(200) 各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的瘤重 進(jìn)展。如赫賽汀（抗HER2人源化單抗）治療乳癌4、美羅華（抗CD20人源化單抗）治療淋巴瘤5、格列衛(wèi)（酪氨酸激酶抑制劑）治療慢性粒細(xì)胞白血病、胃腸道間質(zhì)瘤6、阿瓦斯?。筕EGF人源化抗體）治療大腸癌7。 通過建立大容量的單抗庫篩選獲得腫瘤相關(guān)的功能基因和靶點(diǎn)已經(jīng)被證明是一條可行且高效的技術(shù)路線，并越來越受到關(guān)注。2004年，Eustace等報(bào)道了通過這一方法

17、獲得了3個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能性基因8。另外，該技術(shù)還被報(bào)道成功地篩選鑒定了肺內(nèi)皮膜蛋白相關(guān)功能性基因和食管癌內(nèi)皮膜蛋白相關(guān)功能基因9,10。 為了建立抗肺癌的大容量功能性單抗庫，本研究從肺癌（鱗癌和腺癌）新鮮組織標(biāo)本中分離單個(gè)腫瘤細(xì)胞，免疫Bal b/c小鼠。用免疫血清直接進(jìn)行肺癌細(xì)胞增殖的功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)免疫血清稀釋11 000 時(shí)仍能顯著抑制肺癌細(xì)胞GLC82的增殖；而正常鼠血清在150時(shí)也不能抑制肺癌細(xì)胞GLC82的增殖，表明免疫血清中含有能抑制肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的功能性抗體。因此，我們制備的大容量單抗庫將可能含有能夠抑制肺癌的功能性單抗。 為了得到大容量單抗庫，本文改良了傳統(tǒng)的單克隆

18、抗體制備方法，建立和完善了高通量制備和篩選陽性單抗的技術(shù)方法，最終獲得了庫容為1573個(gè)克隆的單抗庫。采用活細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和免疫組化法檢測(cè)這些陽性克隆與人正常肺組織切片的反應(yīng)，獲得了154株能較特異與肺癌細(xì)胞反應(yīng)而不與正常肺組織反應(yīng)的克隆。功能性的篩選發(fā)現(xiàn)了能顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、黏附的功能性抗體。這些研究結(jié)果表明本文建立和優(yōu)化的高通量制備抗腫瘤的功能性單克隆抗體庫的方法不僅可以獲得大量抗腫瘤細(xì)胞膜蛋白的單抗，還能獲得抑制腫瘤細(xì)胞各種惡性生物學(xué)行為的功能性抗體。 在臨床上使用的靶向藥物中，抗Her2 的抗體類藥物赫賽汀能夠通過抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖而明顯的抑制乳腺癌患者的肺轉(zhuǎn)移等11。腫

19、瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移取決于其侵襲能力的強(qiáng)弱，因此抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲將能夠抑制其轉(zhuǎn)移。抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力也能夠抑制腫瘤原發(fā)瘤的生長12，這可能是由于原發(fā)瘤的生長也需要瘤灶邊緣的細(xì)胞不斷向周圍侵襲的緣故。我們?cè)谀茱@著抑制肺癌增殖和侵襲的功能性單抗中分別選擇了抑制作用最強(qiáng)的單抗9C10和4E2進(jìn)行了體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果兩株單抗均能顯著抑制GLC82細(xì)胞移植瘤的生長，表明兩株單抗均有作為抑制肺癌生長和轉(zhuǎn)移單抗治療劑的潛力?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Pirozynski M. 100 years of lung cancerJ. Respir Med，2006, 100(12):20732084.2 Molina J

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