重組人白介素-18誘導(dǎo)表達(dá)ppt課件

1、高朝輝重組人白介素-18誘導(dǎo)表達(dá),純化與免疫印跡鑒定藥用蛋白的基因工程道路獲得目的基因質(zhì)粒重組構(gòu)建工程菌目的蛋白表達(dá)純化蛋白免疫印跡生物活性測(cè)定藥理活性藥劑學(xué)臨床運(yùn)用實(shí)驗(yàn)技術(shù)道路誘導(dǎo)培育細(xì)胞破碎電泳檢驗(yàn)純化蛋白轉(zhuǎn)膜反響免疫鑒定顯色反響誘導(dǎo)培育取2mL種子液接入100mL培育液，參與Amp (100mg/mL)至終濃度50ug/mL，在250ml搖瓶中于37猛烈培育1h。吸出1mL未經(jīng)誘導(dǎo)的培育物放在一個(gè)Ep管中，按下面步驟5和6所述進(jìn)展處置。在剩余培育物中參與IPTG100mmol/L至終濃度1mmol/L，37繼續(xù)通氣培育。在誘導(dǎo)的不同時(shí)間如0.5、1、1.5、2和3 取1mL樣品放于Ep管

2、中，室溫高速12000rpm離心2min。沉淀懸于100uL的1SDS凝膠加樣緩沖液，沸水浴加熱5min，點(diǎn)動(dòng)離心，冰上放置，待全部樣品處置完后上樣。細(xì)胞破碎培育到3h后，搜集剩余培育物，于4下4000rpm離心10min，倒置離心管，盡量去掉上清培育液。用10ml去離子水重懸菌體。超聲破碎細(xì)胞，儀器設(shè)置：功率600W、破碎5s，空閑5s，反復(fù)200次、冰浴試管，在超聲破碎的時(shí)候一直堅(jiān)持低溫。4下4000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，用10mL去離子水重懸沉淀，取50ul沉淀重懸液留樣。4下10000rpm離心20min，將上清液經(jīng)0.45um的濾膜，去除細(xì)胞碎片，將過(guò)濾液轉(zhuǎn)移

3、到新的離心管中，儲(chǔ)存于4冰箱待用，取50uL上清液留樣。用10ml去離子水重懸沉淀，取50uL重懸液留樣。純化蛋白用結(jié)合緩沖液平衡5個(gè)柱床體積，流速2ml/min。將10mL上清液上樣，流速為1mL/min，用另一離心管承接樣品，反復(fù)上樣1h，取最終流出液體50ul留樣。用結(jié)合緩沖液再洗5個(gè)柱床體積，流速2ml/min。用25mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，洗脫5個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，搜集洗脫峰50ul留樣。用50mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，洗脫5個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，搜集洗脫峰50ul留樣。用100mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，洗脫5個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，

4、搜集洗脫峰50ul留樣。用300mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，洗脫5個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，搜集洗脫峰50ul留樣。用400mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，洗脫5個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，搜集洗脫峰50ul留樣。將一切留樣樣品內(nèi)參與50uL的2SDS凝膠加樣緩沖液，混合，沸水浴加熱5min，點(diǎn)動(dòng)離心，預(yù)備上樣。用去離子水洗5個(gè)柱床體積，再用20乙醇洗3個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，將柱子封存于4冰箱保管。電泳檢驗(yàn)?zāi)z配方(單板凝膠)凝膠點(diǎn)樣去離子水丙烯酰胺Tris溶液10%SDS10%APTEMED10%分離膠2.61.7pH8.8:0.60.050.050.003 5%濃

5、縮膠1.70.5pH6.8:0.760.020.020.003第一道第二道第三道第四道第五道第六道第七道第八道第九道第十道凝膠1Marker空菌空質(zhì)粒誘導(dǎo)0h誘導(dǎo)0.5h誘導(dǎo)1h誘導(dǎo)2h誘導(dǎo)3h誘導(dǎo)4h標(biāo)準(zhǔn)凝膠2Marker沉淀包涵體二次沉上清穿透（清液）2550100300400轉(zhuǎn)膜反響取純化的目的蛋白上樣20ul，電泳上樣，120V，電泳1h，停頓電泳。要先將玻璃板撬掉才可以剝膠，將濃縮膠悄然刮去，最后將溴酚藍(lán)的前沿切下。將取下的凝膠放入轉(zhuǎn)移緩沖液中，浸泡15min。按照取下凝膠的大小，剪取等大的硝酸纖維素膜，也浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中15min。將凝膠與硝酸纖維素膜重合，在左上角剪個(gè)小口做標(biāo)志

6、。再剪取同樣大小的兩張厚濾紙，運(yùn)用之前要在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡一下，濾紙不要比凝膠和膜大，以免短路。將轉(zhuǎn)移電泳槽中的夾子翻開(kāi)，也浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。白色一面在底下，在上面墊一張海綿墊，用玻璃棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡，在墊子上墊濾紙，一手固定濾紙，一手用玻璃棒搟去其中的氣泡。接著放上硝酸纖維素膜，再放上凝膠，凝膠之上再放濾紙。濾紙，膜，凝膠和濾紙之間要對(duì)整齊。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可以合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移緩沖液中進(jìn)展。將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾子的黑面對(duì)應(yīng)陰極，夾子的白面對(duì)應(yīng)陽(yáng)極。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，將轉(zhuǎn)移電泳槽下端接上自來(lái)水，冷凝循環(huán)。翻開(kāi)電源，200mA，1.5h。將硝酸纖維素膜取出放在平皿中，參與適量麗春紅染色液，在搖床上染色5分鐘，后用流水沖掉染液。察看景象。免疫反響將膜用TBST浸濕后，移至含有封鎖液的外表皿中，室溫下，用封鎖液在搖床上搖動(dòng)封鎖過(guò)夜正面朝上。從封鎖液中取出膜，在含有TBST的外表皿中洗滌5min，反復(fù)3次。將膜正面朝上放入含有一抗的自封袋中，放入37搖床溫育1h。從封鎖袋中取出膜，在含有TBST的外表皿中洗滌5min，反復(fù)3次。將膜正面朝上放入含有二抗的自封袋中，放入37搖