重組DNA技術基礎1ppt課件

1、與基因工程學科建立相關的1、4個里程碑事件：2、3大技術發(fā)現(xiàn)/發(fā)明：第二章重組技術根底DNA組成與構造一級構造 堿基的陳列順序二級構造 DNA的雙螺旋方式高級構造 DNA的超螺旋方式核酸 分子組成DNA的分子構造一核酸的分類 90%以上分布于細胞核，其他分布于核外如線粒體，葉綠體，質粒等。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脫氧核糖核酸 核糖核酸攜帶遺傳信息，決議細胞和個體的基因型(genotype)。參與細胞內DNA遺傳信息的表達。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。.戊 糖構成RNA12345-D-呋喃核

2、糖(ribose)構成DNA-D-2-脫氧呋喃核糖 (deoxyribose)2. 堿 基嘌呤(purine) 嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine, C)尿嘧啶(uracil, U)胸腺嘧啶(thymine, T)腺嘌呤(adenine, A)鳥嘌呤(guanine, G)核苷：AR, GR, UR, CR脫氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR3. 核苷(ribonucleoside)堿基核糖脫氧核糖 銜接方式：CN 糖苷鍵堿基9 /1位 戊糖1，位 11核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脫氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP . 核苷酸(

3、ribonucleotide)核苷脫氧核苷磷酸磷酸酯鍵5端3端. 核苷酸的銜接 ，磷酸二酯鍵CGA二、核酸的一級構造定義： 核酸中核苷酸的陳列順序堿基序列。5端3端CGAA G P5 P T PG PC PT P OH 3 書寫方法5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3豎式橫式簡化式DNA的空間構造一、DNA的二級構造一雙螺旋構造DNA雙螺旋構造模型要點 Watson, Crick, 1953兩條DNA單鏈分子反向平行環(huán)繞，右手螺旋走向，外表大溝與小溝相間。螺旋直徑為2nm， 主鏈：戊糖 磷酸骨架位于外側 側鏈：堿基對位于內側堿基平面垂直于螺旋軸 堿基距：0.3

4、4nm； 螺距： 3.4nm； 周長：1 0對堿基。堿基構成氫鍵配對，配對方式為：A=T; GC 。堿基互補配對 TACG穩(wěn)定要素：1.氫鍵維持橫向穩(wěn)定性，2.堿基堆積力維持縱向穩(wěn)定性。3.介質中陽離子可以有效地屏蔽磷酸基之間的靜電斥力 二與DNA堿基順序相關的特殊構造 堿基順序顛倒反復而具有2倍對稱的DNA段落 鏡像反復序列 tsDNA是在DNA雙螺旋構造的根底上構成的，三條鏈均為同型嘌呤homopurine，Hpu或同型嘧啶homopyrimidine，Hpy，即整段的堿基均為嘌呤或嘧啶。三三股螺旋DNAtsDNA,也稱H-DNA Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中穩(wěn)定，較多見 (四) 酶

5、活性DNA1995年Cuenoud等發(fā)現(xiàn)了具有酶活性的DNA，再次豐富了酶學。 Cuenoud根據(jù)共有序列設計并合成了由47個核苷酸組成的單鏈DNA-E47，以此銜接兩個底物DNAS1和S2 二、DNA的超螺旋構造及其在染色質中的組裝一DNA的超螺旋構造超螺旋構造(superhelix 或supercoil)DNA雙螺旋鏈再環(huán)繞即構成超螺旋構造。 正超螺旋(positive supercoil)環(huán)繞方向與DNA雙螺旋方同一樣 負超螺旋(negative supercoil)環(huán)繞方向與DNA雙螺旋方向相反 意義DNA超螺旋構造整體或部分的拓撲學變化及其調控對于DNA復制和RNA轉錄過程具有關鍵作

6、用。 二原核生物DNA的高級構造三DNA在真核生物細胞核內的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質構成，其根本單位是 核小體(nucleosome)。 DNA：約200bp 組蛋白：H1 , H2A, H2B, H3, H4核小體的化學組成RNA的構造Structure of RNARNA的種類、分布、功能mRNArRNAtRNA一 、mRNA的構造與功能hnRNA 內含子(intron)mRNA 外顯子(exon)* 真核細胞mRNA構造特點5末端有甲基化鳥苷帽子構造：m7GpppNm- 2. 3末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。帽子構造促進mRNA由胞核向胞質的轉位維持mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始

7、的調控 帽子構造和多聚A尾的功能* mRNA的功能 把DNA的堿基序列翻譯成蛋白質的氨基酸順序。DNAmRNA蛋白轉錄翻譯原核細胞 細胞質細胞核DNA內含子外顯子轉錄轉錄后剪接轉運mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細胞 * tRNA的一級構造特點 含 1020% 稀有堿基，如 DHU 3末端為 CCA-OH 5末端大多數(shù)為G 具有 TC 二、轉運RNA的構造與功能* tRNA的二級構造三葉草形 氨基酸臂 DHU環(huán) 反密碼環(huán) 額外環(huán) TC環(huán)氨基酸臂額外環(huán)* tRNA的三級構造 倒L形* tRNA的功能活化、搬運氨基酸到核糖體，參與蛋白質的翻譯。* rRNA的構造三、rRNA的構造與功能* rRNA的

8、功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質生物合成的場所。 rRNA的種類真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNAS沉降系數(shù)：單位時間內的沉降速度核 酸 的 理 化 性 質The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid1. 核酸的溶解度核酸是極性分子，微溶于水，不溶于乙醇或異丙醇。DNA+蛋白質脫氧核糖核蛋白DNP： 在1 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。RNA+蛋白質核糖核蛋白RNP：在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。一、核酸的普通理

9、化性質 核酸屬于兩性電解質，但由于磷酸的酸性較強，因此總體呈現(xiàn)較強的酸性。具有較低的等電點。當溶液的pH4時，呈多負離子形狀，容易與金屬離子結合構成鹽。2. 酸堿性3. 核酸的高分子性質粘度： DNARNA dsDNA ssDNA4. 核酸的紫外吸收(OD260)單核苷酸 ssDNA(或RNA) dsDNA5.核酸的化學性質 核酸中的嘌呤和嘧啶能進展脫氨、聚合、烷基化等反響等。脫氨：CU脫氨：CUATCGAATTGCATUGAATTAC千萬年后，GC 將不復存在 聚合 紫外光誘導兩個相鄰嘧啶之間構成二聚體二、DNA的變性(denaturation)定義：在某些理化要素作用下，DNA雙鏈解開成兩

10、條單鏈的過程。方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、 酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性量變化：OD260增高粘度下降浮力密度升高 酸堿滴定曲線改動生物活性喪失DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改動DNA的紫外吸收光譜增色效應：DNA變性時其溶液OD260增高的景象。熱變性解鏈曲線：假設在延續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。 Tm：DNA變性時紫外光吸收值到達最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(melting temperature

11、, Tm)。影響Tm的要素： 1. G+C含量: G+C越高，Tm 越高 2. DNA樣品均一性： 均一的DNA樣品，Tm范圍較狹窄。 3.核酸的種類： 雙鏈RNA RNA-DNA雜交鏈 DNA雙鏈 4.溶液的離子強度 ： 離子強度高，Tm值高 。三、DNA的復性與分子雜交 DNA復性(renaturation)的定義在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一景象稱為復性。減色效應 DNA復性時，其溶液OD260降低的景象。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing) 。不同來源的核酸鏈分子復性時構成雜化雙鏈過程叫分子雜交。這種雜化雙鏈可以在

12、不同的DNA與DNA之間構成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間構成。這種景象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交(hybridization) 核酸分子雜交的運用研討DNA分子中某一種基因的位置確定兩種核酸分子間的序列類似性檢測某些專注序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術的根底 核 酸 酶 核酸酶是指一切可以水解核酸的酶核酸酶的分類根據(jù)底物不同分類DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)：專注降解DNA。RNA酶 (ribonuclease, RNase)：專注降解RNA。根據(jù)切割部位不同核酸內切酶：分為限制性核酸內切酶和非特異性限制性核酸內切酶。核酸外切酶：53或35核酸外切酶。參與DNA的合成與修復、RNA合成后的剪接等重要基因復制和基因表達