化學發(fā)光免疫技術(shù)----醫(yī)學課件

1、化學發(fā)光免疫 分析技術(shù)內(nèi) 容第一節(jié) 概述 一、發(fā)光的分類 二、化學發(fā)光產(chǎn)生的條件 三、化學發(fā)光效率 四、化學發(fā)光免疫技術(shù)的分類 五、化學發(fā)光免疫分析的非均相分離方式第二節(jié) 化學發(fā)光劑和標記技術(shù) 一、化學發(fā)光劑 二、發(fā)光劑的標記技術(shù)第三節(jié) 化學發(fā)光免疫分析的類型 一、直接化學發(fā)光免疫分析 二、化學發(fā)光酶免疫分析 三、電化學發(fā)光免疫分析 四、魯米諾氧途徑免疫分析第四節(jié) 化學發(fā)光免疫測定的臨床應(yīng)用發(fā)光免疫分析:是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標記免疫分析技術(shù)。特點： 特異性高、敏感性高、分離簡便、快速、 試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動化。第一節(jié) 概 述發(fā)光:是指分

2、子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。 光照發(fā)光：指發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)能量較高的短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復至基態(tài)時，發(fā)射出能量較低的較長波長的可見光（熒光）的過程。 生物發(fā)光：指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象 化學發(fā)光：指伴隨化學反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象一、發(fā)光的分類 （能量來源不同） 熒光素酶ATP；O2；Mg2+激發(fā)態(tài)氧化型熒光素螢火蟲熒光素光 + AMP+ O2 + CO2 +螢火蟲發(fā)光腰鞭毛蟲水母深海魚發(fā)光返 回 概念：是指伴隨化學反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學反應(yīng)

3、時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光?；瘜W發(fā)光化學發(fā)光與熒光的區(qū)別：形成激發(fā)態(tài)分子的激發(fā)能不同關(guān)鍵步驟化學發(fā)光的條件反應(yīng)必須提供足夠的能量（170300KJ/mol)化學能必須能被某種物質(zhì)分子吸收而產(chǎn)生電子激發(fā)，且有足夠的光量子產(chǎn)率大多數(shù)化學發(fā)光反應(yīng)為氧化-還原反應(yīng)化學激發(fā)發(fā)光二、化學發(fā)光產(chǎn)生的條件(首要條件)化學發(fā)光產(chǎn)生的條件步驟：化學反應(yīng)生成中間體；化學能轉(zhuǎn)化為電子激發(fā)能使中間體變成電子激發(fā)態(tài)；激發(fā)態(tài)分子輻射光子回復到基態(tài)。直接化學發(fā)光:間接化學發(fā)光:A+BC*C*

4、 C+h.A+BC*C* +DC+D*D* D+h.三、化學發(fā)光效率發(fā)光劑在反應(yīng)中的發(fā)光分子數(shù)/參加反應(yīng)的分子數(shù)由發(fā)光物質(zhì)的性質(zhì)決定四、化學發(fā)光免疫技術(shù)的分類標記物是否需要分離是否直接發(fā)光反應(yīng)模式不同標記物不同五、非均相分離方式固相分離過濾分離珠式分離順磁性顆粒分離（首選）第二節(jié) 化學發(fā)光劑和標記技術(shù) 在化學發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物一、化學發(fā)光劑（發(fā)光底物）直接化學發(fā)光劑間接化學發(fā)光劑能作為化學發(fā)光劑的條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高；物理-化學特性要與被標記或測定的物質(zhì)相匹配；能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物； 其化學發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果；在所使用的濃度范圍內(nèi)對

5、生物體沒有毒性。 1. 吖啶酯 在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。 直接化學發(fā)光劑-可直接標記抗原或抗體2三聯(lián)吡啶釕 三聯(lián)吡啶釕 RU(bpy)32+是電化學發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。 三聯(lián)吡啶釕電化學發(fā)光劑反應(yīng)原理 1、酶促反應(yīng)發(fā)光劑HRP的發(fā)光底物：魯米諾及其衍生物 ALP的發(fā)光底物：AMPPD間接化學發(fā)光劑酶 標記抗體或抗原，需酶催化后發(fā)光（1）魯米諾（最早合成） 魯米諾發(fā)光原理（2） AMPPD3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3

6、-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷2、酞箐、二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物通過活性離子氧傳遞連接的間接化學發(fā)光劑核心原理：高能態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞酞箐結(jié)構(gòu)680nm激發(fā)光離子氧200nm范圍內(nèi)二甲基噻吩衍生物紫外光Eu螯合物激發(fā)612nm光二、發(fā)光劑的標記技術(shù)通過化學反應(yīng)將發(fā)光劑連接到抗體或抗原直接偶聯(lián)：通過偶聯(lián)反應(yīng)，使標記物分子中反應(yīng)基團直接連接到被標記物分子的反應(yīng)基團上. 碳二亞胺（EDC）縮合法、過碘酸鈉氧化法、重氮鹽偶聯(lián)法 間接偶聯(lián)：用功能交聯(lián)劑在標記物和被標記物之間插入一條鏈或一個基團，使之連接成結(jié)合物 琥珀酰亞胺活化法1. 碳二亞胺（EDC）縮合法 經(jīng)縮合反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中的游離羧

7、基與發(fā)光劑中的氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵用于結(jié)構(gòu)中有羧基或氨基的標記物2. 過碘酸鈉氧化法 用于含有芳香伯胺和脂肪伯胺的發(fā)光劑不適于無糖基的蛋白質(zhì)3重氮鹽偶聯(lián)法 蛋白質(zhì)中能偶合重氮鹽的位置：酪氨酸殘基的鄰位酚羥基 組氨酸殘基的咪唑環(huán) 色氨酸殘基的吲哚環(huán)4. N-羥基琥珀酰亞胺活化法 蛋白質(zhì)分子中的羧基被活化后與發(fā)光劑的氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵 1發(fā)光劑的選擇 2被標記蛋白質(zhì)的性質(zhì) 3標記方法的選擇 4原料比 5標記率 6溫度 7純化與保存 影響標記的因素第三節(jié) 化學發(fā)光免疫分析的類型 用化學發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-發(fā)

8、光劑標記抗體復合物，加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，化學發(fā)光劑（吖啶酯）在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成比例，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。一、直接化學發(fā)光免疫分析 吖啶酯化學發(fā)光的特點 標記物：吖啶酯及其衍生物 底物： Pre-trigger（雙氧水）/trigger（氫氧化鈉）固相載體：順磁性微粒 分離：電磁場YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分離化學發(fā)光免疫分析反應(yīng)原理（雙抗體夾心法） ARCHITECT-

9、i2000化學發(fā)光微粒子免疫分析化學發(fā)光免疫測定儀 CLEIA是用參與催化某一化學發(fā)光反應(yīng)的酶標記抗原或抗體，在與待測標本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光。 由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯螅侔阉鼈儌魉椭劣嬎銠C數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。二、化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA） 化學發(fā)光酶免疫分析的特點 標記物：酶（HRP、ALP) 底物(發(fā)光劑）：HRP-魯米諾 ALP-AMPPD 固相載體：磁性微粒、塑料珠、塑料錐形小管 分離：磁場、高速離心辣根過氧化物酶標

10、記化學發(fā)光免疫分析示意圖 Vitros ECi全自動增強化學發(fā)光酶免分析儀 堿性磷酸酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖 IMMULITE 1000型全自動任選式酶放大化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)Access全自動微粒子酶放大化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng) 是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體,在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。 三、電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA） 電化學發(fā)光免疫分析的特點在電極表面因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生的特異性化學發(fā)光反應(yīng)，包括了電化學和化學發(fā)光兩個部分。電化學反應(yīng)： 三聯(lián)吡啶釕：標記抗體/抗原 TPA（三丙胺）：電子供體磁性微

11、粒子固相親和素- 生物素間接包被，使檢測的靈敏度大大提高。樣本盤型樣本架型Elecsys1010Elecsys2010E170電化學發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)（Elecsys)電化學發(fā)光免疫分析示意圖ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖ECLIA檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）ECLIA檢測流程圖二 （生物素與親和素結(jié)合）ECLIA檢測流程圖三 （磁珠吸引吸附于電極表面）ECLIA檢測流程圖四 （電極充電啟動電化學反應(yīng)）電極表面的電化學發(fā)光反應(yīng)ECLIA檢測流程圖五 （撤消磁場沖洗磁珠）四、魯米諾氧途徑免疫分析（LOCI）均相反應(yīng)模式核心原理：高能態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞兩個微粒：感光珠：內(nèi)含酞箐（魯米諾類化學發(fā)光物質(zhì)） 發(fā)光珠：內(nèi)含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物反應(yīng)基礎(chǔ)：兩種微粒相互接近的化學能量傳遞感光微粒在680nm激發(fā)光下能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為高能態(tài)離子氧在200nm范圍之內(nèi)，發(fā)光微粒中的二甲基噻吩衍生物接受高能態(tài)離子氧產(chǎn)生紫外光并激發(fā)Eu螯合物，發(fā)出612nm的光。 分別包被2個抗體發(fā)射光612 nm發(fā)光微球1O2AB激發(fā)光680 nm感光微球200nm是均相反應(yīng)的模式，反應(yīng)時間更短；反應(yīng)過程有放大效應(yīng)，發(fā)光迅速，保證了測定的敏感性；整個能量（光）的產(chǎn)生、傳遞和放大過程十分穩(wěn)定，不易受pH值、離子強度和溫度