形狀對(duì)構(gòu)建組織工程化心肌組織的影響

1、形狀對(duì)構(gòu)建組織工程化心肌組織的影響 作者：張環(huán)，常海霞，趙志敬，辛渭川 【摘要】 目的： 探索形狀（片層及條帶）對(duì)構(gòu)建工程化心肌組織（EHT）的影響. 方法： 原代心肌細(xì)胞與液態(tài)膠原，Matrigel, 2DMEM混合，注入環(huán)形槽內(nèi)形成心肌條帶，注入方形槽內(nèi)形成心肌片層，條帶和片層培養(yǎng)1 wk后行力學(xué)拉伸，繼續(xù)培養(yǎng)1 wk，行HE染色，鞣酸多彩(mason)染色，免疫組化染色以及激光共聚焦檢測(cè)等對(duì)EHT進(jìn)行評(píng)價(jià). 結(jié)果： 拉伸前，心肌片層和心肌條帶均可見(jiàn)點(diǎn)狀自發(fā)性跳動(dòng)，心肌片層拉伸后2 d 出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的一致性節(jié)律性跳動(dòng)；心肌條帶拉伸后4 d 形成肉眼可見(jiàn)的一致性跳動(dòng)，14 d 后心肌條帶仍然

2、能維持長(zhǎng)時(shí)間的跳動(dòng)，形狀和大小無(wú)明顯改變，而心肌片層在去除力學(xué)拉伸后，發(fā)生明顯的回縮，收縮力量減弱. HE 染色，mason染色，免疫組化以及激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示，EHT 拉伸后內(nèi)部細(xì)胞均勻分布,沿拉伸方向伸展, 細(xì)胞核完整，呈長(zhǎng)梭形，含有豐富肌絲，與正常成年大鼠心肌組織類似. 結(jié)論： 片層和條帶對(duì)構(gòu)建EHT各有利弊. 心肌片層易于構(gòu)建，容易移植，但構(gòu)建后生理性能不穩(wěn)定，而心肌條帶構(gòu)建后生理性能較穩(wěn)定，但構(gòu)建成功率低. 【關(guān)鍵詞】 原代心肌細(xì)胞；膠原I型；組織工程；心肌；片層；條帶 【Abstract】 AIM: To sudy the effect of shape（patch and r

3、ing）on the construction of engineered heart tissue(EHT). METHODS: Liquid collagen type I, Matrigel and 2DMEM were mixed with neonatal rat cardiac myocytes. The mixture was then infused into square molds to construct cardiac patches or infused into circular molds to construct cardiac rings. Seven day

4、s later, the EHTs were subjected to dynamic stretch for another 7 d. Light microscopy and transmission electron microscopy, routine HE staining, Masons three color staining and immunohistochemical staining were used to analyze the EHTs. RESULTS: Spontaneous beating was seen in the EHTs before stretc

5、hing. The engineered patches came to rhythmic synchronous beating at the 2nd day after stretching. The engineered cardiac rings finally came to synchronous beating at the 4th day after stretching. After 14 d, cardiac rings hadnt any changes, but cardiac patches reduced in size, and systolic force of

6、 cardiac patches dropped. HE staining, immunohistochemical staining and confocal laser scanning microscopy revealed that cardiac myocytes within EHT and construction of EHT resembled that of the native adult cardiac tissue in morphology and construction. CONCLUSION: Cardiac rings and cardiac patches

7、 have both advantages and disadvantages. Cardiac patche is easier to construct and transplant, but its physiological characteristics are unstable; cardiac rings physiological characteristics are stable, but its difficult to construct. 【Keywords】 primary cardiac myocyte; collagen type I; tissue engin

8、eering; myocardium; patch; ring 0引言 心臟疾患已成為當(dāng)今社會(huì)的頭號(hào)殺手，心肌細(xì)胞受損和缺如是心臟疾病中最常見(jiàn)的病理改變，而成年心肌細(xì)胞為高度分化的終末細(xì)胞，不能再生. 近年來(lái)針對(duì)心肌修復(fù)的研究主要集中在細(xì)胞注射治療，但隨著組織工程領(lǐng)域的發(fā)展，使工程化心肌組織（engineered heart tissue, EHT）成為可能. 與單純細(xì)胞移植治療相比，EHT具有明顯的優(yōu)勢(shì)，為此，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者們開(kāi)始了EHT的實(shí)驗(yàn)研究，以期替換已病變的心肌組織. 在這些研究中對(duì)形狀的探索研究主要包括兩種，即片層1和條帶2. 本研究應(yīng)用相同的生物支架材料，構(gòu)建了兩種形狀的EHT，以

9、探索形狀對(duì)構(gòu)建EHT的影響. 1材料和方法 1.1材料DMEM，胰酶，Matrigel基底膜基質(zhì)，Hochest33258熒光染料，鬼筆鵝膏(美國(guó)Sigma公司)；胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)；生物素標(biāo)記的羊抗小鼠試劑盒，DAB 顯色試劑盒，免疫熒光標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG (中山試劑公司)；羊抗人肌鈣蛋白 T（1100，福州邁新公司）；相差顯微鏡，激光共聚焦(Leica公司)；CO2培養(yǎng)箱(Forma公司)；鑄模裝置和單方向動(dòng)態(tài)拉伸裝置參照文獻(xiàn)3的方法自制. 出生12 d的SD乳鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）. 1.2方法 型膠原濃度的測(cè)定按照文獻(xiàn)4的方法制備膠原溶液，膠原濃度為2.

10、0 mg/mL. 1.2.2心肌細(xì)胞的分離無(wú)菌條件下取乳鼠心臟，PBS清洗，剪成約1 mm1 mm1 mm 大小，用2.5 g/L的胰酶分解消化，吹打靜置后取上清，入血清中終止消化，剩余組織重復(fù)操作至完全消化. 用200目篩網(wǎng)過(guò)濾收集液體，1000 r/min離心5 min，棄去上清，加入10 mL含100 mL/L血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)液，于 50 mL/L CO2 37培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1 h (差速貼壁)，收集液體，離心棄上清后所得細(xì)胞為心肌細(xì)胞. 1.2.3EHT的制備液態(tài) 型膠原與 2DMEM 等比例混合，用 0.1 mol/L NaOH 調(diào)為中性，再加入100 g/L的Matrig

11、el. 將終濃度為0.5108 /mL的心肌細(xì)胞與上述混合物混合，加入方形槽中5和環(huán)形槽中6，混合物總量為1 mL，其中膠原1.0 mg，其它成分按比例換算. 置于50 mL/L CO2 37培養(yǎng)箱中，混合物凝固后，加含200 mL/L血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基. 1 d 后，可見(jiàn)心肌片層和心肌條帶有明顯的回縮，加入上述培養(yǎng)液，50 mL/L CO2 37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d. 共制備20個(gè)心肌片層，20個(gè)心肌條帶. 1.2.4力學(xué)刺激EHT培養(yǎng)7 d后，套在動(dòng)態(tài)拉伸裝置的兩平行金屬圓桿上，調(diào)整間距，拉伸頻率為 60/min，繼續(xù)培養(yǎng)7 d. 1.2.5EHT的檢測(cè)培養(yǎng)14 d后，進(jìn)行以下各種

12、檢測(cè)，方法為: 肉眼及光鏡觀察片層和條帶在培養(yǎng)期間跳動(dòng)情況； HE染色片層和條帶培養(yǎng) 14 d 后酒精固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡觀察； 免疫組織化學(xué)染色 樣品經(jīng)包埋，切片，脫蠟，復(fù)水，修復(fù)，1 mL/L TritonX100, 3 mL/L H2O2的甲醇溶液孵育 10 min，封閉血清作用 15 min，加羊抗人肌鈣蛋白 T 抗體，4過(guò)夜. 加二抗，辣根標(biāo)記的鏈霉卵白素作用15 min. DAB顯色，透明，封片； 鞣酸多彩（mason） 染色 EHT樣本處理，切片脫蠟后，投入50 mL/L銨明礬液 12 min后水洗，再入 Regand 蘇木素在室溫下 5 min，950

13、mL/L酒精洗滌后，苦味酸酒精作用2 s后水洗，酸性品紅作用5 min，蒸餾水沖洗后磷鉬酸液分化，苯胺蘭作用 5 min，蒸餾水洗后再用磷鉬酸液分化 5 min，酒精脫水、二甲苯透明后封片； 激光共聚焦檢測(cè) EHT經(jīng)冰凍切片處理，抗原熱修復(fù)，1 mL/L TritonX100，3 mL/L H2O2的甲醇溶液孵育 10 min，封閉血清作用15 min，加羊抗人肌鈣蛋白T，4過(guò)夜. 避光加熒光標(biāo)記的羊抗小鼠FITC，37孵育15 min，再加鬼筆鵝膏，室溫15 min，加 Hochest33258熒光染料室溫孵育 15 min，封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察并記錄圖象. 2結(jié)果 2.1肉眼及光鏡

14、觀察構(gòu)建的 EHT 培養(yǎng)1 d后出現(xiàn)明顯的向心性回縮，鏡下觀察可見(jiàn)組織內(nèi)部致密. 心肌片層在培養(yǎng)1 d可見(jiàn)點(diǎn)狀自發(fā)性跳動(dòng)，細(xì)胞排列雜亂；在第3 日時(shí)出現(xiàn)節(jié)律不一的局部跳動(dòng)；在拉伸2 d后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的一致性節(jié)律性跳動(dòng). 心肌條帶在培養(yǎng)第 4 日時(shí)出現(xiàn)局部的節(jié)律性搏動(dòng)；在拉伸后第 4 日形成肉眼可見(jiàn)的一致性跳動(dòng)(圖1). A：培養(yǎng)1 d的心肌片層與心肌條帶(箭頭所示)；B：處于拉伸狀態(tài)的心肌片層(箭頭所示)；C：處于拉伸狀態(tài)的心肌條帶(箭頭所示). 2.2HE染色觀察HE染色結(jié)果顯示，拉伸前EHT細(xì)胞排列零亂，拉伸后EHT多數(shù)心肌細(xì)胞沿同一方向伸展，縱向排列，胞核呈長(zhǎng)梭形與天然成體心肌細(xì)胞相似(

15、圖2). A：成年大鼠心肌組織100；B：拉伸后心肌條帶200；C：拉伸后心肌片層100 2.3免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果顯示， EHT 細(xì)胞拉伸后內(nèi)部的細(xì)胞均勻分布，沿拉伸方向伸展，胞核長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核完整，胞漿較豐富(圖3). A：正常心肌抗肌鈣蛋白T400；B：拉伸后心肌條帶抗肌鈣蛋白T200；C：拉伸后心肌片層抗肌鈣蛋白T200. 圖3抗肌鈣蛋白T免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 2.4mason染色結(jié)果顯示，EHT細(xì)胞 內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞間存在適量、均勻分布的藍(lán)染的膠原，細(xì)胞質(zhì)顯示為紅色，而細(xì)胞核為黑色(圖4). 圖4mason染色結(jié)果 2.5激光共聚焦檢測(cè)在激光共聚焦顯微鏡下，可見(jiàn)構(gòu)建的心肌片層內(nèi)富含豐富

16、肌絲的心肌細(xì)胞. 肌動(dòng)蛋白顯示紅色，肌鈣蛋白 T 顯示綠色，細(xì)胞核顯示藍(lán)色，三者疊加后在藍(lán)色細(xì)胞核的周圍可見(jiàn)形成紅綠相間的肌原纖維束(圖5). 3討論 采用有節(jié)律性收縮能力的EHT條帶來(lái)移植并加固患者的心臟，有望提高患者心臟的泵血功能，特別適用于擴(kuò)張型心臟病患者. 由于EHT片層可以根據(jù)實(shí)際的需要進(jìn)行剪切，對(duì)于有房室缺損和心肌梗死患者替換和修補(bǔ)局限性的病灶較心肌條帶會(huì)更有優(yōu)勢(shì)7. EHT多變的形狀也更適用于臨床需要. A: Hochest33258(蘭色); B: 肌鈣蛋白T陽(yáng)性(綠色); C: 鬼筆鵝膏(紅色); D: A, B,C組合后效果圖. 本實(shí)驗(yàn)用溶解在酸性溶液里的鼠尾型膠原為支架材

17、料7，添加Matrigel，并對(duì)其進(jìn)行 1 wk 的動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激，mason 染色證明細(xì)胞間均勻地分布著適量的膠原，表明研究中加入的支架材料在細(xì)胞間存在并可發(fā)揮功能；HE 染色以及免疫組化顯示細(xì)胞伸展充分排列整齊，大多數(shù)呈梭形，沿組織長(zhǎng)軸排列；激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)心肌片層內(nèi)富含有豐富肌絲的心肌細(xì)胞. 這些結(jié)果均提示該方法能夠成功構(gòu)建出兩種形狀的，與正常成年大鼠心肌組織相類似的EHT. 在研究中我們發(fā)現(xiàn)，心肌片層出現(xiàn)自發(fā)性跳動(dòng)的時(shí)間要明顯早于心肌條帶，與二維培養(yǎng)中細(xì)胞出現(xiàn)跳動(dòng)的時(shí)間基本一致，說(shuō)明片層較條帶更有利于內(nèi)部心肌細(xì)胞存活以及生理功能的發(fā)揮. 這可能是因?yàn)樵谙嗤w積時(shí)，片層的表面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)要

18、大于條帶的表面積，而表面積與接觸培養(yǎng)基的細(xì)胞量直接相關(guān)8. 在研究中我們還發(fā)現(xiàn)，心肌條帶和心肌片層對(duì)構(gòu)建EHT各有利弊. 構(gòu)建心肌片層與心肌條帶相比，對(duì)環(huán)境條件的要求相對(duì)低且構(gòu)建成功率高. 這使得心肌片層在以后的應(yīng)用中具有一定的優(yōu)勢(shì). 但是，經(jīng)力學(xué)拉伸后，在保持穩(wěn)定性自發(fā)跳動(dòng)和構(gòu)建物形狀和大小的維持方面，心肌條帶要明顯優(yōu)于心肌片層. 心肌片層在去除力學(xué)刺激后，在相對(duì)短的時(shí)間里即可發(fā)生明顯的回縮和跳動(dòng)幅度的減弱. 事實(shí)上正常生理狀態(tài)時(shí)，心腔是由三層心肌圍繞而成的空腔，在血流的不斷沖擊下，心肌組織實(shí)際上也正是在一個(gè)環(huán)形的狀態(tài)下不斷的發(fā)育成熟和行使生理功能，這可能是環(huán)形為什么比片層在生理性和形狀上都

19、較為穩(wěn)定的原因9. 目前，我們正試圖通過(guò)提前進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)移植來(lái)減緩心肌片層生理功能的這種變化，使心肌片層在移植后能夠發(fā)揮最大的生理功能. 如何提高心肌條帶的構(gòu)建和移植的成功率是以后研究中需要解決的問(wèn)題，還有待深入的研究與探討. 【參考文獻(xiàn)】 1 Shimizu T, Yamato M, Isoi Y, et al. Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel 3dimensional cell sheet manipulation technique and temperatureresponsive cell culture surfacesJ. Circ Res, 2002,91(6): 190-195. 2 Zimmermann WH, Eschenhagen T. Cardiac tissue engineering for replacement therapyJ. Heart Fail Rev, 2003,8(3):259-269. 3 席雨濤，馬愛(ài)群，白曉君，等. 培養(yǎng)心肌細(xì)胞牽張刺激裝置的建立及應(yīng)用J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003,24(3):285-286. 4 王亭忠，席雨