這版中國(guó)藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程

1、這版中國(guó)藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程1.1無菌操作要求 1.1.1 接種細(xì)菌時(shí)必須穿工作服、戴工作帽。 1.1.2專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。 1.1.3 接種樣品時(shí)，應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手，然后用75酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?1.1無菌操作要求1.1.4 進(jìn)行接種所用的吸管，平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點(diǎn)燃燒灼三次后使用。 1.1.5 從包裝中取出吸管時(shí)，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時(shí)，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。 1.1無菌操作要求1.1.6 接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須

2、在酒精燈旁操作，接種細(xì)菌或樣品時(shí)，吸管從包裝中取出后及打開試管塞（即硅氟膠塞）都要通過火焰消毒。 1.1.7 接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時(shí)還要燒到環(huán)和針與桿的連接處。 1.1.8 吸管吸取菌液或樣品時(shí)，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。1.2無菌間使用要求 1.2.1無菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作臺(tái)面，不得存放與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的物品。 1.2.2無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈，照射時(shí)間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。1.3消毒滅

3、菌要求1.3.1滅菌前準(zhǔn)備 1.2.3處理和接種樣品時(shí)，進(jìn)入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。（1）所有需要滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干，玻璃器皿用紙包裝嚴(yán)密，如用金屬筒應(yīng)將上面通氣孔打開。（2）裝培養(yǎng)基的三角瓶，內(nèi)容物不應(yīng)超過總體積的2/3（例如500mL的三角瓶最好裝300350mL培養(yǎng)基，以防再次加熱融化時(shí)爆沸）。（3）無菌室內(nèi)使用的毛巾、脫脂棉球用紙包裹，進(jìn)行濕熱滅菌。1.3.2裝放（1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠，且不能接觸箱的四壁。（2）大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。1.3.3設(shè)備檢查 （1）檢查門的開關(guān)是否靈活，

4、橡皮圈有無損壞，是否平整。（2）檢查壓力表蒸氣排盡時(shí)是否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計(jì)所標(biāo)示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。（3）對(duì)有自動(dòng)電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序，是否符合于進(jìn)行滅菌處理的要求。1.3.4滅菌處理(1) 干熱滅菌法：用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。滅菌完畢后或溫度升溫過程中，須在60以下才能打開箱門。(2)立式壓力蒸氣滅菌器：待壓力恢復(fù)到零時(shí)，自然冷卻至60后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應(yīng)立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復(fù)至零，溫度降到60以下 再開蓋取物，以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破

5、。（3）物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉、包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用。培養(yǎng)基或試劑等,應(yīng)檢查是否符合達(dá)到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達(dá)到者應(yīng)廢棄。取出的物品掉落在地或誤放不潔處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用。取出的合格滅菌物品,應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi),嚴(yán)禁與未滅菌物品混放。凡屬合格物品,應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限。1.4有毒有菌污物處理要求1.4.1經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中存放在指定地點(diǎn)，待統(tǒng)一進(jìn)行高壓滅菌（經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物，必須經(jīng)12130min高壓滅菌）。1.4.2染菌后的吸管（即進(jìn)行陽性菌操作后的），使用

6、后放入5煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經(jīng)12130 min高壓滅菌。有毒有菌污物處理要求1.4.3涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，強(qiáng)致病菌的沖洗液必須沖在燒杯中，經(jīng)高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗滌。做凝集試驗(yàn)用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。1.4.4打碎的培養(yǎng)物，立即用5煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時(shí)后再擦拭干凈。有毒有菌污物處理要求1.4.5污染的工作服或進(jìn)行強(qiáng)致病菌試驗(yàn)所穿的工作服、帽、口罩等，應(yīng)放入專用消毒袋內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。 1.5培養(yǎng)基制備要求1.5.1

7、根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱取（可根據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進(jìn)行），然后溶于蒸餾水中，在使用前對(duì)應(yīng)用的試劑藥品應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。1.5.2因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的PH降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多，以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量。有毒有菌污物處理要求1.5.3盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器（三角燒瓶）為好。1.5.4每批培養(yǎng)基制備好后，應(yīng)做無菌生長(zhǎng)試驗(yàn)（空白平皿試驗(yàn)）及所檢菌株生長(zhǎng)試驗(yàn)。如果是生化培養(yǎng)基，使用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種培養(yǎng)，觀察生化反應(yīng)結(jié)果，應(yīng)呈正常反應(yīng)，培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過久，必要時(shí)可置4冰箱存放。2.實(shí)驗(yàn)操作2.1準(zhǔn)備用具，配制培養(yǎng)基、稀釋液、培養(yǎng)箱2.1.1用具：1

8、50mL三角燒瓶 試管 1mL移液管 10mL移液管 2.1.2培養(yǎng)基：需氧菌菌總數(shù) 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、霉菌和酵母菌總數(shù) 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基控制菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基麥康凱液體培養(yǎng)基RV沙門增菌液體培養(yǎng)基接種平板 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)操作2.1.3稀釋液：0. 9%無菌氯化鈉溶液2.1.4培養(yǎng)箱：3個(gè)（3035、2025、4244）2.2培養(yǎng)基配制2.3滅菌2.4無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)24至48小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。2.5無菌室準(zhǔn)備：用消毒液擦拭無菌室，將本次試驗(yàn)所用的器皿、培養(yǎng)基通過

9、傳遞窗送到無菌室，樣品置于傳遞窗，一次性使用物料（工作服、口罩、手套）置于緩沖間。開啟凈化系統(tǒng)1小時(shí)，關(guān)閉凈化系統(tǒng)，打開紫外燈0.5小時(shí)，關(guān)閉紫外燈，至少0.5小時(shí)后進(jìn)入無菌室。2.6微生物計(jì)數(shù)檢驗(yàn)（平皿傾注法）2.6.1供試液制備2.6.1.1稱取樣品：一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml;膜劑為100cm2; 貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2 個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4 丸，膜劑還不得少于4 片。2.6.1.2稀釋液制備：0. 9%無菌氯化鈉溶液Title and content layout (Text page)2.6.2平皿的制備：3個(gè)稀

10、釋級(jí)（常用10-1、10-2、10-3）（每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2 個(gè)平板），同時(shí)做空白（等量稀釋劑）供試液用量為適應(yīng)性試驗(yàn)確定的，常用1ml2.6.3加入培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基，融化并讓其冷卻至45左右，傾入已加入供試液的平皿中，每個(gè)平皿約15mL（即傾倒時(shí)液面剛剛閉合時(shí)），在超凈臺(tái)面上輕輕晃動(dòng)使供試液均勻混合于培養(yǎng)基中，放置一旁待冷卻凝固。2.6.4培養(yǎng)：待平皿完全冷卻凝固，通過傳遞窗取出，倒置疊放置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)時(shí)間及溫度：需氧菌菌總數(shù) 3035培養(yǎng)35 天霉菌和酵母菌總數(shù) 2025培養(yǎng)57 天，2.7控制菌檢驗(yàn)2.7.1供試液制備：取供試品10g，用稀釋劑制成1 : 10供試液，混勻，

11、在2025培養(yǎng)約2小時(shí)(可以在無菌室中先做這一步，等其余試驗(yàn)步驟完成，再繼續(xù)進(jìn)行控制菌的下一步)。耐膽鹽革蘭陰性菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基大腸埃希氏菌 0. 9%無菌氯化鈉溶液沙門菌 直接取樣品10g或10ml2.7.2預(yù)培養(yǎng)（增菌培養(yǎng)）：取供試液10mL（相當(dāng)于1g樣品），加在 ml增菌液體培養(yǎng)基（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）中，3035培養(yǎng)2448小時(shí)。耐膽鹽革蘭陰性菌 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基大腸埃希氏菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基沙門菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基2.7.3選擇和分離培養(yǎng)2.7.3.1耐膽鹽革蘭陰性菌：取相當(dāng)于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml和0.001tnl)

12、供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，303 5培養(yǎng)244 8小時(shí)。2.7.3.2大腸埃希氏菌：l ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244培養(yǎng)244 8小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)2.7.3.3沙門菌：0.1 ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)182 4小時(shí)。2.7.4平板劃線分離培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基平板的準(zhǔn)備：取培養(yǎng)基，融化并讓其冷卻至50左右，傾入滅菌平皿中，每個(gè)平皿約15mL，使其分布均勻，冷卻凝固后即為固體平板培養(yǎng)基。耐膽鹽革蘭陰性菌 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基大腸埃希氏菌 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基沙門菌 木糖賴氨酸脫氧

13、膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（2）各種物品的準(zhǔn)備取出預(yù)培養(yǎng)后的控制菌供試液，置于工作臺(tái)上；接種前準(zhǔn)備好酒精燈、一次性接種針、火柴、酒精棉球、試管架等。可在陽性菌室或無菌室操作，無菌室準(zhǔn)備工作相同。（3）平板劃線以左手持平板，中指、無名指和小指托著平板底,拇指和食指打開上蓋，使蓋與底成30角，以便劃線。Title and content layout (Text page)右手握一次性接種針，把接種針上的菌液涂在培養(yǎng)基一側(cè)，一般作5-8次劃線。將環(huán)上的多余細(xì)菌材料燒掉后，從第1次劃線引出第2次劃線；再?gòu)牡?次劃線引出第3次劃線，如此反復(fù)3-4次劃線后，即可把整個(gè)平板表面劃滿，注意每一次劃線只能與上一次劃線重

14、疊，這樣就可在最后的1-2次劃線上出現(xiàn)多量的單個(gè)菌落，以便進(jìn)行純培養(yǎng)。Title and content layout (Text page)2.7.4培養(yǎng)：接種后的平板倒置疊放置于培養(yǎng)箱中，3035培養(yǎng)1824小時(shí)。2.8培養(yǎng)物的觀察2.8.1需氧菌總數(shù)：每天觀察菌落的生長(zhǎng)情況，如數(shù)目多，應(yīng)及時(shí)點(diǎn)計(jì)。2.8.2霉菌和酵母菌總數(shù)：每天觀察菌落的生長(zhǎng)情況，如數(shù)目多，應(yīng)及時(shí)點(diǎn)計(jì)。2.8.3大腸埃希菌：每天觀察菌落的生長(zhǎng)情況。2.8.4沙門氏菌：菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。如有疑似菌落則用接種針挑選于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)182 4小時(shí)，或采用其

15、他適宜方法進(jìn)一步鑒定。3.數(shù)據(jù)報(bào)告3.1平皿法：點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)，計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。3.2控制菌3.2.1耐膽鹽革蘭陰性菌：紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，則對(duì)應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2查l g 或lm l供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。3.2.2大腸埃希菌：若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊

16、脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。3.2.3沙門菌：若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長(zhǎng)，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色（或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。Title and content layout (Text page)3.3報(bào)告規(guī)則：需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜

17、選取平均菌落數(shù)小于l00cfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。取最髙的平均菌落數(shù)，計(jì)算lg 、lmL或10cm2供試品中所含的微生物數(shù)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1 時(shí)，以 1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。3.4結(jié)果判斷：10 cfu：可接受的最大菌數(shù)為20100cfu：可接受的最大菌數(shù)為2001000cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000，依此類推Title and content layout (Text page)3.5限度標(biāo)準(zhǔn)：3.5.1不含中藥原粉的口服中藥制劑：需氧菌總數(shù) 103cfu（2000） 102cfu（2

18、00）霉菌和酵母菌總數(shù) 102cfu（200） 101 cfu（20）大腸埃希菌 不得檢出沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出3.5.2含中藥原粉的口服中藥制劑3.5.2.1不含發(fā)酵原粉需氧菌總數(shù) 104cfu（20000） 5102cfu（1000）霉菌和酵母菌總數(shù) 102cfu（200） 102 cfu（20）大腸埃希菌 不得檢出Title and content layout (Text page)沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌 1003.5.2.2含發(fā)酵原粉需氧菌總數(shù) 105cfu（200000） 103cfu（2000）霉菌和酵母菌總數(shù) 5100cfu（1000） 100 cfu（200）大腸埃希菌 不得檢出沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌 104.實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排4.1第一天：準(zhǔn)備用具、培養(yǎng)基、稀釋劑，滅菌4.2第二天：準(zhǔn)備無菌室（預(yù)計(jì)2小時(shí)），檢驗(yàn)（無菌室操作預(yù)計(jì)3小時(shí)），平皿冷卻（夏季預(yù)計(jì)2小時(shí)，冬季預(yù)計(jì)1小時(shí)），移出無菌室進(jìn)行培養(yǎng)（預(yù)計(jì)0.5小時(shí)）4.3第三天：觀察培養(yǎng)物（需氧菌菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)第一天），耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門氏菌的預(yù)培養(yǎng)結(jié)束，進(jìn)行分離培養(yǎng)操作，準(zhǔn)備培