DB33_T 2287-2020羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1 檢測(cè)規(guī)程(高清正版）

1、ICS 65.020.30CCS B 41DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/T 22872020羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1 檢測(cè)規(guī)程Detection protocols for Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-12020 - 11 - 30 發(fā)布2020 - 12 - 30 實(shí)施浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布DB33/T 22872020 PAGE * ROMAN II前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)件由浙江省水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)

2、起草單位：浙江省淡水水產(chǎn)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：潘曉藝、沈錦玉、藺凌云、姚嘉赟、尹文林、曹錚、劉憶瀚、夏炎春。引言本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意如下事實(shí)，聲明符合本標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可能涉及到6.10-6.11中引物與羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《救蚪M序列及其應(yīng)用(專(zhuān)利號(hào)：201110296487.9)專(zhuān)利權(quán)的使用。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)對(duì)于該專(zhuān)利的真實(shí)性、有效性和范圍無(wú)任何立場(chǎng)。該專(zhuān)利持有人已向本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)保證，他愿意同任何申請(qǐng)人在合理且無(wú)歧視的條款和條件下， 就專(zhuān)利授權(quán)許可進(jìn)行談判。該專(zhuān)利持有人的聲明已在本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過(guò)以下聯(lián)系方式獲得：專(zhuān)利持有人：浙江省淡水水產(chǎn)研究所地址：浙江省湖州市吳

3、興區(qū)杭長(zhǎng)橋南路999號(hào)請(qǐng)注意除上述專(zhuān)利外，本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容仍可能涉及專(zhuān)利。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。DB33/T 22872020 PAGE 9羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1 檢測(cè)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)確立了羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1的檢測(cè)程序，規(guī)定了術(shù)語(yǔ)與定義、縮略語(yǔ)、羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1檢測(cè)程序的構(gòu)成、試劑和材料、器材與設(shè)備、操作步驟和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1的檢測(cè)及關(guān)聯(lián)疾病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和監(jiān)測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版

4、本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB 19489 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求SC/T 7103 水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范SC/T 7202.1 斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒病診斷規(guī)程 第1部分：壓片顯微鏡檢查法術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1 Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-1羅氏沼蝦幼體死亡綜合征的主要病毒性病原，又稱(chēng)為羅氏沼蝦太湖病毒（Macrobrachium rosenbergiitaihu virus，MrTV），屬于小RNA病毒目、雙順?lè)醋硬《究啤?/p>

5、急麻病毒屬，病毒粒子為無(wú)囊膜的直徑約30 nm的二十面體球形顆粒，核酸類(lèi)型為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約10.3 kb。其主要侵染羅氏沼蝦幼體甲殼下上皮組織和神經(jīng)節(jié)，造成肝臟和結(jié)締組織出現(xiàn)強(qiáng)嗜堿性細(xì)胞質(zhì)包涵體。縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。bp：堿基對(duì)（Base pair）DEPC：焦乙酸二乙酯（Diethyl pyrocarbonate） DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）dATP：脫氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine triphosphate） dCTP：脫氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine triphosphate） dGTP：脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸（De

6、oxyguanosine triphosphate） dNTP：脫氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate）dTTP：脫氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine triphosphate） EB：溴化乙啶，核酸染色劑（Ethidium bromide）MrDV-1: 羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1（Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-1） MrTV：羅氏沼蝦太湖病毒（Macrobrachium rosenbergii taihu virus）M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemi

7、a virus） RdRp：RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase） RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid）RNasin：核糖核酸酶抑制劑（RNase inhibitor）RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription polymerase chain reaction）Taq：水生噬熱桿菌（Thermus aquaticus）羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1 檢測(cè)程序的構(gòu)成羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1檢測(cè)程序包括5 個(gè)階段，其中RT-PCR操作階段又分3 個(gè)步驟。程序流程圖見(jiàn)圖1。圖 1 羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1

8、檢測(cè)程序流程圖試劑和材料水：符合 GB/T 6682-2008 中一級(jí)水的要求，核酸抽提和 RT-PCR 應(yīng)使用無(wú)RNA 酶的去離子水。dNTPs：含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 10 mmol/L 的混合物，20 保存。RNA 酶抑制劑：40 U/L，20 保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶：200 U/L，20 保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。5 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液：20 保存。10 PCR 緩沖液：20 保存。Taq DNA 聚合酶：5 U/L，20 保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)：DNA Marker DL2000，2

9、0 保存。瓊脂糖：電泳級(jí)。RT-PCR 外引物：MrTV572F1：5-ATGTA-GAGCG-TGGAG-GAGTA-AAA-3， MrTV572R1：5-CACTA-TCTCT-GTCTT-CGAGG-GATT-3，擴(kuò)增RdRp基因的572 bp片段。RT-PCR 內(nèi)引物：MrTV472F2：5-TGCTT-CTATT-TCGGC-TCG-3， MrTV472R2：5-CAACG-AATTA-GGGAG-AGG-3，擴(kuò)增RdRp基因的472 bp片段。陽(yáng)性對(duì)照為已知受MrTV 感染且 RT-PCR 結(jié)果顯示強(qiáng)陽(yáng)性的蝦組織，80 保存。陰性對(duì)照為已知未受 MrTV 感染且 RT-PCR 結(jié)果

10、顯示陰性的蝦組織，80 保存?？瞻讓?duì)照為無(wú) RNA 酶的水。器材與設(shè)備普通冰箱。超低溫冰箱：最低可設(shè)定溫度86 。組織研磨器。生物安全柜或超凈工作臺(tái)。低溫高速離心機(jī)：溫度可設(shè)置范圍 0 40 ，最高可設(shè)定轉(zhuǎn)速15 000 轉(zhuǎn)/分鐘?？煽販厮″伝蚣訜崮K。微量移液器。PCR 儀。電泳儀。水平電泳槽。紫外透射儀或凝膠成像儀。微波爐。操作步驟樣品的準(zhǔn)備樣品采集的要求和數(shù)量按SC/T 7103和SC/T 7202.1的規(guī)定。鮮活幼體、仔蝦及體長(zhǎng)在3 cm以下稚蝦個(gè)體樣品約30 mg50 mg (去掉稚蝦眼)；成蝦取約30 mg50 mg鰓絲或游泳足。所取樣品分別置于1.5 mL無(wú)RNA酶微量離心管中

11、，立即進(jìn)行RNA提取操作或加入1 mL TRIzol試劑， 充分研磨后，暫時(shí)保存于20 。RNA 模板的提取在樣品管中加入 1 mL TRIzol試劑，用研磨器研磨，置室溫 5 分鐘后，加入 0.2 mL 氯仿，震蕩混勻 15 秒，室溫放置 5 分鐘。于 4 下，12 000 轉(zhuǎn)/分鐘 離心 10 分鐘，取上層水相，移至一支無(wú)RNA 酶的離心管中。加 0.5 mL 異丙醇，混勻，置室溫 10 分鐘。于 4 下，12 000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 10 分鐘，盡棄上清。加入20 預(yù)冷的 1 mL 無(wú) RNA 酶 70%乙醇（無(wú) RNA 酶 70%乙醇的配制按附錄 A 中 A.1 進(jìn)行），振搖 1 分鐘，

12、再于 4 下，12 000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 5 分鐘，盡棄上清。敞口離心管，于超凈工作臺(tái)中室溫晾干沉淀。加入 30 L50 L 無(wú) RNA 酶的水（無(wú) RNA 酶的水的配制按附錄 A 中 A.2 進(jìn)行） 溶解 RNA 沉淀，立即用于 RT-PCR 或保存于80 備用。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。RNA 操作時(shí)外源性RNA 酶消除方法按附錄 B 進(jìn)行。個(gè)人防護(hù)和實(shí)驗(yàn)室安全行為等應(yīng)按 GB 19489 執(zhí)行。也可采用等效商業(yè)化的 RNA 抽提試劑盒。RT-PCR 操作cDNA 合成對(duì)每一份樣品，在一支無(wú)RNA酶的0.2 mL PCR管中，加入1.5 L 10 M引物MrTV572R1，2.

13、5 L無(wú)RNA酶水和2 L待測(cè)樣品RNA模板?；靹蚝螅噪x心，置于70 ，10 分鐘，然后立即置于冰中。加入2L 5 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、1 L RNasin (40 U/L)、0.5 L 10 mmol/L dNTPs、0.5 L M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/L)，42 保溫1 小時(shí)，以合成cDNA，然后于80 中5 分鐘后，迅速置于冰中。第一輪PCR 擴(kuò)增對(duì)每一份樣品，取一支無(wú)RNA酶的0.2 mL PCR管，加入2.5 L 10PCR緩沖液、0.5 L 10 mmol/L dNTPs、0.5 L 10 M引物MrTV572F1、0.5 L 10 M引物MrTV572R1、0.

14、5 L Taq DNA聚合酶(5 U/L)、18.5 L無(wú)RNA酶水和2 L 8.3.1步驟的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，最終反應(yīng)體系為25 L。在PCR后區(qū)，置于PCR儀中， 按以下程序進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增：a) 95 預(yù)變性 3 分鐘；b) 94 變性 30 秒62 退火 30 秒72 延伸 40 秒，35 個(gè)循環(huán)；c) 72 延伸 7 分鐘。第二輪PCR 擴(kuò)增對(duì)每一份樣品，取一支無(wú)RNA酶的0.2 mL PCR管，加入5 L 10PCR緩沖液、1 L 10 mmol/L dNTPs、L 10 M引物MrTV472F2、0.5 L 10 M引物MrTV472R2、1 L Taq DNA聚合酶(5 U/L)

15、、41.0 L 無(wú)RNA酶水，最后加入1 L 8.3.2步驟的擴(kuò)增產(chǎn)物，最終反應(yīng)體系為50 L。在PCR后區(qū)，置于PCR儀中， 按以下程序進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增：95 預(yù)變性 3 分鐘；b) 94 變性 30 秒62 退火 30 秒72 延伸 40 秒，35 個(gè)循環(huán)；c) 72 延伸 7 分鐘。8.4 瓊脂糖電泳用1電泳緩沖液（1電泳緩沖液的配制按附錄A中A.3進(jìn)行）配制2%的瓊脂糖凝膠（含0.5 g/mL EB，按附錄A中A.4稀釋20000 倍配制而得；或其他等效商品化試劑）。將其放入水平電泳槽中，使電泳緩沖液剛好淹沒(méi)膠面，將5 L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和1 L 6載樣緩沖液（6載樣緩沖液配制按附

16、錄A中A.5 進(jìn)行）混勻后加入樣品孔，在電泳時(shí)設(shè)立DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。5 V/cm電泳約0.5 小時(shí)，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止，在紫外透射儀或凝膠成像儀下觀(guān)察并拍照記錄。結(jié)果判定陽(yáng)性對(duì)照第一輪 PCR 后在 572 bp 和/或第二輪 PCR 在 472 bp 處有特異條帶，陰性對(duì)照在 572 bp 和 472 bp 處均無(wú)條帶，且空白對(duì)照不出現(xiàn)任何條帶，實(shí)驗(yàn)有效。否則，應(yīng)在排除故障和清除污染后， 重新取樣檢測(cè)。當(dāng)被檢樣品第一輪PCR 產(chǎn)物在 572 bp 處有條帶和/或第二輪 PCR 后在 472 bp 處有特異條帶，且PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果同參考序列（參見(jiàn)附錄 C）相符的，可判定為套式 PCR

17、結(jié)果陽(yáng)性。當(dāng)被檢樣品第一輪PCR 產(chǎn)物未見(jiàn)大小為 572 bp 條帶且第二輪 PCR 產(chǎn)物未見(jiàn)大小為 472 bp 的條帶， 或經(jīng)測(cè)序確定不是MrDV-1 的，可判定為套式PCR 結(jié)果陰性。電泳結(jié)果分析和問(wèn)題排除方法見(jiàn)表 1。表1 套式 RT-PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果判讀及原因分析對(duì)應(yīng)原因的問(wèn)題排除羅氏沼蝦樣品第一輪PCR擴(kuò)增：陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性樣品在572 bp處會(huì)有特定條帶；陰性對(duì)照在572 bp處無(wú)任何條帶，以無(wú)RNA酶水為模板設(shè)立的空白對(duì)照無(wú)任何條帶出現(xiàn)。第二輪PCR擴(kuò)增：陽(yáng)性對(duì)照在472 bp處會(huì)有特定條帶出現(xiàn)；陽(yáng)性樣品在472 bp處會(huì)有特定條帶出現(xiàn)；陰性對(duì)照在472 b

18、p處無(wú)任何條帶，以無(wú)RNA酶水為模板設(shè)立的空白對(duì)照無(wú)任何條帶出現(xiàn)。1 RT-PCR反應(yīng)正常，結(jié)果有效。陽(yáng)性對(duì)照有條帶，但分子量標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有影像。1 分子量標(biāo)準(zhǔn)失效或加樣量太少。1. 更換分子量標(biāo)準(zhǔn)或增加其加樣量。分子量標(biāo)準(zhǔn)有影像，但陽(yáng)性對(duì)照無(wú)條帶。套式RT-PCR反應(yīng)失敗。陽(yáng)性對(duì)照失效。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成份抑制PCR。檢查逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，并更換所用試劑，糾正出錯(cuò)程序。更換陽(yáng)性對(duì)照，重新實(shí)驗(yàn)。稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或純化cDNA。陰性對(duì)照組或空白對(duì)照組在第一次PCR擴(kuò)增后572 bp處有特定條帶；第二次PCR擴(kuò)增后在472 bp處有條帶出現(xiàn)。微量移液器污染。試劑污染。環(huán)境污染。操作污染。清洗微量移液器，只能用

19、PCR后區(qū)的微量移液器跑電泳。更換試劑。清潔實(shí)驗(yàn)室及所用儀器設(shè)備。不得從PCR后區(qū)到PCR前區(qū)的交流， 加強(qiáng)操作隔離。表 1 套式 RT-PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果分析（續(xù)）實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果判讀及原因分析對(duì)應(yīng)原因的問(wèn)題排除陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組正常，但已知帶毒樣品無(wú)條帶。RNA模板降解或提取RNA失敗。逆轉(zhuǎn)錄或PCR抑制物介入。檢查與RNA接觸的試劑和用品，重新提取RNA。檢查逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑，重新合成cDNA和PCR。分子量標(biāo)準(zhǔn)正常，但陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和樣品出現(xiàn)較多雜帶或明顯的彌散區(qū)。未注意低溫操作，使PCR出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。酶活性變化、dNTPs濃度變化或10 PCR緩沖液濃度變化。反應(yīng)溫度控制

20、異常。做好低溫操作，RT-PCR全程在冰上操作。確認(rèn)預(yù)混物制備的準(zhǔn)確性、試劑質(zhì)量，10PCR緩沖液需完全溶解后使用。檢查PCR儀溫控。瓊脂糖凝膠片上無(wú)任何影像，包括DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。紫外觀(guān)察儀有故障。背景發(fā)紅太亮。凝膠太厚。電極顛倒或電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。EB分解失效。檢查紫外觀(guān)察儀。減少EB用量，將瓊脂糖凝膠置于清水中30 分鐘后再觀(guān)察結(jié)果。重新制作瓊脂糖凝膠片。改正電極方向，重新加樣電泳。重新配制溴化乙錠(EB)。附 錄 A（規(guī)范性附錄） 試劑配制方法無(wú)RNA酶的 70%乙醇無(wú)水乙醇(新開(kāi)瓶)70 mL加入無(wú)RNA酶的水30 mL在無(wú)RNA酶的玻璃量筒中配制，混勻，按1.0 mL/支分裝于無(wú)RNA

21、酶的1.5 mL微量離心管中，保存于20 待用。無(wú)RNA酶的水水1000 mLDEPC1 mL蓋上瓶塞，用磁力攪拌器于37 劇烈攪拌12 小時(shí)，按50 mL/瓶200 mL/瓶分裝于無(wú)RNA酶的試劑瓶?jī)?nèi)，透氣高壓蒸汽滅菌15 分鐘，冷卻后密封保存。DEPC有毒，應(yīng)避免吸入、吞食和沾著皮膚，操作在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。1 電泳緩沖液Tris4.84 g冰乙酸1.142 mL0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)2 mL加水定容至1000 mL室溫儲(chǔ)存。10 mg/mL EB貯存液EB10 mg水1 mL完全溶解后，室溫保存于棕色瓶中。6 載樣緩沖液蔗糖40 g加水溶解，定容至100 mL溴酚藍(lán)0.

22、25 g溶解后，4 儲(chǔ)存。附 錄 B（規(guī)范性附錄）外源性 RNA 酶污染消除方法一般介紹在RNA操作過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格防止RNA酶污染。外源性的RNA酶污染是指來(lái)自于水、玻璃制品、塑料器皿、電泳槽、操作人員和微生物等?？赏ㄟ^(guò)DEPC、氯仿、干熱烘烤等方法來(lái)消除。本附錄主要介紹外源性RNA酶的消除方法。對(duì)DEPC、酚和胍鹽等有毒或有腐蝕性物質(zhì)，采取措施避免吸入、吞食和沾著皮膚；處理DEPC和氯仿的操作均應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。溶液配制直接用于RNA操作的所有水或無(wú)機(jī)鹽溶液都應(yīng)加入DEPC至終濃度0.1%，攪拌12 小時(shí)，然后經(jīng)121 高壓蒸汽滅菌15 分鐘。不能用DEPC處理的試劑(如含有Tris的溶液)

23、或者不能經(jīng)高壓蒸汽滅菌的試劑， 應(yīng)使用經(jīng)DEPC處理的水配制，然后經(jīng)無(wú)RNA酶的0.22 m微孔濾膜過(guò)濾除菌。玻璃制品玻璃器皿洗凈后，在180 烘烤4 小時(shí)可徹底除去器皿上沾污的RNA酶。不得用任何在180 下可燃燒、變性或融化的材料包裹器皿。金屬制品也可按玻璃制品的辦法處理。聚丙烯塑料制品聚丙烯塑料制品可在通風(fēng)櫥內(nèi)用氯仿漂洗，晾干后再經(jīng)高壓蒸汽滅菌，最后烘干。也可在加有0.1%DEPC的水中浸泡12 小時(shí)，然后經(jīng)高壓蒸汽滅菌，最后烘干?？少?gòu)買(mǎi)無(wú)RNA酶的一次性塑料制品，如塑料離心管、PCR管、槍頭等，直接使用。人工操作處理RNA的全部操作應(yīng)戴無(wú)RNA酶的塑料或乳膠的一次性手套，同時(shí)避免因交談或其它活動(dòng)造成的飛沫、落塵帶入RNA酶的污染，必要的情況下戴口