《層析分離方法》word版

1、層析分離方法概 述 層析法是一種使不同分子相互分離的過程，當(dāng)一混合樣品被導(dǎo)入一固定相的支持體中，而另一流體(移動相)通過時，由于樣品各組分與固定相和移動相相互作用的大小不同，使各組分通過固定相支持體的速率不同而得分離。層析法的特點：能分離一系列結(jié)構(gòu)較為相似的成分，以達到一般分離方法難以達到的目的。 層析常見種類及用途:a.柱層析分離量較大，主要用于分離制備；b.薄層層析主要用于分析鑒定,也可用于半微量制備。c.紙層析主要用于分析鑒定，也可用于半微量制備。 層析法按分離原理大體上又可以分為(1) 吸附層析(利用吸附能力的差別進行分離)，常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等；(2) 分配層析(利用

2、在二種不互溶的溶劑中分配比不同進行分離)，常用的支持劑為硅膠、硅藻土、纖維粉等，反相硅膠(鍵合硅膠)、液滴逆流層析則是分配層析與逆流分溶的發(fā)展；(3) 離子交換層析(利用離子解離強度不同進行分離)，常用的離子交換樹脂有強酸性(磺酸型)、強堿性(季胺型)、弱酸性(羧酸型)、弱堿性(三級胺型)；(4) 電泳(利用電流通過時，離子趨電性不同進行分離)，常用的有紙電泳、瓊脂電泳、凝膠電泳。(5) 其他有氣體層析、凝膠層析、親和層析等， 層析方法的選擇：非極性的成分常選擇氧化鋁或硅膠吸附層析；極性較大則采用分配層析或弱吸附劑吸附層析；酸性、兩性成分可用離子交換層析，有時也可用吸附層析及分配層析。 各類化

3、合物適宜的層析方法：a. 一般生物堿的分離可用硅膠或氧化鋁層析，對極性較高的生物堿也可用分配層析，而對季胺型水溶性生物堿也可用分配層析或離子交換層析。b. 甙類的層析分離往往決定于甙元的性質(zhì)，如皂甙、強心甙，一般可用分配層析或硅膠吸附層析。 c. 芳香油、甾體、萜類(結(jié)合成甙除外)包括萜類內(nèi)酯，往往首選氧化鋁及硅膠層析，若在氧化鋁柱上有次級反應(yīng)，則宜用硅膠吸附層析。 d. 黃酮體、單寧等多元酚衍生物可用聚酰胺吸附層析。 e. 有機酸、氨基酸一般可選用離子交換層析，有時也用分配層析，有些氨基酸也可用活性炭吸附層析。f. 多肽、多糖等大分子化合物，常用凝膠層析、親和層析、反相硅膠（鍵合硅膠）。第一

4、部分 柱層析第一章 硅膠層析層析用硅膠層析用硅膠一般以SiO2xH2O表示，系多孔性的硅氧環(huán)Siloxane(a)交鏈結(jié)構(gòu)，由于其骨架 表面具有很多硅醇Silanol(b)基團，能吸著多量水分，此種水分幾乎成游離狀態(tài)存在，因此當(dāng)加熱至100左右能可逆地被除去。硅膠的活性水分含量有關(guān)(見表7-1)，表7-1 氧化鋁和硅膠含水量與活性的比較硅膠加入水量（%）活性氧化鋁加入水量（%）0I05II315III625IV1038IV15含水量高則吸附力減弱，當(dāng)游離水含量高達17%以上，吸附能力降低，而可作為分配層析載體。硅膠于500加熱能不可逆地失去結(jié)合水(一般170以上即有少量結(jié)合水失去)，從硅醇結(jié)構(gòu)

5、變成硅氧環(huán)結(jié)構(gòu)，若加熱至1,100則結(jié)合水盡失。由于硅膠的吸附能力主要與硅羥基數(shù)量有關(guān)，因此加熱溫度過高吸附能力反而降低。 有時硅膠層析具有吸附層析與分配層析的雙重性質(zhì)，甚至還有極弱的離子交換作用。 層析硅膠應(yīng)是中性無色顆粒，但是由于制作過程?？蓭в兴嵝裕绻嵝圆粡娪趐H5，一般已可使用。 商品層析硅膠合格的判定PH值一般先檢查其是否中性。取硅膠一份混懸于100份水中放置，應(yīng)得澄清的中性溶液。如濾液為酸性，應(yīng)水洗至中性，再行活化處理。鐵離子的檢查一般將硅膠混懸于鹽酸中，攪拌，如含鐵離子則與鹽酸結(jié)合成復(fù)合物而顯黃色。有鐵離子存在即預(yù)示有其他金屬鹽存在的可能性，因此最好以鹽酸洗滌處理。在特殊情況

6、下，硅膠須經(jīng)乙醚、氯仿等有機溶劑預(yù)洗，至洗出液蒸干無殘渣為止。 由于硅膠容易吸水，因此用前最好經(jīng)120烘24小時活化，可不作活性測定。 硅膠的改良：向?qū)游龉枘z中加入一種復(fù)合試劑，以改良吸附性能，提高分離效果，稱改良吸附劑。例如以硝酸銀處理的硅膠對不飽和烴類有極好的分離作用。以110%復(fù)合試劑的水或丙酮溶液，與硅膠混勻，待稍干后于110干燥即可。表7-2 常用改良吸附劑復(fù)合試劑選擇性分離物0.10.5 N 酸或堿pH敏感物質(zhì)（生物堿、酸性、酚性、兩性物質(zhì)）AgNO3具有雙鍵或三鍵物質(zhì)硼酸、硼酸鈉、堿式醋酸鉛多羥基化合物亞硫酸鈉醛類氯化鐵羥基喹啉類硫酸銅胺類鐵氰化鋅磺胺類二、硅膠吸附層析的應(yīng)用 硅

7、膠層析的優(yōu)、缺點：優(yōu)點：(1) 有些化合物用氧化鋁層析，吸附劑副反應(yīng)較多，而且某些副反應(yīng)即使用中性氧化鋁仍難以避免。而硅膠作吸附劑雖也有個別發(fā)生異構(gòu)化，但一般副反應(yīng)較少；(2) 某些酸性、酚性物質(zhì)、色素等易與氧化鋁結(jié)合而不宜使用氧化鋁層析，硅膠則無此特性；(3) 氧化鋁層析樣品損失較多，而硅膠層析樣品回收率較高。缺點：即分離效果有時較氧化鋁為差，對雜質(zhì)的吸附能力差；樣品處理量相應(yīng)的比氧化鋁為低。 硅膠吸附層析的操作快速層析（Flash Chromatography）既快速簡便，又有相當(dāng)分離效果。注；玻璃磨口連接處用彈簧或橡皮圈扣緊。橡皮管連接處一般在壓力為1kg/cm2以下不會脫開。 操作步驟

8、裝柱A.干法向?qū)游鲋屑尤?.51cmn高的硅膠H(100200 mesh/目)，再將硅膠H（300400 mesh左右，即38m(1040m)）裝入柱，敲緊或在出口處抽真空吸緊，使硅膠層高約1820cm，硅膠層面應(yīng)水平，上部再加0.51cm高的純凈砂層或濾紙。然后加入洗脫用的溶劑，加壓趕去硅膠內(nèi)氣泡，溶劑壓至硅膠層頂面，此時硅膠層高約1517cm。B. 濕法b1.即將硅膠混懸于裝柱溶劑中，不斷攪拌待空氣泡除去后，連同溶劑一起傾入層析柱中。最好一次傾入，否則由于不同粒度大小的硅膠沉降速度不一，使硅膠柱有明顯的分段，容易影響分離效果。b2.向硅膠中加入一定體積的溶劑，充分?jǐn)噭颍尤氲筋A(yù)先裝有一定

9、體積溶劑的層析柱內(nèi)（已加粗硅膠H），同時打開活塞放出溶劑，硅膠下降。加壓趕去硅膠內(nèi)氣泡，至層高約1820cm，溶劑壓至硅膠層頂面，此時硅膠層高約1517cm。2. 硅膠柱內(nèi)包含溶劑體積的確定（干法）取一定體積V0的溶劑，加壓至砂板處，將層析柱的活塞稍打開，使溶劑滴入接受器中，當(dāng)氧化鋁柱上面的溶劑液面剛好降至填料表面，關(guān)閉活塞，量取接受器內(nèi)溶劑量V1。則V0 V1即氧化鋁柱內(nèi)包含溶劑的體積V。依據(jù)V，在層析過程中，可知在什么時候開始收集流份。當(dāng)變換溶劑的時候，就可知道新?lián)Q溶劑大致在何流份開始。3. 加樣 用盡量少的溶劑溶解樣品，然后加至柱中，加壓壓入硅膠層。難溶樣品拌入少量硅膠再裝入，上面再復(fù)以

10、砂層。 4. 洗脫根據(jù)薄層層析資料的判斷，用在硅膠薄層板上欲分點為Rf=0.20.3的展開溶劑洗脫，如有多點需分離時，可以改變洗脫溶劑的比例。用減壓閥控制壓力以調(diào)節(jié)洗脫速度，收集餾分。而且為了盡量減少被分離化合物在層析柱中擴散，層析過程中不能有間歇。5. 樣品收集 每一餾分用薄層板點樣分析，每塊薄層板上可點數(shù)個餾分點，用原料做對照，前一塊板的最后一點應(yīng)用于下一塊板的第一點做對照點。將相同位置點的餾分合并，蒸除溶劑。 柱的粗細和進樣量等的關(guān)系（表1） 這時施加的壓力約0.40.7kg/cm2(可用壓力表指示)。為了達到最好分離效果，使用者可根據(jù)具體樣品摸索條件。表1柱內(nèi)徑（mm）硅膠用量（g）加

11、樣量（g）流速（ml/min）每一餾分體積（ml）14 17 25 35 5210 16 35 70 1500.2 0.5 12 4 85 10 15 20 302.5 4 8 15 25例：1.2g原料反應(yīng)5d后，用硅膠薄層層析顯示（展開劑：石油醚/乙酸乙酯82），主要為二個斑點：Rf分別為0.23和0.14，相應(yīng)于未反應(yīng)原料和產(chǎn)物。 用快速層析法分離（柱內(nèi)徑25mm，青島海洋化工廠硅膠H 35g，硅膠層加壓后高17cm）。先用120ml石油醚/乙酸乙酯（82）洗脫，再用400ml石油醚/乙酸乙酯（82）洗脫。加壓力0.7 kg/cm2，流速0.5ml/min。開始80ml未收集，以后收集1

12、5ml左右為一餾分。餾分17：0.01g，低極性物；餾分815：0.49g，相應(yīng)于Rf 0.23的原料；餾分1618：交叉餾分；餾分1934:0.37g相應(yīng)于Rf 0.14的產(chǎn)物。收集時間約1.5h。 總之，此層析法可用于Rf差0.05到0.1的組分分離，一般在2h左右可分離一個樣品，既達到一般柱層析的分離效果，又節(jié)省了時間，而且溶劑和硅膠用量也可減少。對不太穩(wěn)定的化合物，用此法分離尤為適用。吸附柱層析硅膠的用量樣品與吸附劑的比例可為13060，但必須根據(jù)分離工作的難度，較難分離者有時甚至可選用15001000。硅膠吸附層析適用范圍使用比較廣泛，能用于非極性化合物，也能用于極性化合物，適用于芳

13、香油、萜類、甾體、生物堿、強心甙、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成產(chǎn)品如有機金屬化合物等。三、硅膠的再生1. 由于硅膠對雜質(zhì)及色素吸附力差，因此回收操作比氧化鋁簡單，一般可用乙醇或甲醇洗滌，或于索氏提取器連續(xù)抽提除去雜質(zhì)，洗凈的硅膠待溶劑揮發(fā)除去后，烘干活化處理即可使用。2. 硅膠的再生也可用510倍體積的1氫氧化鈉煮沸半小時，如仍不成強堿性(以酚酞作指示劑)，可追加適量1氫氧化鈉，趁熱過濾，以蒸餾水洗三次，冉以36倍5鹽酸煮沸半小時，以蒸餾水洗至中性，120活化，過篩即得。四、分配層析的原理及操作一種溶質(zhì)在兩種不相互溶的溶劑中振搖，當(dāng)達到平衡時，溶質(zhì)在兩層中濃

14、度都有恒定的比例，這一比值稱作該物質(zhì)在這兩種溶劑中的分配系數(shù)。如果需要分離的兩種物質(zhì)，在兩相中的分配系數(shù)比較接近，則須利用不斷地進行反復(fù)分配，如使用逆流分溶及分配層析才能達到目的。1分配層析的原理分配層析是以一種多孔物質(zhì)吸著一種極性溶劑，此極性溶劑在層析過程中始終固定在支持劑上，因此稱為固定相。另用一非極性溶劑(與固定相不相互溶)洗脫，此洗脫劑在層析過程中始終是移動的，稱為移動相。溶質(zhì)在固定相和移動相之間，在柱上作連續(xù)的、動態(tài)的不斷分配，由于不同成分在兩相間分配系數(shù)的差異而得以分開。2. 影響分離效果片的因素兩者的分配系數(shù)差值。如果相差較大，只要用較小的柱和較少的硅膠用量即能滿意地分離，如果分

15、配系數(shù)差值極小，則同樣重量的樣品往往要用較大的柱和用較多的硅膠才能分開。3. 分配層析所用多孔支持劑主要有硅膠、硅藻土(商品名Celite)、纖維粉等，近年來并有用有機支持劑的，如微孔聚乙烯粉等。 操作分配層析所用的儀器操作一般與吸附層析相同，將預(yù)先選定的固定相溶劑(一般為水溶液或極性溶劑)加入支持劑硅膠中，攪拌混合均勻，傾入事先選定的移動相溶劑中，激烈攪拌，使兩相互相飽和達到平衡。層析管中放移動相(事先務(wù)必用固定相溶劑劇烈振搖，互相飽和，以造成層析時穩(wěn)定的平衡條件)，將上述吸著固定相的硅膠濕法裝柱，不斷輕敲管壁或加壓，使固定相支持劑壓緊。樣品一般可溶于移動相中上柱，繼以移動相洗脫，按固定體積

16、收集，分別濃縮處理。 分配層析操作注意事項：(1) 移動相體積常大于固定相5l0倍，即相當(dāng)于以510倍體積的有機溶劑向水溶液萃取，而分配系數(shù)的含意為溶質(zhì)在兩相中的濃度比，若體積增大，實際抽提出量也大。因此在分配層析中選擇固定相與移動相時，要考慮樣品在兩相中的分配比（樣品于移動相中的濃度/樣品于固定相中的濃度），應(yīng)在0.10.2時較適宜。較大則很快從柱上洗脫，分離效果較差，如分配比過大則可采用反相分配層析，即以非極性溶劑作固定相，極性溶劑作移動相。(2) 所用固定相與移動相溶劑，務(wù)必相互飽和，否則層析過程中固定相體積不斷減少或增加，平衡條件就被擾亂。(3) 選用支持劑(硅膠)與吸著固定相的比例為

17、10.51即層析時硅膠吸有相當(dāng)于本身重量50100固定相溶劑，較為適宜。(4) 樣品上柱可采取三種方式：a. 如樣品能溶于移動相溶劑，可用少量移動相溶劑溶解，加于柱頂再行展開；b. 如樣品難溶于移動相，易溶于固定相，則可用少量固定相溶劑溶解，用硅膠吸著，裝于柱頂再行展開；c. 如果樣品在兩相中溶解度均不大，則可溶于適當(dāng)?shù)娜軇?，拌于干燥硅膠上，待溶劑揮發(fā)去盡后，加50100的固定相溶劑拌勻再上柱。(5) 層析柱固定相支持劑段直徑與長度的比為l1020，對分配系數(shù)比較接近的成分分離，往往可加大至140以上。(6) 分離樣品時支持劑的用量一般較吸附層析為大，為11001,000，主要決定于分離工作的

18、難易，對分配系數(shù)比較接近的成分的分離甚至可采用110010,000。(7) 為使溶質(zhì)在兩相間達到平衡，移動相流速宜慢些，大致固定相支持劑的直徑與高度為2.650厘米，流速0.07毫升分鐘；4.565厘米為0.3毫升/分鐘；5.590厘米為0.6毫升分鐘；6.5115厘米為1.2毫升分鐘。（8）分配系數(shù)往往會因溫度變化而變化。因此對要求較高的實驗，層析管最好有隔層套管，以便通水保持恒定的溫度。五、分配層析溶劑系統(tǒng)的選擇一般酸性酚性物質(zhì)及生物堿類?？捎镁彌_液(酸、堿性溶液)作為固定相(見表7-5)。還可根據(jù)具體化合物的溶解度、極性情況靈活選用。表7-5 硅膠分配層析溶劑系統(tǒng)的選擇化合物名稱固定相移

19、動相水溶性生物堿水或緩沖溶液丁醇緩沖溶液乙酸乙酯甙類水氯仿或乙酸乙酯水乙酸乙酯（含0.5%甲醇）酚性化合物水環(huán)己烷有機酸0.05N或0.5N H2SO4環(huán)己烷：氯仿（或石油醚、苯、乙醚）=3:1磷酸緩沖溶液氯仿:乙醚=1:1或環(huán)己烷氨基酸的DNP衍生物不同pH的緩沖溶液乙醚、氯仿、正丁醇甾體化合物水石油醚甲醇環(huán)己烷乙二醇甲苯甲酰胺異丙醚六、硅膠分配層析的應(yīng)用分配層析分離主要決定于分配系數(shù)的差異，一般說各類型化合物均能適用，特別適用于水溶性、親水性物質(zhì)而又稍能溶于有機溶劑中者，因此剛巧能彌補一般吸附層析(如氧化鋁層析適用于親脂性物質(zhì))的不足。但分配層析樣品處理量較少。分配層析往往適用于水溶性及極

20、性較大的生物堿、甙類(強心甙，皂甙)、有機酸、酚性成分、糖類及氨基酸的衍生物，對某些非極化合物如甾體、油酯等有時也可用反向分配層析進行分離。七、硅膠分配層析操作實例狄戈辛(Digoxin) 即異羥基洋地黃毒甙)的分離國產(chǎn)層析硅膠80100目用量為分離樣品的100倍，加23量的水(預(yù)先以乙酸乙酯飽和)調(diào)勻，再以乙酸乙酯(水飽和)浸泡，調(diào)成稀糊狀，濕法裝柱，柱直徑與長度比為1：20以上。取毛地黃次生甙總甙與12倍量硅膠磨勻，加入柱頂，用水飽和的乙酸乙酯（含0.5%甲醇)洗脫，分部收集，各流份均作紙層析及薄層層析（硅膠G硬板)檢查，比移值相同部分合并，減壓蒸干，以甲醇結(jié)晶，得洋地黃毒甙(Digito

21、xin)、羥基洋地黃毒甙(Ci-toxin)、異羥基洋地黃毒甙(Digoxin)等三種單體。硅膠G薄層層析展開溶劑：二氯乙烷-甲醇-甲酰氨(80：19：1)；顯色劑：三氯醋酸。第二章 氧化鋁層析 氧化鋁層析適用于親酯性成分分離。廣泛用于生物堿、甾體化合物、強心甙、精油、內(nèi)酯化合物等中草藥成分的分離。 優(yōu)缺點有價廉、分離效果好、再生容易等優(yōu)點；缺點是能與部分酚性化合物（如有些黃酮類化合物、部分三萜酸）結(jié)合因而不能應(yīng)用。 一、各種氧化鋁的制備及其應(yīng)用層析用氧化鋁的種類及用途：1. 堿性氧化鋁pH 910。用于碳氫化合物的分離，和從碳氫化合物中除去含氧化合物，以及某些對堿溶液比較穩(wěn)定的中性色素、甾族

22、化合物、生物堿、醇，以及其他中性、堿性物質(zhì)的分離。2中性氧化鋁 pH7.5。應(yīng)用最廣泛，適用于醛、酮、醌、某些甙及酸堿溶液中不穩(wěn)定的化合物如酯、內(nèi)酯等化合物的分離。3酸性氧化鋁pH 44.5。適用于天然及合成酸性色素及某些醛、酸的分離。 水提取液二、氧化鋁的活化及活性的改變1氧化鋁的活化 氧化鋁的活性與含水量關(guān)系極大，在一定溫度下除去水分就可以使氧化鋁活化。氧化鋁加入一定量水即可使活性改變。活性水量的關(guān)系大致如圖6l。表6 1 氧化鋁中加入水量與活性關(guān)系加入水量%氧化鋁活性0I級3II級6III級10IV級15V級氧化鋁（堿性、中性或酸性）的活化400左右加溫6小時，即得I級氧化鋁。如果活化溫

23、度過高，引起氧化鋁內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變，它的吸附力將引起不可逆的下降，而不能供層析應(yīng)用。三、氧化鋁層析操作1操作基本與硅膠吸附層析相同 2. 氧化鋁的用量一般采用樣品量的2050倍，根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)而定。遇到碳氫化合物如萜烯、倍半萜烯等，氧化鋁對這些化合物的吸附力較弱，層析時氧化鋁用量略增，為樣品量的100200倍， 3層析洗脫用的溶劑 a. 洗脫能力與溶劑極性有關(guān)。極性溶劑的洗脫能力較非極性溶劑大，所以逐步增加溶劑的極性，可使吸附在氧化鋁柱上的不同化合物逐個洗脫，達到分離的目的。表6-4 常用層析洗脫用溶劑次序與介電常數(shù)關(guān)系溶劑介電常數(shù)層析洗脫時使用次序己烷或石油醚1.88(1)苯2.30(

24、2)氯仿5.20(3)乙醚4.50(4)乙醇25.80(5)水81.00(6)更換溶劑時，為了逐步提高溶劑的洗脫能力，常用混合溶劑作為過渡，開始時逐漸緩慢地增加較大極性溶劑的比例(自010%)； 以后每次遞增510%，使較大極性溶劑比例自10%遞增到50%；然后再更換較大極性溶劑。實際操作過程中，根據(jù)薄層層析資料的判斷，及初步層析結(jié)果的分析。b. 層析用溶劑的處理： 除去溶劑中某些極性較大的雜質(zhì)(如氯仿中的乙醉)；除去溶劑中某些不揮發(fā)物質(zhì)，以免污染洗脫流份；并應(yīng)注意溶劑中含水量。4氧化鋁的再生 a. 層析后，除去氧化鋁柱上端含聚合物及帶有深顏色的氧化鋁；b. 用甲醇、稀醋酸、氫氧化鈉溶液及水洗

25、滌，再經(jīng)高溫活化后，可重復(fù)使用；c. 為了使吸附在氧化鋁表面的有機物分解，高溫活化時間可適當(dāng)延長?；罨?，氧化鋁的顏色比使用后的稍淡。一般來說，氧化鋁可重復(fù)使用多次，隨層析過程中有機物污染的程度而定。四、氧化鋁層析過程中引起的一些副反應(yīng)氧化鋁層析時引起的一些副反應(yīng)，例如某些化合物層析時引起的異構(gòu)化、氧化、皂化、水合，以及脫氯化氫形成雙鍵等反應(yīng)，已有一些報道。進行層析時應(yīng)加以注意。1溶劑洗脫法洋艾中內(nèi)酯成分的分離第三章 聚酰胺層析 聚酰胺(Polyamide)是由酰胺聚合而成的一類高分子物質(zhì)，商品名：錦綸、尼龍。 聚酰胺層析用途分離極性和非極性物質(zhì)的廣泛的層析方法，如黃酮體、酚類、醌類、有機酸、

26、生物堿、萜類、甾體、甙類、糖類、氨基酸衍生物、核苷類等。尤其是對黃酮體、酚類、醌類等物質(zhì)的分離，遠比其他方法優(yōu)越。 特點：對黃酮體等物質(zhì)的層析是可逆的，分離效果高，可使性質(zhì)極相近的類似物得到分離；其柱層析的樣品容量大(吸附劑用量為樣品量的1020倍)，適于制備分離。一、聚酰胺的性質(zhì) 層析用聚酰胺的種類：常用錦綸6(聚己內(nèi)酰胺)、錦綸66(聚己二酰己二胺)，其親水、親脂性能較好。既可分離水溶性物質(zhì)，又可分離脂溶性物質(zhì)。 聚酰胺的溶解性和穩(wěn)定性：錦綸6和錦綸66可溶于濃鹽酸、甲酸；微溶于乙酸、苯酚等溶劑；不溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等常用有機濟劑。對堿較穩(wěn)定，對酸的穩(wěn)定性較差(特別是

27、無機酸)，溫度高時更敏感。 分子量的大小對聚酰胺的理化性質(zhì)及層析性能的影響：錦綸6和錦綸66的分子量在16,00020,000較好。其熔點在200以上。分子量太小的聚酰胺，在常用有機溶劑中的溶解度較大，而且不太穩(wěn)定，在處理過程中易被酸、堿破壞；在層析過程中易溶于洗脫劑而污染分離樣品。分子量太大的聚酰胺，親水性及可塑性較差，亦不適用。二、基本原理(一) 吸附層析一般認為聚酰胺層析是吸附層析。由于聚酰胺分子內(nèi)有很多酰胺鍵，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵，因而對這些物質(zhì)產(chǎn)生了吸附作用。形式氫鍵的能力與溶劑有關(guān)，一般在水中形成氫鍵的能力最強，在有機溶劑中較弱，在堿性溶劑中最弱。各種化合物由

28、于與聚酰胺形成氫鍵的能力不同，聚酰胺對它們的吸附力也不同。在含水溶劑系統(tǒng)中，大致有下列規(guī)律：（1）形成氫鍵的基團（如：酚羥基、羧基、醌基、硝基等）越多，則吸附力越強。如：丁二酸丁酸(2)形成氫鍵的位置與吸附力有很大關(guān)系。對位、間位酚羥基使吸附力增大，鄰位使吸附力減小。如：、(3)芳香核、共軛雙鍵多者吸附力大，少者吸附力小。如：(4)若形成分子內(nèi)氫鍵，則使化合物的吸附力減小。如：(二) “雙重層析”聚酰胺具有“雙重層析”性能。因聚酰胺分子中既有非極性的脂肪鏈，又有極性酰胺基團。當(dāng)用極性移動相(如含水溶劑系統(tǒng))時，聚酰胺作為非極性固定相，其層析行徑類似于反相分配層析。當(dāng)用非極性移動相時，聚酰胺則作

29、為極性固定相，其層析行徑類似正相分配層析。例：聚酰胺層析可以分離某些很難與聚酰胺形成氫鍵的物質(zhì)萜類、甾體、生物堿等。如：黃酮體甙與甙元的分離（前者比后者極性大），若以含水溶劑(如：甲醇水)作洗脫劑，黃酮體甙比其甙元先洗脫下來；而非極性溶劑(如：氯仿甲醇)的洗脫結(jié)果恰巧相反黃酮體甙元比其甙先洗脫下來。三、聚酰胺層析的應(yīng)用1.分離黃酮體及某些酚類物質(zhì)聚酰胺層析是最有效的方法，可將植物粗提物中的黃酮體與非黃酮體、黃酮體甙元與甙分開。若采用含水溶劑系統(tǒng)（如：乙醇-水)，非黃酮體水溶性成分及少數(shù)黃酮體甙可用水沖洗下來。大多數(shù)黃酮體甙在1030%乙醇液中洗脫下來，而甙元則在50一96%乙醇液中才能沖洗下來

30、(見實例1)。黃酮體甙元的混合物用非極性溶劑系統(tǒng)分離較好。2. 除去植物粗提取物中的鞣質(zhì)聚酰胺對鞣質(zhì)的吸附特別強，高分子鞣質(zhì)對聚酰胺的吸附是不可逆的。 聚酰胺層析的溶劑系統(tǒng)(1).含水溶劑系統(tǒng)適用于各種甙類、糖類、有機酸等水溶性成分的分離，以及黃酮體甙與甙元、黃酮體與水溶性脂肪族成分(如糖類、脂肪族有機酸)等的分離。在含水溶劑系統(tǒng)中增加有機溶劑的比例，可使Rf值升高，洗脫能力增加。(2) 非極性溶劑系統(tǒng)。非極性溶劑系統(tǒng)則用于萜類、甾體、黃酮體甙元、酚類、醌類等極性不太高的化合物的分離。在該溶劑系統(tǒng)中增加極性溶劑的比例，可使Rf值升高，洗脫能力增加。若在各種溶劑系統(tǒng)中加入少量酸或堿，可克服層析中

31、的“拖尾”現(xiàn)象，并使色帶集中。表3-1聚酰胺薄膜層析常用溶劑系統(tǒng)化合物類別展層溶劑黃酮體甙元氯仿-甲醇（94:6或96:4），氯仿-甲醇-丁酮（12:2:1）苯-甲醇-丁酮（90:6:4或84:8:8），氯仿-甲醇-甲酸（60:38:2）氯仿-甲醇-吡啶（70:22:8），氯仿-甲醇-苯酚（64:28:8）黃酮體甙甲醇-醋酸-水（90:5:5），甲醇-水（4:1），乙醇-水（1:1），丙酮-水（1:1）異丙醇-水（3:2），30%60%醋酸，醋酸乙脂95%乙醇（6:4）氯仿-甲醇（7:3），正丁醇-乙醇-水（1:4:5），氯仿-甲醇-丁酮（65:25:10）酚 類丙酮-水（1:1），苯-甲醇-

32、醋酸（45:8:4），環(huán)己烷-醋酸（93:7），10%醋酸醌 類10%醋酸，正己烷-苯-醋酸（4:1:0.5），石油醚-苯-醋酸（10:10:5）糖 類醋酸乙酯-甲醇（8:1），正丁醇-丙酮-水-醋酸（6:2:1:1）生 物 堿環(huán)己烷-醋酸乙酯-正丙醇-二甲基胺（30:2.5:2.9:0.1）水-乙醇-二甲基胺（88:12:0.1）氨基酸衍生物苯-醋酸（8:2或9:1），50%醋酸，甲酸-水（1.5:100或1:1）醋酸乙酯-甲醇-醋酸（20:1:1），0.05M磷酸三鈉-乙醇（3:1）二甲基甲酰胺-醋酸-水-乙醇（5:10:30:20），氯仿-醋酸（8:2）甾體，萜類己烷-丙酮（4:1），氯

33、仿-丙酮（4:1）甾 體 甙甲醇-水-甲醇（60:35:5），醋酸乙醋-甲醇-水-甲酸（50:20:25:5）四、酰胺層析實驗技術(shù)1聚酰胺粉的處理 錦綸中通常有兩種雜質(zhì)：一種是錦綸的聚合原料單體及其小分子聚合物。另一種是蠟質(zhì)(錦綸絲在制成后，表面曾涂過一層蠟)。這些雜質(zhì)必須除去，否則原料單體及其小分子聚合物可與酚類物質(zhì)形成復(fù)合物。蠟質(zhì)能被醇液洗脫下來，與分離之物質(zhì)混在一起難以除去。 除去單體及小分子聚合物的方法:(1) a. 除單體及小分子聚合物-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基甲酰胺-醋酸-水-乙醇(5:10:30:20)混合液洗滌。b. 除去蠟質(zhì)-用甲醇-二氯乙烷(1:1)混合液洗滌。(2)

34、 依次用9095%乙醇、5%NaOH、10%醋酸洗滌：取制得的聚酰胺粉以9095%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入層析柱中。用34倍體積的9095%乙醇洗滌：洗至洗液透明并在蒸干后無殘渣(或極少殘渣)。再依次用22.5倍體積的5NaOH水溶液、1倍體積的蒸餾水、22.5倍體積的10%醋酸水溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性，備用。2柱層析操作裝柱：a. 用含水溶劑系統(tǒng)層析，常以水裝柱-層析管內(nèi)先加少量蒸餾水，再以玻璃纖維塞住底部。并除去玻璃纖維中的氣泡。處理過的聚酰胺粉以蒸餾水浸泡l小時左右，不斷攪拌除去氣泡。倒入柱中，讓其自然沉降，裝至所需體積，備用。一般在上節(jié)所述錦綸的處理中柱已裝好，不必再

35、裝。b. 用非極性溶劑系統(tǒng)層析時，常以溶劑組份中極性低的組份裝柱。若以氯仿裝柱，因其比重較大使聚酰胺粉浮在上面。加樣時應(yīng)將柱底端的氯仿層放出，并立即加樣，加樣后頂端以棉花塞緊。洗脫過程中，需關(guān)柱暫停時，應(yīng)將頂端的多余氯仿液放出，否則，聚酰胺會浮起而攪亂層帶。(2) 加樣：聚酰胺的樣品容量較大。一般每100毫升聚酰胺粉可上樣1.52.5克?？筛鶕?jù)具體情況適當(dāng)增加或減少-當(dāng)欲分離之成分在樣品中的相對含量較低，且易吸附于柱上，而其他成分不易吸附時，則可將上柱量增大。使大部分成分很快從柱上流下，而欲分離之成分經(jīng)適當(dāng)洗脫即可得到；當(dāng)欲分離之成分不易被吸附且不易吸附之成分不只一個，則樣品上柱量必須大大減少

36、。若利用聚酰胺除去鞣質(zhì)，樣品上柱量可大大增加。通常觀察鞣質(zhì)在柱上形成橙紅色色帶的移動，當(dāng)樣品加至該色帶移至柱的近底端時，停止加樣。樣品常用洗脫劑溶解。濃度在2030%。不溶樣品可用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等易揮發(fā)溶劑溶解。拌入干粉中，拌勻后將溶劑減壓蒸去，以洗脫劑浸泡裝入柱中。(3) 洗脫： 溶劑體系：a. 含水溶劑水，由稀至濃的乙醇液（10%、30%、50%、70%、95%）依次洗脫； b. 非極性溶劑氯仿，氯仿-甲醇(19:1，10:1，5:1，2:1，l;1)，甲醇依次洗脫。若仍有物質(zhì)未洗脫下來，可采用3.5%氨水洗脫。c. 若用錦綸分離芳香硝基化合物或DNP-氨基酸。因其對錦綸的吸附很牢

37、，上述洗脫劑很難洗脫，可用DMF-HOAc-H2O-EtOH（5;l0:30:20）混合液洗脫。 洗脫劑的更換一般根據(jù)洗脫液的顏色，當(dāng)顏色變?yōu)楹艿瓡r更換下一種溶劑。以適當(dāng)體積分瓶收集，分瓶濃縮。各瓶濃縮液以聚酰胺薄膜層析檢查其成分，成分相同者合并。聚酰胺粉的回收用過之聚酰胺粉，一般用5%NaOH洗滌，洗至氫氧化鈉液顏色極淡為止。有時因某些鞣質(zhì)與聚酰胺有不可逆吸附，用氫氧化鈉很難洗脫時，可用5%NaOH液在柱中浸泡。每天將柱中之氫氧化鈉液放出一次，并加入新的氫氧化鈉液浸泡，這樣浸泡洗滌一周后，鞣質(zhì)可基本沈完。然后用蒸餾水洗至pH89，再以2倍量10%醋酸洗，最后以蒸餾水洗至中性，供重復(fù)使用。3.

38、 聚酰胺薄膜 聚酰胺薄膜將聚酰胺在滌綸片基上涂成一薄膜，供薄層色譜用，市售產(chǎn)品出廠時己初步活化。 活化使用時，可將膜在恒溫干燥箱內(nèi)4060干燥 4h, 取出置干燥器內(nèi)冷卻，備用。 再生層析后可用丙酮和氨水(25%28%) 或丙酮和90%甲酸 (9:1，V/V) 浸泡6h , 把污物洗去后 , 再用甲醇洗滌，涼干后活化處理后重復(fù)使用。一般可重復(fù)使用10 次以上。五、聚酰胺層析操作實例1染料木素和染料木素-4-葡萄糖甙的分離槐Sophora japonica L.角的酒精提取物，以酸水解后析出沉淀物，該沉淀物依次以乙醚、甲醇提取。取甲醇提取物28克，以甲醇溶解，拌入聚酰胺粉(60克)中，減壓抽干，

39、磨細。加在預(yù)先以水為溶劑填裝的5.359厘米的聚酰胺柱頂。依次以水、30%乙醇、50%乙醇洗脫，每種溶劑洗至有很少物質(zhì)洗下時改換下種溶劑。在30%乙醇洗脫之各流份中，析出白色針品，以二甲基甲酰胺復(fù)結(jié)晶，熔點257，經(jīng)鑒定為染料木素-4-葡萄糖甙(Genistein-4-glucoside，Sophoricoside)。50%乙醇洗脫物的前幾個流份，析出黃色針晶，以甲醇-水混合液復(fù)結(jié)晶，熔點：294296，經(jīng)鑒定為染料木素(Genistein)。第四章 大孔吸附樹脂層析一、原理大孔吸附樹脂是一種不含交換基團，具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。它的性質(zhì)與活性炭相似，可以有效地吸附不同化學(xué)性質(zhì)的各種類型化

40、合物，它所具有的吸附性與范德華引力或形成氫鍵吸附有關(guān)。a).大孔吸附樹脂具有吸附作用的一個重要方面是因為它具有各種不同的表面性質(zhì)，例如疏水性的聚苯乙烯能將低極性的有機化合物吸附，主要依靠分子中的親脂鍵、偶極離子及氫鍵的作用。b).大孔吸附樹脂的吸附能力不僅與自身的化學(xué)論結(jié)構(gòu)、物理性能有關(guān)、而且與溶質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。根據(jù)“相似相溶”的原則,一般非極性吸附樹脂適宜于從極性溶劑(如水)中吸附非極性物質(zhì)，極性樹脂適宜從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)，而中極性吸附樹脂則對上述兩種情況都具有吸附力。由于是分子吸附，這種吸附力的特點是解吸容易。c).此外，由于吸附樹脂具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，還具有篩選性分離的特點，因此欲

41、分離的物質(zhì)可依其分子體積的大小及吸附力的強弱，在一定規(guī)格的大孔吸附樹脂上，以適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摱_到分離的目的。 優(yōu)點：大孔吸附樹脂由于具有選擇性好，吸附容量大，機械強度高，再生處理方便，吸附速度快， 解吸容易等優(yōu)點， 用途：現(xiàn)廣泛應(yīng)用于工業(yè)廢水的處理，維生素、抗生素的分離提純及水溶性天然產(chǎn)物成分的提純 , 近年多用于皂甙及其它甙類化合物的分離。二、大孔吸附樹脂的類型及性能： 理化性質(zhì)大孔吸附樹脂一般為白色顆粒狀，粒度多為20目60目，理化性質(zhì)穩(wěn)定,不溶于酸、堿及有機溶劑，對有機物選擇性較好，不受無機鹽類存在的影響。 按性能類型：a).非極性吸附樹脂以苯乙烯為單位、二乙烯苯為交聯(lián)劑聚合而成，故稱為

42、芳香族吸附劑。b).中極性吸附樹脂以甲基丙烯酸酯作為單體和交聯(lián)劑聚合而成，也稱為脂肪族吸附劑。c).極性吸附劑在結(jié)構(gòu)中含有硫氧、酰胺、氮氧等基團。日本三菱化學(xué)(Mitsubishi Chemical) 大孔吸附樹脂類型DIAIONHP20DIAIONHP21SEPABEADSSP825SEPABEADSSP850SEPABEADSSP207DIAIONHP2MG(L)化學(xué)結(jié)構(gòu)孔容積(mL/g)1.31.11.41.21.31.2比表面積(m2/g)60057010001000600500孔半徑(nm)2085.73.81112表觀密度(g/L-R)680625690670780720水含量(%

43、)55-6545-5552-6246-5243-5355-65均勻系數(shù) 1.6 1.6適宜分離成分皂甙、黃酮、萜類、天然色素、內(nèi)酯酚性甙、黃酮、弱極性生物堿、皂甙、內(nèi)酯生物堿、酚性甙、黃酮、低聚糖 苯乙烯類 Diaion HP20、HP21 是大孔合成吸附和脫附樹脂，有相當(dāng)大的孔徑適合對大分子的吸附。用通常的有機溶劑、酸、堿來洗脫被吸附的物質(zhì)。在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用，特別對天然產(chǎn)物和小分子的吸附、脫鹽、脫色。 苯乙烯類 SEPABEADS SP825、SP850 樹脂是大孔聚苯乙烯吸附樹脂。比HP系列樹脂有更大的表面積的和窄均勻的孔徑分布。其表面積約為HP20樹脂的2倍 , 對小分子的吸附容量是H

44、P20的2倍以(乙醇水）。對極性大孔樹脂和極性較大的化合物，則用極性強的溶劑更能滿意分離；對弱酸性的化合物可用堿來解吸 , 如 XAD-4 吸附酚后 , 可用氫氧化鈉解吸 , 氫氧化鈉最適濃度為0.2%0.4%; 對弱堿性物質(zhì) , 可用酸來解吸；可用幾種不同濃度洗脫劑洗脫，以確定最佳洗脫劑濃度 , 或采用不同極性梯度的洗脫劑分別洗下不同組分；洗脫速度一般控制在 0.5ml/min5ml/min 比較合適。 洗脫液經(jīng)檢測后 , 將相同組分合并。六、樹脂柱的清洗層析后的樹脂表面或內(nèi)部殘留著雜質(zhì)。雜質(zhì)中非吸附性成分一般用水洗滌即可，吸附性雜質(zhì)可根據(jù)其性質(zhì)，選用低濃度的醇洗除，一般情況下，洗至近無色即

45、可。第五章 活性炭層析 用途活性炭柱層析對于分離水溶性物質(zhì)(如氨基酸、糖類及某些甙類)是一種較好的方法，它是分離水溶性物質(zhì)的主要方法之一。 優(yōu)點樣品上柱量大（一般每100毫升活性炭可上樣510克），分離效果好，活性炭來源較易，價格便宜，適用于大量制備分離。 缺點由于活性炭的生產(chǎn)原料不同，制備方法及規(guī)格不一，其吸附力不象氧化鋁、硅膠那樣易于控制，目前尚無測定其吸附力級別的理想方法，因而限制了其廣泛應(yīng)用。一、活性炭的來源、規(guī)格及性能 來源動物炭、植物炭和礦物(煤)炭三種。分別采用動物的骨頭、木屑、煤屑高溫炭化而成。醫(yī)藥用活性炭及層析用活性炭多以木屑做原料，加氯化鋅在700800高溫炭化、活化，經(jīng)適

46、當(dāng)處理除去雜質(zhì)而制成。由于植物體內(nèi)含有各種金屬離子及生產(chǎn)過程中加入氯化鋅，故易含有微量重金屬離子。 用于層析的活性炭，基本上可以分三類：(1) 粉末狀活性炭：一般采用醫(yī)藥用或化學(xué)純活性炭。該類活性炭顆粒極細，呈粉末狀，其總表而積特別大，吸附力及吸附量也特別大，是活性炭中吸附力最強的一類。但是，由于其顆粒太細，在層析過程中流速極慢，需要加壓或減壓操作。(2) 顆粒狀活性炭顆粒較前者為大，其總表面積也相應(yīng)減小，吸附力及吸附量也較次于前者。但是，在層析過程中流速易于控制，勿需加壓或減壓操作。 (3) 錦綸-活性炭：以錦綸為粘合劑，將粉末狀活性炭制成顆粒。其總表面積較顆粒狀活性炭為大，較粉末狀活性炭為

47、小，其吸附力較二者皆弱。因為錦綸不僅單純起一種粘合作用，它也是一種活性炭的脫活性劑，因此可用于分離前兩種活性炭吸附太強而不易洗脫的化合物。用其分離酸性氨基酸及堿性氨基酸：可取得很好效果。流速易控制，操作簡便。二、活性炭的選擇及運用 選擇適當(dāng)吸附力的活性炭欲分離的物質(zhì)不易被活性炭吸附時，則要選擇吸附力強的活性炭。當(dāng)欲分離的物質(zhì)很易被活性炭吸附時，則要選擇吸附力弱的活性炭。在首次分離某種樣品時，一般首先選用第二類活性炭。當(dāng)發(fā)現(xiàn)其對欲分離之物質(zhì)因不能吸附而未達到分離目的時，則改用第一類活性炭。當(dāng)發(fā)現(xiàn)其對欲分離之物質(zhì)因吸附過強而不能洗脫，或因很難洗脫而造成洗脫溶劑體積太大流份不集中時，則改用第三類活性

48、炭。一般盡量避免應(yīng)用第一類活性炭(即粉末狀活性炭)，它的吸附力太強，有許多物質(zhì)吸在上面極難洗脫。 三類活性炭聯(lián)合應(yīng)用分離較復(fù)雜的植物成分將欲分離之樣品先通過第三類活性炭柱，對活性炭附著力最強的物質(zhì)吸在該柱上。其不吸附物再通過第二類活性炭柱，附著力稍次之物質(zhì)吸在該柱上。其不被吸附物最后通過第一類活性炭柱。這樣依次通過三根柱，在三根柱上吸附的物質(zhì)分別用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵?，就達到較好的分離效果。三、活性炭對物質(zhì)的吸附規(guī)律及應(yīng)用活性炭在水溶液中的吸附力最強，在有機溶劑中吸附力較弱。在一定條件下，對不同物質(zhì)的吸附力如下： (1) 對極性基團(如COOH，NH2，一OH等)多的化合物的吸附力大于極性基團少的化

49、合物。例如，活性炭對酸性氨基酸和堿性氨基酸的吸附力大于中性氨基酸?？山瑁蓪⑺嵝园被峄驂A性氨墓酸與中性氨基酸分開。又如，活性炭對羥基脯氨酸的吸附力大于脯氨酸，因為羥基脯氨酸比脯氨酸多一個羥基。(2) 對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物。可將芳香族氨基酸與脂肪族氨基酸(兩者的氨基和羧基數(shù)目相同)分開。也可將某些水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開。(3) 對分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。例如，活性炭對肽的吸附力大于氨基酸，對多糖的吸附力大于單糖。因此可利用活性炭分離氨基酸與肽，單糖與多糖。氨基酸、單糖先洗脫下來；肽、多糖后洗脫下來。 四、實驗技術(shù)1活性炭的處理(1) 除氣活性炭

50、是一種強吸附劑，對氣體的吸附力及吸附量都很大。氣體分子占據(jù)了活性炭的吸附表面，因而造成所謂活性炭“中毒”，使其活力降低。同時，又有一些氣體如氧氣可引起某些副反應(yīng)。最簡單方便的方法就是加熱烘千，可將吸附的絕大多數(shù)氣體除去。一般在用前150加熱干燥45小時即可。錦綸-活性炭，因錦綸受熱溫度高要變形，在用前100干燥45小時即可。(2) 除金屬離子醫(yī)藥用、化學(xué)純、766-1、769活性炭在出廠前對所含雜質(zhì)及重金屬均經(jīng)檢查，符合規(guī)定要求。錦綸-活性炭在制備過程中也經(jīng)大量酸洗、水洗，勿需特別處理即可應(yīng)用。工業(yè)用活性炭在用前必須進行嚴(yán)格處理，一般處理方法有二：a. 加入2-3N鹽酸，水浴加熱半小時，然后減

51、壓濾干，如此以酸處理二至三次，再以熱蒸餾水洗滌至pH56，濾干，烘箱中150干燥8小時。置于瓶中，密塞備用。b. 加20%醋酸水溶液，煮沸510分鐘，減壓濾干，以除去含氮雜質(zhì)及部分金屬離子。如此處理二至三次，再以熱蒸餾水洗至pH56，濾干。將其懸浮于水中，每100克活性炭中加入氰化鉀50毫克(預(yù)防重金屬離子的催化作用)，直火加熱，在60保持l0分鐘，趁熱過濾，以熱蒸餾水洗至pH67，烘箱中100干燥至恒重，于瓶中密塞備用。2減活性的方法活性炭對某些物質(zhì)有不可逆的吸附作用，致使某些物質(zhì)吸在上面無法洗脫。在此情況下必須對活性炭減活性；一般采用長鏈脂肪族化合物，如硬脂酸、油酸、十一烷酸、十八烷、十八

52、烷胺等。其中以硬脂酸為最常用。方法如下：活性炭以1.5%(W/V)硬脂酸乙醇液浸沒，攪拌1小時后，在攪拌下用9倍量的蒸餾水稀釋，減壓濾干，以蒸餾水洗，濾干后空氣干燥或真空干燥，備用。3柱層析的操作(1) 裝柱：活性炭在水中吸附力最強，一般在水中裝柱。層析管內(nèi)先加少量蒸餾水，再以玻璃纖維塞住底部。并除去玻璃纖維中的氣泡?；钚蕴恳哉麴s水浸泡l小時左右，不斷攪拌除去氣泡。倒入柱中，讓其自然沉降，裝至所需體積，備用。粉末狀活性炭因流速太慢，則需與硅藻土(1:1)混合后，再用蒸餾水調(diào)成糊狀裝柱。并且待樣品上柱后，層析管頂端連一有自動控制的加壓泵或?qū)游龉芟露诉B一減壓泵進行層析。(2) 樣品上柱樣品一般用水

53、溶解。濃度在2550%(g/mL)之間，即1克樣品溶于24毫升水中?；钚蕴繉游龅臉悠飞现枯^大，一般每100毫升活性炭可上樣510克。在某些情況下，樣品的上柱量及樣品濃度可適當(dāng)增加或減少（參看聚酰胺層析實驗技術(shù)項下“樣品上樣”）。某些樣品在水中不易溶解時，可加適量甲醇、乙醇或丙酮使其溶解。但樣品體積不可太大，樣品上柱量也應(yīng)相應(yīng)減少，否則影響分離效果。 (3) 洗脫：洗脫溶劑一般采用水、各種濃度的乙醇液。其它如610%丙酮液、25%醋酸、15%苯酚水溶液等（但不常用）。最常用的是水，由稀至濃的乙醇水溶液梯度洗脫。其 洗脫順序是：水，10%、20%、30%、50%、70%的乙醇溶液。若仍有部分物質(zhì)

54、未洗脫下來，最后可用適當(dāng)有機溶劑或3.5%氨水洗脫。4. 回收用過之活性炭可以用酸堿處理回收。因活性炭來源較易，價格便宜，一般不回收使用。五、活性炭層析操作實例鷓鴣菜驅(qū)蛔有效成分海人草酸的分離及板藍根中氨基酸的分離。離子交換層析 原理離子交換是利用一種不溶性高分子化合物，它的分子中具有解離性基團(交換基)，在水溶液中能與溶液中的其他陽離子或陰離子起交換作用：交換反應(yīng)都是平衡反應(yīng)，在層析柱上進行時，由于連續(xù)添加新的交換溶液，平衡不斷按正反應(yīng)方向進行，直至完全，因此可以把離子交換劑上的原有離子全部洗脫下來。當(dāng)一定量的溶液通過交換柱時，由于溶液中的離子不斷被交換而濃度逐漸減少，因此也可以全部被交換而

55、吸著在交換劑上，用離子交換法從待分離物質(zhì)中交換含游離離子基團的酸、堿及兩性成分，使與無游離離子基團的中性物質(zhì)分開，而被吸著的物質(zhì)可用另一洗脫液洗脫下來法。如有兩種以上的成分被吸著在離子交換劑上，用另一洗脫液洗脫時，它們的被洗脫能力決定與各別洗脫反應(yīng)的平衡常數(shù)。利用各別被洗脫能力的不同進行分離即為離子交換層析。 用途分離有機酸、酚、堿、氨基酸、肽等 填料用途最廣的是離子交換樹脂。另外也有在纖維素或多聚糖上人工引入交換基所成的離子交換劑，后者大多用于植物大分子蛋白質(zhì)、核酸、酵素及多糖體的分離精制。一、離子交換樹脂的種類及性能（一）種類離子交換樹脂是一種合成高分子化合物，一般呈球狀或無定形粒狀。離子

56、交換樹脂主要可以分為兩大類，即陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。a. 陽離子交換樹脂中的解離性基團是磺酸(一SO3H)、磷酸(一PO3H2)、羧酸(一COOH)和酚性羥基(OH)等酸性基團。b. 陰離子交換樹脂中含有季銨、伯、仲、叔胺等堿性基團。亦有兩性離子交換樹脂、絡(luò)合樹脂等。各類樹脂根據(jù)它的解離性能大小，可分為強、中、弱等。 1強酸性陽離子交換樹脂（1） 苯乙烯強酸型樹脂：一般為黑褐色。是最常用的強酸性陽離子交換樹脂，以苯乙烯為單位，向上下左右延伸的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是它的母體。母體上連結(jié)許多一SO3H，結(jié)構(gòu)如下： 常用種類國產(chǎn)樹脂中強酸17(上海樹脂廠#732)、強酸性# 1(南開大學(xué)樹脂廠)和國外

57、產(chǎn)品Dowex50、Amberlite IR120、Zeo Karb225、Zerolit225、Wofatit K、Permutit Q、Lewatit Sl00。 穩(wěn)定性：這種樹脂很穩(wěn)定，經(jīng)過幾百次交換，交換當(dāng)量也改變不大。對各種試劑也較穩(wěn)定-，如較長時間浸在5%氫氧化鈉、0.1%高錳酸鉀、過氧化氫水溶液、0.1當(dāng)量硝酸中也不會改變性能。不溶于水和一般有機溶劑，耐熱性也比其他樹脂好，必要時可以在沸水浴上100左右處理。（2）酚磺酸型樹脂：是在苯乙烯樹脂出現(xiàn)以前就被廣泛應(yīng)用的強酸性樹脂，可以用對羥基苯磺酸和甲醛縮合而成。其基本結(jié)構(gòu)如下： 常用種類華東強酸陽42和國外產(chǎn)品Amberlite I

58、R-100、IR-105、Dowex30、Zerolit215、Zeo Karb215、Wofatit K、Wofatit KS等。這種樹脂一般為黑色，交換量比苯乙烯樹脂小，遇堿或氧化劑時，性能易變化。在堿性溶液中酚性羥基也能進行交換，所以這種樹脂在不同PH的溶液中離子交換的作用不同。因為有以上缺點，故應(yīng)用范圍較小。2強堿性陰離子交換樹脂樹脂的母體和苯乙烯強酸性樹脂相同。即在此母體上連結(jié)季銨，結(jié)構(gòu)如下： 常用種類國產(chǎn)樹脂中強堿性#201(南開大學(xué)樹脂廠)、強堿性2017(上海樹脂廠#717)和國外產(chǎn)品Nalcite SAR、Dowex1、Dowex2、Amberlite IRA-400、Amb

59、erlite IRA-410、Amberlite XE-98、PermutitSI、PermutitSII、Lewatit MII Zerolit FF等都屬于這122種。這種強堿性樹脂對酸、堿和有機溶劑亦較穩(wěn)定，但在濃硝酸中不穩(wěn)定。游離型(OH型)比鹽型(如Cl型)的耐熱性差，超過4045就不穩(wěn)定，因此一般商品都是C1型。3弱酸性陽離子交換樹脂含有COOH的樹脂，母體有芳香族和脂肪族兩種。脂肪族類型中用甲基丙烯酸和二乙烯基苯聚合的較多，結(jié)構(gòu)如下：芳香族類型的用二羥基苯酸和甲醛聚合的較多。國產(chǎn)樹脂中弱酸101128(上海樹脂廠#724)、弱酸性#101(南開大學(xué)樹脂廠)和國外產(chǎn)品Amberli

60、te IRC-50、WofatitC、Zerolit226都屬于弱酸性陽離子交換樹脂。4弱堿性陰離子交換樹脂 含有一NH2，=NH，N等基團的陰離子交換樹脂。國產(chǎn)樹脂中弱堿330(上海樹脂廠#701)、弱堿3112(上海樹脂廠#704)、華東弱堿陰321、弱堿性#301(南開大學(xué)樹脂廠)、弱堿性#330(同上)，和國外產(chǎn)品Amberlite IR-4B、Wofatit M、Wofatit N、Le-watit M、Dowex3、Permutit W等都屬于此種。其基本結(jié)構(gòu)如下：123含有N基團的堿性較強，含有NH或-NH2的堿性較弱。這種樹脂有黃、橙、黑等顏色。強酸性及強堿性樹脂的鹽型較穩(wěn)定，