非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷ppt課件(PPT 71頁)

1、非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷African Swine Fever, ASF1第1頁，共71頁。定義非洲豬瘟是家豬、疣豬、歐洲野豬和美洲野豬的一種傳 染性極強(qiáng)的出血性疾病。所有年齡的豬都易感。世界動物衛(wèi)生組織2第2頁，共71頁?？杀憩F(xiàn)為最急性、急性、亞急性和慢性四 種形式嚴(yán)重程度與毒株、豬種及流行時間的長短 有關(guān)急性型以高熱、食欲廢絕、皮膚發(fā)紺、網(wǎng) 狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血為特征，發(fā)病后2-10天內(nèi) 死亡，病死率可高達(dá)100%臨床上，與古典豬瘟非常相似，難以區(qū)分目前沒有疫苗！2017/5/153第3頁，共71頁。只感染豬家豬和歐亞野豬非常易感 感染后存活的豬可能變?yōu)闊o癥狀的攜帶者非洲的野生宿主能持續(xù)感染很長時間并

2、且 沒有臨床癥狀軟蜱是自然界中的貯主并且可以作為傳播 媒介法典中將非洲豬瘟的潛伏期定為15天。2017/5/154第4頁，共71頁。重要性O(shè)IE動物衛(wèi)生法典要求必須報(bào)告的動物疫病我國動物疫病名錄一類動物疫病我國中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年） 明確重點(diǎn)防范的外來動物疫病5第5頁，共71頁。病原非洲豬瘟病毒科中唯一成員 Asfarviridae Asfivirus ASFV兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性唯一核酸為DNA的蟲媒病毒只有一個血清型6第6頁，共71頁。特點(diǎn)之一：基因組大170190kb藍(lán)耳病病毒15kb 12 倍豬瘟病毒12kb 15 倍Genome CSFV口蹄疫病毒8

3、kb 24 倍Genome FMDV病原7第7頁，共71頁。病原特點(diǎn)之二：基因多變基因組兩端各有一個高變區(qū)，基因型多達(dá)22個8第8頁，共71頁。特點(diǎn)之三：抵抗力強(qiáng)溫度：6020分鐘；5670分鐘25-37 數(shù)周4 1年凍肉數(shù)年到數(shù)十年pH：411.5 無血清413.4 有血清未熟肉品、腌肉、泔水中可長時間存活病原乙醚、氯仿等脂溶劑可破壞囊膜使其失活9第9頁，共71頁。臨床癥狀最急性型急性型亞急性型慢性型2017/5/1510第10頁，共71頁。臨床診斷最急性型無臨床癥狀，突然死亡急性型（強(qiáng)毒株）發(fā)燒（41-42C）食欲減退不愿活動局部皮膚變紅或變藍(lán)色腹瀉嘔吐呼吸困難流產(chǎn)死亡率高（10-100%

4、）仔豬發(fā)生ASF，耳、鼻、唇、腿發(fā)紅，神經(jīng)癥狀，數(shù)小時內(nèi)死亡。Mityana, Uganda, 201011第11頁，共71頁。臨床診斷亞急性型（中等毒力毒株）癥狀同急性型，但較輕死亡率低持續(xù)時間長（3周）慢性型（低毒力毒株）消瘦或發(fā)育遲緩，體弱偶見體溫升高，波狀熱呼吸困難，濕咳懷孕母豬流產(chǎn)多處皮膚局部紅斑、潰瘍耳部、腹部、大腿內(nèi)側(cè)可能凸起或壞死易繼發(fā)感染，如繼發(fā)引起肺炎和關(guān)節(jié)炎感染后能康復(fù)，但終身帶毒死亡率低，可見血清轉(zhuǎn)陽12第12頁，共71頁。臨床診斷各種毒力的毒株均可導(dǎo)致流產(chǎn)胎兒可能全身水腫胎盤、皮膚、心肌或肝臟可能有淤血點(diǎn)13第13頁，共71頁。診斷病理診斷脾臟腫大 易碎暗紅色至黑色1

5、4第14頁，共71頁。胃、肝、腎各部位淋巴結(jié)腫 大、出血；15第15頁，共71頁。水腫肺、肝、膀胱膽囊充盈結(jié)腸系膜16第16頁，共71頁。腎皮質(zhì)出血點(diǎn)、出血斑出血瘀點(diǎn)瘀斑17第17頁，共71頁。慢性型纖維素性心包炎，并可見出血點(diǎn)肺局部肉變，實(shí)變肺部局部肉芽腫，形成結(jié)節(jié)18第18頁，共71頁。圖1：ASF豬尸體底部的發(fā)紺病變。圖2：耳尖的發(fā)紺病變。圖3：血性腹瀉（血痢）。圖4：急性ASF死豬肺小葉間的水腫。19第19頁，共71頁。圖5：胃的基底膜淤血（急性）圖6：典型腫大脆化脾。（黑漿果脾，急性ASF）圖7：病豬脾（上）與正常脾大小的比較。（急性ASF） 圖8：急性ASF豬腫大的褐色脾。（巴西品

6、種）20第20頁，共71頁。圖9：腎淤斑及出血點(diǎn)（急性）圖10：腎盂及腎乳頭部的出血斑（急性）圖11：腎盂處散在的出血點(diǎn)（急性ASF）圖12：腫大、出血的肝胃淋巴結(jié)，可出見有血凝塊。（急性）21第21頁，共71頁。圖13：肝胃淋巴結(jié)切面，腫大并呈暗紅色。（急性ASF） 圖14：心包積液及心包肌層有散在的出血點(diǎn)。（急性ASF）圖15：膽囊水腫（急性ASF）圖16：肺部可見肉芽腫病變， 形成一結(jié)節(jié)（慢性ASF）22第22頁，共71頁。圖17：肺實(shí)變區(qū)（慢性ASF）圖18：心包臟層附有纖維素， 而且可見出血點(diǎn)（慢性ASF）23第23頁，共71頁。鑒別診斷高致病性藍(lán)耳病豬皮炎腎炎綜合征（PDNS）由P

7、CV-2引起細(xì)菌性敗血癥香豆素中毒真菌毒素中毒。2017/5/1524第24頁，共71頁。VirusAb感染表現(xiàn)出臨床癥狀攜帶者病毒血癥: 感染后2-3天到8天，持續(xù)很長時間（數(shù)月） 特異性抗體: 從感染后的7-11天至數(shù)月，甚至數(shù)年排毒:從 感染早期（第2天）以后持續(xù)很長時間。甚至康復(fù)后。ASF感染的主要特征豬 (野豬和家豬)軟蜱25第25頁，共71頁。實(shí)驗(yàn)室診斷實(shí)驗(yàn)室診斷病原學(xué)血清學(xué)病毒分離 血細(xì)胞吸附試驗(yàn)直接免疫熒光法（FAT）普通PCR和熒光定量PCR雙抗體夾心ELISA測 定ASFV抗原間接ELISA測定ASF 特異性抗體阻斷ELISA檢測ASF 特異性抗體唯一確診單位：國家外來動物

8、疫病研究中心免疫印跡間接免疫熒光測抗體26第26頁，共71頁。實(shí)驗(yàn)室診斷血清樣品析出的血清不合格血液樣品分離好的血清單獨(dú) 包裝，并一一編號合格血液樣品27第27頁，共71頁。實(shí)驗(yàn)室診斷病原學(xué)樣品抗凝血淋巴結(jié)脾臟腎臟骨髓28第28頁，共71頁。實(shí)驗(yàn)室診斷的安全原則保障人員的安全穿戴：眼罩、手套、實(shí)驗(yàn)服、口罩和鞋套等行為：洗手、禁止聊天，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止食用食 物和飲料等了解化學(xué)試劑的特性和潛在的危險(xiǎn)保障樣品的安全防止樣品交叉污染一次性手套2017/5/1529第29頁，共71頁。良好的工作區(qū)域第一步實(shí)驗(yàn)前清潔試驗(yàn)區(qū)域（臺面、移液器等）注意消毒劑的期限第二步劃分不同的區(qū)域樣品處理（BSL-3提取病毒D

9、NA）PCR檢測（Mix配制、加DNA、擴(kuò)增等）ELISA檢測區(qū)域（加血清、洗滌、終止等）2017/5/1530第30頁，共71頁。GLP (good laboratory practice)原則制定一整套標(biāo)準(zhǔn)以確保質(zhì)量、可靠性和完整性， 可核查結(jié)論和可追溯性數(shù)據(jù)的報(bào)告。要點(diǎn)資源：組織、人員、設(shè)施和設(shè)備特征：檢測項(xiàng)目和測試系統(tǒng)規(guī)則：試驗(yàn)步驟、標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）結(jié)果：原始數(shù)據(jù)、最后報(bào)告和檔案質(zhì)量保證：獨(dú)立監(jiān)測的研究過程2017/5/1531第31頁，共71頁。實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)儲備278bp257bp英國Pirbright 實(shí)驗(yàn)室比對實(shí)驗(yàn)建立了豬瘟、非洲豬瘟的熒光定量PCR鑒別診斷方法雙抗體夾心

10、ELISA檢測抗原阻斷ELISA檢測抗體間接ELISA檢測抗體32第32頁，共71頁。間接ELISA檢測病毒抗原商品化試劑盒INGEZIM K3 (Ingenasa, Spain)價(jià)格比PCR便宜不需要復(fù)雜的操作適用于基層實(shí)驗(yàn)室敏感性低（慢性或亞急性）2017/5/1533第33頁，共71頁。分子生物學(xué)檢測方法O20u17r/a5,/1C5 . A., L. Edwards, and C. A. Batten. 2013. Virological diagnosis of African swine fever-comparative study of available tests. Vir

11、us research 173:150-158.34第34頁，共71頁。熒光PCR檢測病毒DNA35第35頁，共71頁。熒光PCR工作單樣品的可追溯性！2017/5/1536第36頁，共71頁。熒光PCR檢測病毒DNA-試劑準(zhǔn)備病毒DNA提取試劑盒非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒37第37頁，共71頁。熒光PCR檢測病毒DNA-試劑制備凍干蛋白酶K:將蛋白酶K溶解在4.5ml滅菌后的 蒸餾水中，將溶液以500l分裝，在-10C溫度下 儲存，直到使用。除抑制物緩沖液:將20ml無水乙醇加入原始小瓶 中混勻并進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)記和日期記錄。室溫儲存。沖洗緩沖液:將80ml無水乙醇加入原瓶中混勻并 進(jìn)行相

12、應(yīng)的標(biāo)記和日期記錄。室溫儲存。38第38頁，共71頁。熒光PCR檢測病毒DNA-儀器設(shè)備水浴鍋或金屬浴勻漿儀和勻漿管（陶珠）臺式離心機(jī)熒光PCR儀移液器39第39頁，共71頁。熒光PCR檢測病毒DNA-樣本處理組織樣本取100mg組織剪碎，加入1mlPBS研磨或勻漿，然后1050g或2000rpm離心10分鐘取上清全血（抗凝血）或血清直接吸取200l40第40頁，共71頁。提取病毒DNA將200 l結(jié)合緩沖液（綠蓋）和40 l蛋白酶K（20mg/mL）加入到1.5 ml離心管中。加入200 l樣本。每個提取程序都加入E+ 和 E- (200 l水)對照。立即混勻并在722C 溫度下孵育10分鐘

13、。將1.5 ml微離心管簡單離心操作，除去管蓋內(nèi)部的 水珠。將100 l異丙醇加入樣本試管，混勻。將過濾管放入收集管中，并將樣本移入過濾管。41第41頁，共71頁。提取病毒DNA （2）將過濾管以8000 g離心1分鐘。如果樣本依然留在過濾管中， 重復(fù)離心操作。扔掉收集管，將過濾管加入干凈的收集管中。將500 l除抑制物緩沖液（黑蓋）放入過濾管，以8000 g離心1分鐘。扔掉收集管，將過濾管放入干凈的收集管中。將500 l沖洗緩沖液（藍(lán)蓋）加入過濾管，以8000 g進(jìn)行1分 鐘離心操作。扔掉收集管，重復(fù)沖洗步驟（500 l沖洗緩沖液加入過濾管，以8000 g進(jìn)行1分鐘離心操作）。扔掉收集管，將

14、過濾管放入干凈的收集管中。以13,000 g進(jìn) 行10s離心操作以去除殘余的沖洗緩沖液。扔掉收集管，將過濾管放入干凈的1.5 ml微離心管中。42第42頁，共71頁。提取病毒DNA （3）將50 l100 l預(yù)熱的消毒蒸餾水加入過濾管（ 注意不要使用試劑盒中Elution buffer），以8000 g 進(jìn)行1分鐘離心操作。將DNA溶液在-10C溫度下儲存（有效期：12個 月），備用；如果DNA溶液在1-2小時內(nèi)用于PCR 操作，在43C溫度下短暫儲存，然后凍存。43第43頁，共71頁。熒光PCR檢測病毒DNAOIE方法配制反應(yīng)體系：反應(yīng)液溶解后，每個反應(yīng)管中加入18 l反應(yīng)液， 然后再加入2

15、 l模板；每次試驗(yàn)需設(shè)立反應(yīng)陽性對照（R+，綠管中的反 應(yīng)陽性對照）和反應(yīng)陰性對照（R-，滅菌水）44第44頁，共71頁。45第45頁，共71頁。熒光PCR檢測程序設(shè)置46第46頁，共71頁。熒光PCR檢測病毒DNA-實(shí)驗(yàn)結(jié)果47第47頁，共71頁。熒光PCR檢測病毒DNA-結(jié)果判定有效性：提取陽性對照（E+）和反應(yīng)陽性對照R+的Ct值應(yīng)小于35，且提取陰性對照（E-）和反應(yīng)陰性對 照（R-）無Ct值，則試驗(yàn)有效。陽性和陰性：當(dāng)樣品的擴(kuò)增結(jié)果有典型的擴(kuò)增曲線且Ct值小于37時可判定為陽性。當(dāng)樣品的擴(kuò)增結(jié)果在背 景信號之下或Ct值37時，判定為陰性結(jié)果?？梢蓸悠罚寒?dāng)樣品的Ct值大于35小于37并

16、且擴(kuò)增曲線 呈指數(shù)時被判定為可疑，當(dāng)擴(kuò)增曲線呈線性時判為陰 性?？梢蓸悠窇?yīng)當(dāng)重新提取病毒核酸檢測，如仍為可 疑，可判為陽性。48第48頁，共71頁。實(shí)時熒光RPA重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)等溫?cái)U(kuò)增（3742C）用時短：20分鐘靈敏度高操作簡單，便攜式儀器2017/5/1549第49頁，共71頁。實(shí)時熒光RPA檢測ASFV特異性強(qiáng)與其他病毒無交叉反應(yīng)敏感性高能檢測出不同基因型的毒株2017/5/1550第50頁，共71頁。實(shí)時熒光RPA檢測ASFV2017/5/15與熒光PCR具有較高的相關(guān)性概率回歸分析：最低可檢測出17個拷貝51第51頁，共71頁。ASFV的基因型22個基因型非洲22個型：西非I型

17、為主，東非基因型復(fù) 雜歐洲- I型意大利撒丁島，II型東歐和俄羅斯2017/5/1552第52頁，共71頁。2017/5/1553第53頁，共71頁。血清學(xué)檢測方法沒有疫苗！抗體=感染沒有中和抗體。感染早期既可以檢測出抗體（7- 12dpi）抗體持續(xù)很長時間2017/5/1554第54頁，共71頁。血清學(xué)檢測方法篩選（Screening by ELISA tests）OIE-ELISA 間接ELISA基于半純化病毒抗原商業(yè)化ELISA試劑盒INGEZIM PPA COMPAC K3 (INGENASA)使用VP73特異性單抗的阻斷ELISASVANOVIR 間接ELISA（重組抗原p30蛋白）

18、ID Screen 間接ELISA（包被p32、p62和p72蛋白）2017/5/1555第55頁，共71頁。確診免疫印跡(Immunoblotting)：半純化病毒抗原間接免疫熒光（IFI）：E70毒株感染的傳代細(xì)胞免疫過氧化物酶試驗(yàn)（IPT）：病毒感染的細(xì)胞對操作人員的要求較高血清學(xué)檢測方法56第56頁，共71頁。免疫印跡（IB）方法2017/5/1557第57頁，共71頁。間接免疫熒光（IIF）病毒感染細(xì)胞后加入待檢測血清，再加入標(biāo) 記熒光素的蛋白A。2017/5/1558第58頁，共71頁。免疫過氧化物酶（IPT）59第59頁，共71頁。非洲豬瘟間接ELISA抗體檢測試劑盒國家外來動物

19、疫病研究中心研發(fā)使用p30蛋白的優(yōu)點(diǎn)適用于早期感染敏感性和特異性較高Cubillos C, Gomez-Sebastian S, Moreno N, et al. 2013. African swine fever virus serodiagnosis: a general review with a focus on the analyses of African serum samples. Virus Res 173:159-167.60第60頁，共71頁。編號名稱裝量用法1預(yù)包被酶標(biāo)板5塊直接使用2酶標(biāo)抗體（100）300L/管1瓶用稀釋液做100倍稀釋3陽性血清25L /管1管用稀

20、釋液做40倍稀釋4陰性血清25L /管1管用稀釋液做40倍稀釋5稀釋液55mL/瓶1瓶直接使用6洗滌液（20）100mL/瓶1瓶用雙蒸水做20倍稀釋，按0.5比例加入吐溫-207吐溫-201.5mL/管1管直接使用8底物溶液30mL/瓶1瓶直接使用9終止液30mL/瓶1瓶直接使用組分與用法非洲豬瘟間接ELISA抗體檢測試劑盒61第61頁，共71頁。原理ASFV重組p30蛋白作為抗原包被奇數(shù)條作為檢測孔，使用 抗原稀釋液包被偶數(shù)條作為對照孔，樣品同時加入到檢測 孔與對照孔中，所測OD值之差用于結(jié)果判定。非洲豬瘟間接ELISA抗體檢測試劑盒123456789101112AS5S5BS6S6CS7S

21、7DS8S8ES1S1S9S9FS2S2S10S10GS3S3S11S11HS4S4S12S12注：P表示陽性血清對照孔；N表示陰性血清對照孔；S1、S2、S3、S4等表 示待檢血清孔。62第62頁，共71頁。檢測步驟待檢血清與陰陽對照血清使用樣品稀釋液做40倍稀釋。在A1、A2和B1、B2孔中加入稀釋后的陽性血清，50L/孔。在C1、C2和D1、D2孔中加入稀釋后的 陰性血清，50L/孔。在E1、E2加入稀釋后的待檢血清，50L/孔。37孵育60min。棄去反應(yīng)孔中的液體。每孔用洗滌液清洗4次，洗滌液（1）300L/孔。每次除去洗滌液后，在吸水 紙上拍打，除去殘留的液體。每孔加入酶標(biāo)抗體（1），50L/孔。37孵育30min。重復(fù)步驟4。每孔加入底物溶液，50L/孔。室溫避光作用10min。10.每孔中加入50L終止液，終止所有的反應(yīng)。11.用酶標(biāo)儀在450nm的波長下測定各孔OD450nm值，計(jì)算OD差。OD差=OD奇數(shù)孔-OD偶數(shù)孔結(jié)果判定陽性對照OD差0.5，陰性對照OD差0.2，試驗(yàn)結(jié)果有效；否則，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。待檢樣品OD差0.5，判為陽性。待檢樣品OD差0.5，判為陰性。非洲豬瘟間接ELISA抗體檢測試劑盒63第63頁，共71頁。血清學(xué)診斷小結(jié)商品化和OIE-ELIS