植物細(xì)胞工程的課程

1、植物細(xì)胞工程的課程植物細(xì)胞的構(gòu)造 第一章：緒論 第二章：第二章 植物細(xì)胞的全能性及其表達(dá) 第三章：體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ) 第四章：植物細(xì)胞及組織培養(yǎng) 第五章：原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞雜交 第六章：植物單細(xì)胞培養(yǎng)和次生物質(zhì)生產(chǎn) 主 要 內(nèi) 容主要參考書周維燕主編：2001潘瑞熾主編：2006李勝 李唯主編：2008主要參考書崔凱榮，戴若蘭主編：2000第一章 緒 論 1-1 植物細(xì)胞工程的概念和任務(wù) 一.基本概念 以植物細(xì)胞為基本單位在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖和人為操作，改變細(xì)胞的某些生物學(xué)特性，從而改良品種加速繁育植物個(gè)體或獲得有用物質(zhì)的技術(shù)。二.植物細(xì)胞工程的研究?jī)?nèi)容 1、細(xì)胞培養(yǎng)(Cell

2、 Culture)：?jiǎn)渭?xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)(67個(gè)細(xì)胞)、花粉及花藥、原生質(zhì)體（Protoplast Culture）等。 2、胚胎培養(yǎng)(Embryo culture)：Ovule、幼胚、成熟胚、Endosperm的離體培養(yǎng)。 3、組織培養(yǎng)(Tissue culture)：根組織、莖組織、葉肉組織、中柱鞘、形成層、髓組織、貯藏薄壁組織（大蒜瓣、洋蔥鱗莖、百合鱗片）、 珠心組織等。 4、器官培養(yǎng)(Organ culture)：Root、Shoot、Leaf、Flower、Fruit以及各部原基(芽原基、根原基)的培養(yǎng)。 5、細(xì)胞改造：細(xì)胞拆分、染色體轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)移。三.植物細(xì)胞工程研究的任務(wù)1、研究

3、植物器官、組織和細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下,所需要的有機(jī)營養(yǎng)、無機(jī)營養(yǎng)、植物激素等營養(yǎng)條件；所需的光、溫、氧等環(huán)境條件組培快繁、單倍體育種、抗性細(xì)胞系的誘變篩選、原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞雜交、超低溫冷凍貯藏種質(zhì)保存、人工種子制造和細(xì)胞改造等2、研究不同生理年齡、遺傳組成(基因型)的外植體在離體培養(yǎng)條件下進(jìn)行形態(tài)發(fā)生的規(guī)律植物生理生化、遺傳、發(fā)育生物學(xué)機(jī)理等研究，最終獲得轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品。3、研究離體培養(yǎng)條件下再生植株群體的遺傳穩(wěn)定性和變異性脫毒與快繁4、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)研究細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)與工業(yè)化生產(chǎn)。目前，在學(xué)科分類與代碼中，細(xì)胞工程采用(18. 7120)為代碼；國家自然科學(xué)基金委則用(C

4、010904) 作為“細(xì)胞工程”學(xué)科的代碼。植物生理學(xué)遺傳學(xué)分子生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)生物化學(xué)細(xì)胞工程學(xué)農(nóng)業(yè)應(yīng)用抗性細(xì)胞篩選單倍體育種稀缺品種的快繁人工種子生產(chǎn)無毒苗繁育細(xì)胞融合育種工業(yè)應(yīng)用化裝品生產(chǎn)保健品生產(chǎn)藥物生產(chǎn)醫(yī)藥應(yīng)用四大工程的基礎(chǔ)環(huán)境保護(hù)微生物學(xué)生物物理學(xué)胚胎學(xué)思考題：1植物細(xì)胞工程的研究?jī)?nèi)容包括哪些方面？2未來植物細(xì)胞工程研究的任務(wù)將涉及哪些方面？第二章 植物細(xì)胞的全能性及其表達(dá)2-1 植物細(xì)胞全能性(Totipotent) 一、概念 植物細(xì)胞具有該植物體全部遺傳的可能性,在一定條件下如同受精卵一樣,具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。 (1)植物細(xì)胞無論是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞,均具有該物種全

5、部的遺傳信息。 (2)每個(gè)植物細(xì)胞均具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。二、全能性實(shí)現(xiàn)的基本方式1、生命周期：以裸孢子體和配子體的世代交替來實(shí)現(xiàn)；2、細(xì)胞周期：DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄mRNM并翻譯為蛋白質(zhì)，使細(xì)胞全能性得以形成和保持。3、組織培養(yǎng)周期：在離體培養(yǎng)條件下通過細(xì)胞脫分化與再分化來實(shí)現(xiàn)全能性。組織培養(yǎng)周期生命周期細(xì)胞周期三.離體條件下全能性實(shí)現(xiàn)的基本途徑（一）細(xì)胞脫分化和再分化的概念 細(xì)胞脫分化(Dedifferentiation),即失去已分化細(xì)胞的典型特征,或消除了細(xì)胞分工,使之回復(fù)到分生組織狀態(tài),或胚性細(xì)胞狀態(tài),即細(xì)胞脫分化。細(xì)胞再分化(Redifferentiation)即在離體培養(yǎng)下

6、,重新恢復(fù)細(xì)胞分化能力,并經(jīng)歷器官發(fā)生和胚胎發(fā)生，形成單極性的芽、根或形成雙極性的胚狀體(Embryois),進(jìn)一步發(fā)育成完整植物體的過程。植物細(xì)胞脫分化和再分化示意圖細(xì) 胞分化細(xì) 胞分化脫分化分裂再分化幼年細(xì)胞多細(xì)胞團(tuán)形態(tài)建成完整植株 成熟細(xì)胞分生細(xì)胞多細(xì)胞團(tuán)形態(tài)建成DifferentiationRedifferentiation（二）植物細(xì)胞脫分化和再分化的條件 1、機(jī)械隔離與生理隔離 把器官、組織或細(xì)胞從整體植物上分離下來。 作用：脫離整體,消除整體遺傳信息的制約。 意義：促進(jìn)細(xì)胞、組織和器官的脫分化，使“全能性”得以表達(dá)。 2、植物激素的作用生長(zhǎng)素的作用 促進(jìn)胞質(zhì)分裂，啟動(dòng)細(xì)胞分裂。

7、機(jī)理：它與含精氨酸高的組蛋白結(jié)合,使一部分受阻遏的基因解除抑制狀態(tài)而活化,從而恢復(fù)轉(zhuǎn)錄(合成mRNA)和轉(zhuǎn)譯, 最終形成酶和蛋白質(zhì)。 細(xì)胞分裂素的作用: 促進(jìn)RNA合成與核分裂，使已經(jīng)脫分化的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)保持持續(xù)有絲分裂。 機(jī)理：作為tRNA反密碼子附近的一個(gè)堿基組分,并由此控制特殊mRNA的合成來促進(jìn)細(xì)胞的分裂。 2,4-D的作用 促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的脫分化和愈傷化。2-2. 細(xì)胞極性與胚狀體一、細(xì)胞極性（polarity） 是指細(xì)胞、器官和植株的兩個(gè)極端在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化上存在差異的現(xiàn)象。主要表現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)濃度的差異、細(xì)胞器數(shù)量的多少、核位置的偏向等方面。極性的建立會(huì)引發(fā)不均等分裂。 極性是細(xì)胞

8、分化的前提。薺菜胚的形成A、B 受精卵的第一次不均等分裂；CH胚與胚柄的形成；I球狀胚；J、K 由于球狀胚處的胚細(xì)胞垂周分裂，形成心形胚出現(xiàn)葉和根的分化，近胚柄側(cè)形成胚根；L魚雷形胚；M 成熟胚，具有子葉、胚根、胚芽，胚內(nèi)有維管束(Sinnott,1960).墨角藻受精卵極性建立過程A、未分化的合子；B、極性尚未穩(wěn)定的合子；C、極性的合子；D、胚胎 二、胚狀體 1、胚狀體的概念 離體培養(yǎng)條件下胚狀體起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，它經(jīng)歷胚胎發(fā)育過程所形成的類胚結(jié)構(gòu)。 胚狀體是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，僅限于離體培養(yǎng)范疇內(nèi)使用，區(qū)別于無融合生殖的胚。 胚狀體起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚； 胚狀體的形成經(jīng)歷與合子胚

9、相似的發(fā)育過程， 從球形胚、心 形胚、魚雷胚到成熟胚，它區(qū)別于離體培養(yǎng)時(shí)分化的芽體。2、胚狀體的類別 體細(xì)胞胚： 來源于根、莖、葉以及它們的組織和細(xì)胞，經(jīng)離體培養(yǎng)而發(fā)生的類胚結(jié)構(gòu)。其染色體組為兩套，可發(fā)育成正?？捎闹参矬w。三倍體胚： 來源于胚乳細(xì)胞的胚狀體，具有三套染色體組。如巴豆、蓖麻、桃等。三倍體植物具有不育性。生殖細(xì)胞胚： 來源于大孢子和小孢子細(xì)胞（來源于小孢子的又稱花粉胚），經(jīng)離體培養(yǎng)而形成的類胚結(jié)構(gòu)。染色體為單套，可發(fā)育成單倍體植株，經(jīng)染色體加倍后才能形成可育的植物體。(3) 胚狀體的特點(diǎn)兩極性：胚狀體在其發(fā)育的最早階段就具有根端(胚根)和莖端。胚狀體與培養(yǎng)的供體外植體的維管組織無

10、直接聯(lián)系。 石龍芮下胚軸胚狀體的發(fā)生A、培養(yǎng)一個(gè)月的幼苗，下胚軸上產(chǎn)生許多胚狀體；B、下胚軸部分放大；C、兩個(gè)表皮細(xì)胞；DG 原胚發(fā)生過程；J、心形胚狀體；H、I 已分化子葉、胚根及原維管束的胚狀體。胡蘿卜胚狀體與合子胚發(fā)生過程的比較 A、合子胚；B、胚狀體23 培養(yǎng)基組成對(duì)細(xì)胞全能性表達(dá)的影響一、培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成（一）無機(jī)鹽混合物: 1、大量元素: N、P、K、Ca、Mg、S 硝酸鹽: KNO3、NH4NO3、NaNO3、Ca(NO3)2 其中鉀鹽不低于25 mmol/L 。 銨鹽: NH4NO3、NH4H2P04、(NH4)2S04 Ca、Mg、S 離子濃度約在13 mmol/L 之間。

11、其中銨鹽量不超過8 mmol/L。 但單細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)氮源的要求相對(duì)較高，二者量可上升到60 mmol/L ；無機(jī)氮素(硝態(tài)氮和銨態(tài)氮)濃度過高時(shí)，對(duì)細(xì)胞分裂很不利，二者比例是應(yīng)用中值得特別重視的問題。2、微量元素： Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo、Cl、Co、I （在土壤和有機(jī)體中含量?jī)H“幾/10萬幾/萬”）3、無機(jī)鹽混合物的作用： 供給培養(yǎng)細(xì)胞無機(jī)營養(yǎng)； 維持培養(yǎng)基的酸堿度：通過影響蛋白質(zhì)的等 電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)破壞（過高或過低）； 維持培養(yǎng)基的滲透壓。（二）有機(jī)物類 1、 碳水化合物是培養(yǎng)細(xì)胞的碳源和能源 蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖 （總：10 150 g/L ）； 2、維生素類 鹽酸硫胺素(

12、VB1)：阻止愈傷組織就會(huì)褐變死亡。常用量 為0.41 mg/L 。 鹽酸吡哆素(VB6)、促進(jìn)根的生長(zhǎng)，常用量為0.5mg/L。 煙酸(Vpp)：促進(jìn)植物代謝和胚胎發(fā)育， 常用量為 0.5mg/L?？箟难?VC)：具有防止組織褐變，抵制多酚類物質(zhì)作用。 肌醇(Myo-inositol):促進(jìn)細(xì)胞壁的形成，愈傷組織的增殖。一般為100mg/L。 葉酸(VBc)：參與核酸合成。生物素(VH)：羧化酶的輔基，與糖、脂肪、蛋白質(zhì)和核酸代謝有關(guān) 。 在胚胎發(fā)生中，多種氨基酸混合使用，會(huì)起到更好的促進(jìn)作用。常用的有：甘氨酸、絲氨酸、谷氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等。其中甘氨酸是基本培養(yǎng)基中重要的成

13、分。（三）氨基酸和酰胺類物質(zhì)（四）植物激素類1、類型：1）生長(zhǎng)素類: IAA、NAA 2,4-D、IBA等；2）細(xì)胞分裂素: KT (動(dòng)力精)、6-BA(BAP)、(ZT)、2ip（戊烯基腺嘌呤）； 3）赤霉素:雙萜類60余種，常用赤霉酸(GA3)；4）脫落酸(ABA)。2、生物“活性”:生長(zhǎng)素活性: 24-D NAA IAA細(xì)胞分裂素的活性: ZT BA KT 腺嘌呤。ZT的活性比KT高 10倍，KT的活性比腺嘌呤大3萬倍。（五）天然復(fù)合物類1、水解蛋白類:水解酪蛋白(酪朊素的水解物)，水解乳蛋白(乳蛋白的水解物)等。2、釀酒副產(chǎn)品:酵母提取物、麥芽。3、胚乳液:椰子乳汁、玉米胚乳和其他禾本

14、科、乳熟期的胚乳汁。4、果汁:番茄汁、馬鈴薯汁、香蕉汁、橘子汁、李子汁、葡萄汁。天然復(fù)合物對(duì)啟動(dòng)植物細(xì)胞脫分化和再分化是有效的。但不同植物種適宜的天然復(fù)合物種類是不同的。 二、 培養(yǎng)基的滲透壓 1、由培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的總濃度決定的； 2、培養(yǎng)細(xì)胞是通過細(xì)胞滲透壓來吸取營養(yǎng)的； 當(dāng)培養(yǎng)基總濃度低于培養(yǎng)細(xì)胞液濃度（一定范圍），即培養(yǎng)細(xì)胞的滲透勢(shì)低于培養(yǎng)基滲透勢(shì)時(shí),培養(yǎng)的組織細(xì)胞才可能從培養(yǎng)基中平衡汲取養(yǎng)分和水分。 3、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要是糖對(duì)培養(yǎng)基滲透壓起決定性作用。其他如甘露醇、鹽類等。 4、培養(yǎng)基糖濃度應(yīng)根據(jù)不同植物種類和不同培養(yǎng)目的進(jìn)行篩選。三、培養(yǎng)基的酸堿度1、精確調(diào)試：用pH 測(cè)定計(jì)直接測(cè)

15、定pH值，適用于單細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)。2、粗放調(diào)試：pH值試紙比色測(cè)定，方法簡(jiǎn)單、適用于器官和組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基pH 值用1 mol/L HCl或 KOH 進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)的依據(jù): 1)按照植物長(zhǎng)期生活所適應(yīng)的酸堿度來調(diào)節(jié)：如長(zhǎng)江以南地區(qū)偏酸（紅壤），北方地區(qū)偏中性或微堿性。多數(shù)植物適應(yīng)的pH 值范圍是5.86.0，有些適應(yīng)范圍則寬些。 果樹：蘋果5.86.0 葡萄5.76.0 桃6.07.0 荔枝5.8 2)依據(jù)培養(yǎng)基硬度： 培養(yǎng)基PH升高,其硬度增加;PH降低,硬度下降； 3) 依據(jù)培養(yǎng)基中某些物質(zhì)的穩(wěn)定性： 如FeCl2 pH6.2 失效 檸檬酸鐵 pH6.0 失效 EDTA-Fe pH7.

16、0 未失效(螯合鐵,能忍耐高pH,) 赤霉素: pH34時(shí),最穩(wěn)定, pH1或 pH 7.5時(shí)分解失活。2-4 影響細(xì)胞全能性表達(dá)的因素 一、環(huán)境因素(一) 濕度條件1、微環(huán)境中（試管、三角瓶）相對(duì)濕度常常達(dá)到100%。2、周圍環(huán)境的相對(duì)濕度低于60%時(shí)，培養(yǎng)基容易干涸而會(huì)改變培養(yǎng)基的滲透壓。3、周圍環(huán)境濕度過高時(shí)，培養(yǎng)室潮濕，具備各種細(xì)菌和霉菌的滋生條件，造成培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的污染。4、周圍環(huán)境較適宜的相對(duì)濕度為70%80%。(二) 溫度條件1、范圍:1035； 最適: 28左右。2、確定根據(jù)： 植物種類的起源和生態(tài)型 （喜溫還是喜涼）；晝夜溫差 。(三) 光照條件1、光周期的調(diào)節(jié) 三種基本

17、方式：全暗、周期照光、散射性照光。 常用光量范圍:10004000 Lx (勒克斯)，離體培養(yǎng)中通常難以達(dá)到4000 Lx,一般光量在20003000 Lx 。 100Lx1.9molm-2s-1（量子通量密度）2、培養(yǎng)光照的確定： 依培養(yǎng)發(fā)育階段：愈傷組織階段弱，以后逐漸加強(qiáng)。3、光質(zhì)： 一般用白熾熒光燈（日光燈），其光譜成分主要是藍(lán)紫光，波長(zhǎng)為419 467nm。 新型冷光源：LED光源，具有節(jié)能，光質(zhì)純，可調(diào)節(jié)性強(qiáng)等特點(diǎn)。 芽分化：籃紫光有效（450 540nm），紅光無效。 根分化：紅光有效（ 600 680nm ），藍(lán)光無效。 不同光質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物的分化有重要影響： 基本方式：紅光與遠(yuǎn)紅光；藍(lán)紫光與紅光。 可能的效應(yīng)： 紅