瘧原蟲鏡檢技術培訓手冊

1、目 錄瘧原蟲生活史一、概述二、人體內發(fā)育三、蚊體內的發(fā)育瘧原蟲鏡下形態(tài)一、薄血膜中瘧原蟲形態(tài)二、厚血膜中瘧原蟲形態(tài)顯微鏡使用及維護一、顯微鏡的構造二、顯微鏡使用 三、使用注意事項四、顯微鏡的維護保養(yǎng)血片制作與染色一、血片制作二、血膜的染色瘧原蟲鏡檢技術一、血液二、血液中各種正常細胞形態(tài)三、薄血膜鏡檢四、厚血膜鏡檢五、雜質與瘧原蟲的鑒別六、瘧原蟲計數附錄：瘧原蟲圖譜第一章 瘧原蟲生活史一、概述瘧原蟲是瘧疾的病原體。瘧原蟲為單細胞真核生物，屬原生動物亞界頂端復合物門、孢子綱、真球蟲目、瘧原蟲科、瘧原蟲屬。人體瘧原蟲有4種：間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）、惡性瘧原蟲(P.falcip

2、arum)、三日瘧原蟲(P.malariae)和卵形瘧原蟲(P.ovale)，依次引起間日瘧、惡性瘧、三日瘧和卵形瘧。在我國間日瘧較常見，惡性瘧次之，但對人體危害較間日瘧嚴重，三日瘧偶爾發(fā)現，卵形瘧已無病例報告。4種人體瘧原蟲的生物學特征見表1-1。瘧原蟲的發(fā)育和繁殖，必須通過脊椎動物與昆蟲媒介兩個宿主，人體瘧原蟲的宿主是人和按蚊。瘧原蟲在人體分別寄生于肝實質細胞和血液中的紅細胞內，在蚊體內則寄生于蚊胃，最后積聚于唾腺。4種人體瘧原蟲的生活史基本相同，包括在人體內的紅細胞外期和紅細胞內期以及在蚊體內的配子生殖和孢子增殖兩個階段。二、人體內發(fā)育瘧原蟲在人體內的發(fā)育分成肝細胞內的發(fā)育和紅細胞內的發(fā)

3、育兩個階段。（一） 紅細胞外期按蚊吸人血時，按蚊唾腺中的子孢子隨唾液進入人體的末梢血液中，在30分鐘內，隨血流進入肝臟，在肝實質細胞內發(fā)育，進行裂體增殖，此時期稱紅細胞外期（簡稱紅外期）或肝細胞期（簡稱肝期），此時期的瘧原蟲稱肝期裂殖體。成熟肝期裂殖體直徑為4560m，內含數以萬計的肝期裂殖子。肝期裂殖體成熟致使肝細胞破裂，肝期裂殖子釋入血液。不同種瘧原蟲的此期所需時間不同，從612天不等。間日瘧原蟲的紅外期裂體增殖較為復雜。目前認為間日瘧原蟲的子孢子在遺傳學上具有兩種不同的類型，即速發(fā)型子孢子和遲發(fā)型子孢子。速發(fā)型子孢子侵入肝細胞后，遂開始紅外期裂體增殖，釋放出肝期裂殖子侵入紅細胞，經裂體增

4、殖引起臨床發(fā)作。遲發(fā)型子孢子侵入肝細胞后暫不繼續(xù)發(fā)育，處于休眠狀態(tài)（休眠體），經過一段休眠期后，再發(fā)育成為成熟的紅外期裂殖體，釋放出肝期裂殖子侵入紅細胞引起復發(fā)。惡性瘧原蟲和三日瘧原蟲無遲發(fā)型子孢子，因而惡性瘧和三日瘧也無復發(fā)現象（二）紅細胞內期 紅外期裂殖子從肝細胞釋放出來進入血液后，一部分被吞噬細胞消滅，一部分在數分鐘后侵入紅細胞并開始發(fā)育，進行裂體增殖，這個時期稱為紅細胞內期(簡稱紅內期)。裂殖子進入紅細胞后，其細胞質內出現一個較大的空泡，最初為圓形，細胞質少，圍繞著空泡，細胞核在蟲體的一側，頗似戒指的寶石，發(fā)育成早期滋養(yǎng)體（亦稱環(huán)狀體）。以后逐漸發(fā)育，蟲體和細胞核都漸漸增大，細胞質增多

5、，并分解血紅蛋白產生瘧色素，其色澤、形狀有種的差別，此時的瘧原蟲稱為晚期滋養(yǎng)體（亦稱大滋養(yǎng)體），因其細胞質向外伸出不規(guī)則的偽足，能呈阿米巴樣運動，也稱為阿米巴樣體。惡性瘧原蟲的環(huán)狀體，在外周血液中經十幾個小時的發(fā)育，逐漸隱匿在微血管、血竇或其他血流緩慢處，發(fā)育成大滋養(yǎng)體及裂殖體，因此在外周血液中很難看到這兩個時期。瘧原蟲由小滋養(yǎng)體發(fā)育成大滋養(yǎng)體的時間間日瘧約須8-10個小時，惡性瘧原蟲10余個小時。大滋養(yǎng)體發(fā)育成熟后蟲體變圓，胞質內的空泡消失，核開始分裂，逐漸發(fā)育成為成熟裂殖體。成熟裂殖體的每個核被一份胞質包繞，核的數量因不同蟲種而異，一般為832個，稱為裂殖子。裂殖體成熟后，被寄生的紅細胞破

6、裂，釋放出裂殖子。破裂的紅細胞碎片、裂殖子和瘧色素等進入血液，引起瘧疾臨床發(fā)作。一部分裂殖子被巨噬細胞吞食，一部分裂殖子再侵入正常紅細胞，開始新一輪的紅內期發(fā)育，如此循環(huán)往復，稱為裂體增殖周期。紅內期發(fā)育成熟的時間，因不同蟲種而異，間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲為48小時，惡性瘧原蟲為2438小時，三日瘧原蟲為72小時，產生相應的間日發(fā)熱和三日發(fā)熱等不同發(fā)熱周期。紅細胞內的瘧原蟲經過數次裂體增殖后，部分侵入紅細胞的裂殖子不再進行核分裂，而逐漸發(fā)育成為雌、雄配子體，或稱大、小配子體，這是瘧原蟲有性生殖的開始。成熟的雌、雄配子體被雌性按蚊吸入后，便在蚊胃內進行有性生殖。瘧原蟲的生活史參見圖1-1。三、蚊體

7、內的發(fā)育在按蚊叮吸攜帶有雌、雄配子體的人血時，紅內期瘧原蟲進入蚊胃，但只有雌、雄配子體能在蚊體內發(fā)育和繁殖，其余各期均被消化。雌、雄配子體在蚊體內的發(fā)育和繁殖，包括配子生殖和孢子增殖兩個期。（一）配子生殖在蚊胃內，雌配子體的核經過減數分裂，形成圓形不活動的雌配子。雄配子體的核分裂成48個，細胞漿伸出鞭毛狀細絲，每1細胞核進入一條鞭毛狀細絲內，形成雄配子。雄配子游近雌配子，雌、雄配子結合形成圓形的合子，并進一步發(fā)育成長形能蠕動的動合子。動合子穿過蚊胃壁的上皮細胞，停留于上皮細胞和彈性纖維膜之間，發(fā)育成卵囊。此時約為吸血后的第2472小時。（二）孢子增殖在卵囊內核反復分裂，形成許多梭狀子孢子。蚊胃

8、壁上的卵囊可有數個到數十個或上百個，一個發(fā)育成熟的卵囊內可有1 000到10 000個子孢子。瘧原蟲在蚊體內發(fā)育時間的長短與溫度和濕度有關，室溫2426，相對濕度7580，是蚊體內瘧原蟲孢子生殖最適宜的條件。氣溫低于16或高于30時，發(fā)育變慢，并退化變性，直至死亡。成熟子孢子通過卵囊的微孔逸出或卵囊破裂后擴散入血腔，最后聚集于唾腺內。當含子孢子的雌蚊吸血時，子孢子隨唾液進入人體，瘧原蟲開始其在人體內的發(fā)育過程。表1 4種人體瘧原蟲的生物學特征惡性瘧原蟲間日瘧原蟲卵形瘧原蟲三日瘧原蟲紅外期發(fā)育天數58914-15休眠體無有有無紅外期裂殖子數30000100001500015000裂體增殖周期（小

9、時）36-48484872寄生的紅細胞特征幼紅細胞Duffy陽性網織紅細胞和幼紅細胞網織紅細胞和幼紅細胞正常紅細胞紅細胞脹大無明顯脹大略脹大無紅細胞斑點茂氏點薛氏點薛氏點齊氏點瘧色素黃褐色棕黃色棕黃色深褐色紅內期裂殖子數8-2612-246-126-12配子體新月/臘腸形圓形圓形圓形蚊內發(fā)育天數108-912-1414-15卵囊內瘧色素鏈狀和條狀皇冠羽毛狀交叉線聚集于邊緣圖1-1瘧原蟲的生活史 瘧原蟲鏡下形態(tài)采患者的血液制作涂片并染色后，可以在顯微鏡下觀察到瘧原蟲形態(tài)。常用的血涂片有兩種：一種是借推片將血液薄薄地涂在載玻片上，使每個紅細胞平鋪在玻片上，稱薄血膜，因薄血膜血液干燥快，原蟲形態(tài)極少

10、變形，多用于以觀察瘧原蟲形態(tài)與鑒別蟲種；另一種是把較多的血液涂成圓形，血膜中血細胞重疊，原蟲較為集中，稱為厚血膜。厚血膜涂布面積小，陽性檢出率高，厚血膜的鏡檢效率比薄血膜約高六倍?，F常用的一張載玻片上同時做厚薄血膜各一，厚血膜用來檢查，薄血膜供編號和鑒別蟲種用。一、薄血膜中瘧原蟲形態(tài)薄血膜涂制均勻時瘧原蟲著色良好，結構清晰，便于觀察形態(tài)和鑒別蟲種。薄血膜上各種紅內期瘧原蟲的形態(tài)，見表2-1和圖2-1核被寄生的紅細胞胞漿空泡 薛氏小點瘧色素核 表2-1 四種瘧原蟲薄血膜形態(tài)鑒別(吉氏染色)間日瘧原蟲惡性瘧原蟲三日瘧原蟲卵形瘧原蟲被寄生紅細胞大小形狀脹大正常正?；蚩s小正?；蛏悦洿?，卵圓形或邊緣呈傘

11、矢狀顏色褪色正?；蛏宰险Ｍ噬唿c薛氏點出現稍晚，紅色，細小數多茂氏點紅色，粗大數少齊氏點淡紅色，微細薛氏點出現較早粗大，數多小滋養(yǎng)體大小較大，約占紅細胞直徑的1/ 3小環(huán)狀體較小，約占紅細胞直徑1/6, 大環(huán)狀體與間日瘧原蟲相似中等中等核1個1或2個1個1個胞漿較薄小環(huán)狀體纖細，大環(huán)狀體與間日瘧原蟲相似較粗厚較粗厚色素無無偶見細小褐色顆粒無大滋養(yǎng)體大小較大較小較小較小核多見1個1或2個1個1個胞漿阿米巴樣，常含空泡圓形，空泡不顯著帶狀，空泡不顯著圓形，空泡不顯著色素黃褐色，細小，桿狀，散在分布黃褐色，細小，結成團塊后，呈黑褐色深褐色，粗大，沿邊緣分布棕黃色，較粗大未成熟裂殖體大小較大較小較小

12、較小核2個以上2個以上2個以上2個以上胞漿圓形或不規(guī)則，空泡消失圓形，空泡消失圓形，空泡消失圓形或卵圓形，空泡消失色素黃褐色，分布不勻黑褐色團塊狀深褐色，分布不勻棕黃色，分布不勻成熟裂殖體大小大于正常紅細胞小于正常紅細胞小于正常紅細胞小于正常紅細胞裂殖子1224個，常為1618個，排列不規(guī)則，較大826個，常為818個，排列不規(guī)則，較小612個，常為8個，常排列如菊花狀，較大614個，常為8個，排列不規(guī)則，較大色素黃褐色，常聚集一側黑褐色團塊深褐色，常聚集中央棕黃色，聚集中央或一側雌配子體大小形狀大于正常紅細胞，圓形較大，新月形，兩端尖銳小于正常紅細胞，園形小于正常紅細胞，圓形核1個，較小，深

13、紅色，位于一側1個，較小，深紅色，位于中央1個，較小，深紅色，位于一側1個，較小，深紅色，位于一側胞漿深藍色深藍色深藍色深藍色色素黃褐色，均勻散在黑褐色，緊密分布于核周圍深褐色，均勻散在棕黃色，散在雄配子體大小形狀大于正常紅細胞，園形較大，臘腸形，兩端鈍園小于正常紅細胞，圓形小于正常紅細胞，圓形核1個，較大，淡紅色，位于中央1個，較大，淡紅色，位于中央1個，較大，淡紅色，位于中央1個，較大，淡紅色，位于中央胞漿淺藍色淺藍色或淡紅色淺藍色淺藍色色素黃褐色，均勻散在黑褐色，松散分布于核周圍深褐色，均勻散在棕黃色，散在 二、厚血膜中瘧原蟲形態(tài)厚血膜由于用血量多，細胞重疊，干燥緩慢，以致蟲體皺縮，空泡

14、消失，胞質變形，加之紅細胞溶解，所以蟲種和蟲體的鑒別比薄血膜困難。厚血膜中4種瘧原蟲形態(tài)鑒別要點，見表2-2表2-2 四種瘧原蟲厚血膜形態(tài)鑒別(吉氏染色)間日瘧原蟲惡性瘧原蟲三日瘧原蟲卵形瘧原蟲小滋養(yǎng)體較大。核1個，較大，胞漿較厚。常呈！或，狀較小。核12個，較小，胞漿纖細。常呈！、飛鳥、和斷環(huán)狀中等。核1個，較大，胞漿粗厚。常呈 環(huán)狀或鳥眼狀大小與間日瘧原蟲相似，胞漿致密，核較大。大滋養(yǎng)體較大。呈阿米巴樣，形狀不規(guī)則。核位于胞漿之中或外邊，胞漿?？s成圓形或斷裂成數塊。色素分布不勻較小。常呈圓形，色素細小或結成12個團塊中等。常呈圓形，色素粗大大小與間日瘧原蟲相似，胞漿呈深藍色，核較大裂殖體較

15、大。裂殖子1224個。裂殖子較大較小。裂殖子826個。裂殖子較小較小。612個。裂殖子大于間日瘧原蟲裂殖體大小與間日瘧原蟲相似，裂殖子614個，核較大配子體較大。圓形，色素粗大。雌配子體較大，核小，胞漿深藍色，雄配子體較小，核大，胞漿淺藍色雌配子體新月形，雄配子體臘腸形與間日瘧原蟲相似，但較小。色素較粗大卵圓形，大小與間日瘧原蟲相似， 雌配子體核致密，偏于一側，雄配子體核疏松色素黃褐色，細小。桿狀，或結成粗大顆粒。分布不勻黃褐色，顆粒細小，結成團塊后，呈黑褐色。配子體色素粗大，分布于核周圍有時小滋養(yǎng)體可見色素，深褐色，較粗大。沿邊分布色素顆粒較大，呈深棕色，分布彌散被寄生紅細胞常見紅細胞“影子

16、”和薛氏點可見紅細胞“影子”和茂氏點可見紅細胞“影子”小滋養(yǎng)體時即可見薛氏點其他?？刹榈礁麟A段的瘧原蟲僅見小滋養(yǎng)體(或)和配子體。一般不見大滋養(yǎng)體和裂殖體常可查到各階段瘧原蟲?？刹榈礁麟A段瘧原蟲圖2-1 間日瘧原蟲形態(tài)圖2-2 惡性瘧原蟲形態(tài)圖2-3三日瘧原蟲形態(tài)圖2-4卵形瘧原蟲形態(tài)第三章 顯微鏡使用及維護 發(fā)熱病人血涂片的顯微鏡檢查（簡稱發(fā)熱病人血檢）是瘧疾控制和檢測的重要手段，因此掌握顯微鏡的使用方法和日常維護是十分必要的。一、顯微鏡的構造 顯微鏡通常有4個部分組成：A.支撐系統(tǒng)；B.放大系統(tǒng)；C.照明系統(tǒng)；D.調節(jié)系統(tǒng)；見圖3-1。 圖3-1 顯微鏡的構造（）支撐系統(tǒng)：1，鏡座；2，鏡

17、臂；3，鏡頭座；4，載物臺；5，持片夾（圖3-2）。圖3-2 顯微鏡支撐系統(tǒng)（）放大系統(tǒng)：1、目鏡：放大尺寸為10倍（圖3-3）；圖3-3 顯微鏡目鏡2、物鏡：放大倍數分別為10倍、40倍、100倍，在使用100倍時需要使用鏡油（圖3-4）。圖3-4 顯微鏡物鏡（C）照明系統(tǒng)：1，反光鏡；2，聚光器；3，光圈；固定在聚光器內，它可以調節(jié)通過聚光器的光線的強弱（彩圖3-5）。圖3-5 顯微鏡照明系統(tǒng)D）調節(jié)系統(tǒng)：1，粗對焦螺旋；2，細對焦螺旋：緩慢移動觀察物用以精確調節(jié)；3，光圈調節(jié)杠桿；4，持片夾：控制玻片向前向后向左向右移動。二、顯微鏡使用 （一） 使用環(huán)境與工作習慣顯微鏡的工作場所應當清潔

18、、干燥、無震動、無腐蝕性氣體存在。臺面和凳子的高度要適當。鏡檢時，即便用單目顯微鏡，也須兩眼同時睜開。（二）聚光器及可變光闌的用法 一般的聚光鏡，在平行光照射的情況下，其焦點落在它上端透鏡平面中心上方約1.25mm處。當使用高倍或油鏡時，由于放大率大，鏡像亮度小，需要較強的照明。因此，應把聚光器升至最高，以便使聚光鏡的焦點正好落在標本平面上。但在使用低倍鏡時，可將聚光器適當下降。 可變光闌一是控制射向標本的光通量；二是改變聚光器的數值孔徑。在這兩個作用中，后者是主要的。為了使物鏡的分辨率得到充分的利用，從原則上說，聚光器的數值孔徑應與物鏡的相同。否則，分辨率或清晰度就要下降。 （三）物鏡的正確

19、調焦 對光完成后，升高鏡筒，將標本玻片夾在移動器上，并將欲檢查的部分移至載物臺通光孔的中央，然后開始調焦。 無論作何種檢查，均應從低倍鏡開始。調焦時，先用粗動手輪將鏡筒下降，使低倍鏡的前透鏡與蓋玻片之間的距離略縮小于該物鏡的工作距離（5mm以下）。為了避免物鏡壓在載玻片上，可從側面窺視。然后，一邊從目鏡中觀察視野，一邊利用粗動手輪將鏡筒徐徐上升，待初見物像后，改用微動手輪作精細調焦，直至物像最清晰為止。低倍物鏡的視場大，有利于觀察標本的全貌。從低倍鏡轉換為高倍鏡時，如果物鏡是顯微鏡的原配物鏡，所用的載玻片、蓋玻片有符合標準，一般都可以進行等高轉換。即轉換后，只要稍微調節(jié)一下微調旋鈕，即可看到清

20、晰的圖像。但油鏡不強求齊焦，最好先將鏡筒升高后再轉換，最后按低倍鏡的調焦方法重新調焦。用油鏡觀察時，要先將物鏡移開，在要觀察的部位加一滴香柏油，然后將油鏡放正，并慢慢轉動粗調節(jié)器，降下鏡筒，使鏡頭浸入油滴中?？上陆抵翈缀跖c制片接觸，但切不可壓及玻片。然后，向上微微轉動粗調節(jié)器，使鏡筒上升，當視野中出現有模糊的影像時，改用細調節(jié)器向上轉到直至影像清晰為止。在使用油鏡時，在聚光鏡與標本之間滴加浸油，可提高物鏡的分辨率。在整個調焦過程中（尤其是高倍物鏡和油鏡的調焦），每個動作都要緩慢進行。否則，物像會一閃而過，找不到觀察目標。 油鏡使用完畢后，要及時將浸油擦拭干凈。鏡頭上可先用干凈的擦鏡紙擦干凈即行

21、。聚光鏡的擦拭方法與此相同。 三、使用注意事項（一） 取出顯微鏡時，要用右手握住執(zhí)手，左手托住鏡座，小心地放到桌面上，不可單手拎著移動。（二）任何旋鈕轉動有困難時，絕不能用力過大，而應查明原因，排除障礙。如果自己不能解決時，要向專業(yè)人員請求解決。所有的鏡頭均經校驗，請勿自行拆開。（三）保持顯微鏡的清潔，盡量避免灰塵落到鏡頭上，否則容易磨損鏡頭。同時要盡量避免試劑或溶液滴到顯微鏡上，特別是用高倍物鏡觀察時，鏡頭很容易被染料或試劑玷污，一旦被玷污，應立即用擦鏡紙擦拭干凈，油鏡頭還應使用清潔劑擦拭。由于光學玻璃比一般玻璃的硬度小，易于損傷。因此擦拭光學透鏡只能用專用的擦鏡紙，不能用棉花、棉布或其它物

22、品擦拭。擦時要先將擦鏡紙折疊為幾折，從一個方向輕輕擦拭鏡頭，每擦一次，擦鏡紙就要折疊一次，以免沾在擦鏡紙上的灰塵損傷透鏡，使鏡面出現一條條的劃痕。（四）每次使用結束時，并光源調節(jié)器調至最小后關閉，并將物鏡轉成“八”字形垂于鏡筒下，然后降下鏡筒，避免物鏡鏡頭下落時與聚光器相碰撞。顯微鏡應存放于陰涼干燥的地方，若放在潮濕處，一旦鏡片上著生霉菌，就會腐蝕鏡片，且很難除去。四、顯微鏡的維護保養(yǎng)（一） 防高熱：顯微鏡是由精密的機械和光學鏡頭組成的，由于各種材料熱膨脹系數不同，所以顯微鏡不能在陽光了曝曬，也不能放在靠近火爐和暖氣的地方。只能室內存放，其工作的溫度范圍一般為540。（二） 防潮：如果長期受潮

23、，透鏡很容易發(fā)霉，表面還會腐蝕，所以應在干燥環(huán)境下保存。在31時濕度不得大于80，溫度每升高3攝氏度，相對濕度要設法降低10。（三） 防塵 ：灰塵不僅會影響成像質量，而且灰塵中往往也帶有含酸、堿等腐蝕性的塵粒，容易腐蝕鏡面。而硬度大的塵粒還可能在擦拭鏡頭時在鏡面上劃出傷痕，損壞鏡頭。此外，灰塵掉進機械活動部分時容易造成機械部分轉動不靈活，甚至損壞。（四）防腐蝕：顯微鏡不能接觸酸類和堿類物質。也不要與揮發(fā)性很強的化學藥品及其它有害藥品放在一起，以免腐蝕鏡頭。（五）防震：顯微鏡是精密儀器，劇烈的震動會造成精密度的降低。要輕拿輕放，擱置要平穩(wěn)，使用時動作應輕柔。（六）擦拭：.機械裝置的擦拭:機械裝置

24、如有污漬，可用干凈的柔軟細布擦拭；如果擦不掉，可用擦鏡紙或細綢布蘸點二甲苯擦拭。應注意不能用酒精、乙醚等化學品，以免腐蝕裝置表面的油漆。光學鏡頭的擦拭：一般采用先吹，后刷，再擦拭的方法。吹，就是用吹氣球(或用洗耳球)吹掉鏡頭表面的附著物。但不能用口直接吹氣。吹不掉時，可用干凈的專用清潔毛刷輕輕地刷。經上述兩種方法處理后鏡頭表面仍有污物時，用擦鏡紙稍蘸一點二甲苯或是專用清潔劑輕輕擦拭。如果發(fā)現鏡頭發(fā)霉長霧時，可用擦鏡紙蘸少許無水酒精和乙醚的混合液擦拭，但液體不能太多，停留時間要短，以免滲入鏡頭內部造成腐蝕。 油鏡頭每次用過后要及時擦拭，先用干擦鏡紙擦一兩次，把大部分介質油去掉，再用二甲苯滴濕擦鏡

25、紙擦兩次，最后再用干擦鏡紙擦一次。第四章 血片制作與染色一、血片制作（一）所需器材1、載玻片：玻片使用前應清洗。新玻片應先浸入有液態(tài)洗滌劑的清水中1020分鐘，然后用干凈棉巾逐個擦拭，再用清水沖洗干凈，晾干，最后用干凈、柔軟的棉巾將玻片擦亮。用于特殊的目的時，最后可將玻片浸泡在95酒精中510分鐘，再將玻片擦干擦亮。已用過的玻片應先浸泡于洗滌劑溶液中12天，或浸泡于煮沸的5肥皂水中12小時，再移到新配置的洗滌劑溶液中12小時，逐個擦去玻片上舊的血膜痕跡，用清水漂洗干凈，再將玻片擦干擦亮。洗凈的玻片每1020張用白紙包好放入塑料袋內，保存于干燥環(huán)境中備用。2、采血針：使用一次性釆血針。3、玻片盒

26、：為防止污染和蒼蠅吸食血膜，新制作的血膜應放在玻片盒中，厚血膜放置時要保持水平，直到充分干燥。4、75酒精棉球：用于采血前后的消毒。5、記號筆或鉛筆：用于玻片上書寫號碼。（二）采血部位及取血方法采血部位以耳垂較為合適，也可在手指末端采血，嬰兒可從拇趾或足跟取血。先用75酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血針迅速刺入取血部位12mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指協(xié)同擠出血滴。（三）涂制血膜取玻片2張，1張作載片，1張作推片（具有光滑邊緣）。用右手拇指和食指夾持推片側緣中部，用推片的左下角刮取血液45l，再用該端中部刮取血液11.5l。將左下角的血滴涂于載片的中央偏右處，由里向外劃圈涂成直徑

27、為0.81cm的圓形厚血膜（厚度以1個油鏡視野內可見到510個白細胞為宜）。用干棉球抹凈玻片角上的血漬，然后將推片下緣平抵載玻片的中線，當血液在載玻片與推片之間向兩側擴展至約2cm寬時，使兩玻片保持2535角，從右向左迅速向前推成舌狀薄血膜，制成的薄血膜應在玻片上形成平鋪的血細胞，細胞之間互相接觸而不相互重疊。每張載玻片上分別做1個薄血膜，1個厚血膜。標準血膜的位置如圖4-1所示。取干凈玻片及推片各一張，用右手大拇指和食指夾持推片側緣中部，用推片的左下角刮取血液45l（約火柴頭大?。儆迷摱酥胁抗稳⊙?1.5l。將左下角的血滴涂于載片的中央偏右，由里向外劃圈涂成直徑為0.81cm的圓形厚血

28、膜（厚血膜的厚度以一個油鏡視野內可見到510個白細胞為宜）。用干棉球抹凈角上的血漬，然后將推片下緣平抵載玻片的中線，當血液在載玻片與推片之間向兩側擴展至約2cm寬時，使兩玻片保持2535角，從右向左迅速向前推成舌狀薄血膜。薄血膜 厚血膜 標記處圖4-1（四）血膜的保存血膜制成后，立即將受檢者號碼寫在玻片上，血膜朝下插入直豎的標本盒內，讓血膜自然干燥后才能染色。吉氏染色時薄血膜在染色前須經甲醇固定，而厚血膜在染色前必須溶血，但新制作的厚血膜也可直接染色。血膜放置時間，夏天不宜超過48小時，冬天不宜超過72小時，否則厚血膜會自然固定而不能溶血，影響鏡檢。不能及時染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，將

29、厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱內保存。臨用時，將干燥器放置室溫中12小時后取出血片。二、血膜的染色（一） 染色液的制備 目前常用的血膜染劑有吉氏和瑞氏兩種。吉氏染劑不僅適用于厚血膜和批量血膜的染色，而且效果穩(wěn)定，染色時間和染液濃度對染色結果影響較小，染色后的血膜保存時間較長，同時吉氏染劑能長期保存而不變質，染色技術也易掌握，被推薦使用。吉氏粉 5g，甲醇250ml，甘油250ml。將吉氏粉置于研缽中，加入少量甘油充分研磨，邊加邊磨，至甘油加完為止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研缽中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶內，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗凈研缽為止。塞緊瓶塞，

30、充分搖勻，室溫內放置，每天用力搖動溶液5分鐘，3天后即可使用。另一種方法是在帶有緊口瓶塞的硬質玻璃瓶中放入約50個玻璃珠（直徑35mm）。用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇緩慢地把所有染料粉沖入瓶內，將瓶塞塞緊，置于室溫內，每天用力搖動5分鐘，3天后即可使用，保存時間長則更好。（二）染色用水常用的染液的稀釋用水和染色的沖洗用水，是中性的蒸餾水或經煮沸過濾的冷開水，也可用井水、河水、泉水或雨水。為了使血膜著色較好，應用pH7.07.2水效果最佳。為此，可配制緩沖液用于染液的稀釋和染色后的沖洗。配制pH6.67.4緩沖液時，先制備好兩種貯備液。貯備液為每1 000ml蒸餾水含9.

31、5g 磷酸氫二鈉，貯備液為每1 000ml蒸餾水含9.07g 磷酸二氫鉀。配制pH6.67.4的緩沖液時，將兩種貯備液按一定比例混合后，用蒸餾水稀釋成各種濃度的溶液。兩種貯備液的用量見表4-1。表4-1 配制pH6.67.4緩沖液兩種貯備液用量表pH溶液溶液ml磷酸氫二鈉含量(g)ml磷酸二氫鉀含量(g)6.654.70.52148.81.356.868.40.65126.81.157.089.50.8599.20.907.196.80.9288.20.807.2105.01.0077.20.707.4126.31.2055.10.50注：用于薄血膜的染色和一般漂洗時，用蒸餾水稀釋至1 000

32、ml，用于厚血膜及同一張玻片上厚血膜與薄血膜的染色時，用蒸餾水稀釋至500ml。（三）吉氏染色方法染色前薄血膜要用甲醇或無水乙醇固定，厚血膜用蒸餾水或清水溶血。單張血膜染色可取蒸餾水或緩沖液1ml加入吉氏染液1滴，混合均勻后，滴在厚、薄血膜上，染色2030分鐘，然后水洗、晾干。成批染色時，將血膜朝一個方向插入染色缸中，或每對玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2吉氏染液(2ml吉氏原液同98ml蒸餾水緩沖液混勻），浸沒厚薄血膜，染色30分鐘后，向染色缸中注入緩沖液或自來水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，將染色缸中殘余的染液傾出，加入新水，反復沖洗23次，取出玻片，將血膜朝下插在晾片板

33、上干燥。染薄血膜時，染液濃度可稍高、時間稍長一些，而染厚血膜時，則染液濃度可稍低、時間稍短一些。當同一張玻片上厚血膜與薄血膜同時染色時，應按照厚血膜的染色方法，以免厚血膜過染而鏡檢困難。褪色或染色效果不佳時，可重新染色，先用二甲苯反復洗去血膜上的油跡，再用75酒精滴在厚、薄血膜上，用水反復沖洗數次，至厚血膜不見藍色為止。取1ml蒸餾水加入1滴吉氏染液，混勻后滴在厚、薄血膜上，染色14小時（根據血片存放時間而定)。清水沖洗23分鐘，加12滴75酒精于血膜上，12秒鐘后用水沖洗，待干。（四）影響血膜染色質量的因素血片染色好壞，除與玻片的清潔程度、血膜制作的質量和染色技術等有關外，還與下列因素有關:

34、1、染劑和溶劑的質量：染料、甲醇和甘油如不純，常使配成的染液偏酸或偏堿，影響染色效果。因此，必須用分析純的甲醇和中性甘油，配制時所用器具必須干凈無水。新配制的染液應先試染，以酸堿度最適宜的水稀釋，觀察染色是否理想，否則需重新制備染液。2、染液的新舊：新配制的染液，一般染色力較弱，且常呈堿性。染液放置時間稍長，染色力逐漸增加，故應在染色前12周先將染液制備好。盛染液的瓶子應密封，以免影響染液質量。3、染液的稀釋濃度：染液濃度高，著色快，各種細胞著色深，薛氏點、茂氏點等粗大顯著；染液濃度低，著色慢，但各種細胞內部結構著色均勻、清晰，如環(huán)狀體、子孢子及瘧色素等顏色分明，但薛氏點、茂氏點不夠清楚。染液

35、稀釋后，一般在半小時內使用，時間太長也會影響染色效果。4、染色時間：染色時間長，染色效果好，反之則差。染色時間長短與溫度有關，溫度高著色快，故染色時間可適當縮短，溫度低染色慢，則時間可適當延長。所以染色時間長短要隨著染液的質量、新舊、濃度及溫度而決定。5、稀釋和沖洗用水：為使厚、薄血膜著色好，應使稀釋的染液呈中性或稍偏堿性，故應用pH7.07.2的水稀釋。當染色太藍，可用pH較低的緩沖水沖洗；如染色太紅，則用pH較高的緩沖液沖洗；如染色太深，可延長沖洗時間，予以校正。6、沖洗方法：染色后不要直接將染液倒掉，應將玻片連同染液一起放在水中漂洗，或沿玻片及染色缸邊緣加水使染液表層溢出，并輕輕沖洗，以

36、免染液色素顆粒玷污血膜。如果你染色的質量不高應該做些什么？首先，檢查每一個技術步驟是否合理如果血涂片、固定、稀釋染液，清洗染液器具以及儲存各項操作都符合要求，你依然得不到合格的染色后的血片。那么很可能是水的質量不過關（PH值不合適）或者吉氏原液自身質量不過關。有時候僅僅是一些片子的染色不理想，這種情況下，可以重新涂片。如果情況不允許，你可以重新染色。瘧原蟲鏡檢技術瘧原蟲鏡檢時，首先須對正常薄厚血膜中各種細胞的形態(tài)、內部結構和染色性質加以識別。這樣在陽性血膜中才能及時正確診斷并判斷瘧原蟲的蟲種和各期形態(tài)。一、血液血液由血漿和血細胞組成。從血管取少量血液加入適量抗凝劑（如枸櫞酸鈉）經自然沉降或離心

37、沉淀后，血液可分出三層：上層為淡黃色的血漿，下層為紅細胞，中間的薄層為白細胞和血小板。血細胞約占血液容積的45%，包括紅細胞、白細胞和血小板。在正常生理情況下，血細胞和血小板有一定的形態(tài)結構，并有相對穩(wěn)定的數量。血細胞分類和計數的正常值如下： 紅細胞350萬550萬個/l 中性粒細胞5070有粒白細胞嗜酸性粒細胞0.53 白細胞 （粒細胞） 嗜堿性粒細胞01血細胞400010000個/l 淋巴細胞2030無粒白細胞血小板 單核細胞3810萬40萬個/l 二、血液中各種正常細胞形態(tài)（一）紅細胞：直徑通常是6m8m；形狀：人類的紅細胞是雙面凹的圓餅狀。邊緣較厚，而中間較薄，就好像是一個甜甜圈一樣，

38、只是當中沒有一個洞而已。這種形狀可以最大限度的從周圍攝取氧氣。 圖5-1 紅細胞（二）白細胞：血液中的白細胞有五種，按照體積從小到大是：淋巴細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞。1、淋巴細胞：占白細胞總數的2030，圓形或橢圓形，大小不等。直徑68m的為小淋巴細胞， 912m的為中淋巴細胞， 1320m的為大淋巴細胞。小淋巴細胞數量最多，細胞核圓形，一側常有小凹陷，染色質致密呈塊狀，著色深，核占細胞的大部，胞質很少，在核周成一窄緣，嗜堿性，染成蔚藍色，含少量嗜天青顆粒。中淋巴細胞和大淋巴細胞的核橢圓形，染色質較疏松，故著色較淺，胞質較多，胞質內也可見少量嗜天青顆粒。少數大、中

39、淋巴細胞的核呈腎形，胞質內含有較多的大嗜天青顆粒，稱為大顆粒淋巴細胞，見圖5-2。圖5-2淋巴細胞2、嗜堿性粒細胞呈圓形：數量最少，占白細胞總數的01%。細胞呈球形，直徑1012m。胞核分葉或呈S形或不規(guī)則形，著色較淺。胞質內含有嗜堿性顆粒，大小不等，分布不均，染成藍紫色，可覆蓋在核上（圖53）。圖5-3嗜堿性粒細胞3、嗜酸性粒細胞：占白細胞總數的0.53。細胞呈球形，直徑1015m，核常為23葉，呈眼鏡狀，深紫色，胞質內充滿粗大（直徑0.51.0m）、均勻、略帶折光性的嗜酸性顆粒，染成桔紅色（圖54）。通常有嗜酸性粒細胞容易破碎，顆粒可分散于細胞周圍。嗜酸性粒細胞也能作變形運動，并具有趨化性

40、。它能吞噬抗原抗體復合物，釋放組胺酶滅活組胺，從而減弱過敏反應。嗜酸性粒細胞還能借助抗體與某些寄生蟲表面結合，釋放顆粒內物質，殺滅寄生蟲。故而嗜酸性粒細胞具有抗過敏和抗寄生蟲作用。在過敏性疾病或寄生蟲病時，血液中嗜酸性粒細胞增多。它在血液中一般僅停留數小時，在組織中可存活812天。圖5-4 嗜酸性粒細胞4、中性粒細胞：中性粒細胞占白細胞總數的5070，是白細胞中數量最多的一種。細胞呈球形，直徑1012m，核染色質呈團塊狀。核的形態(tài)多樣，有的呈臘腸狀，稱桿狀核；有的呈分葉狀，葉間有細絲相連，稱分葉核。細胞核一般為25葉，正常人以23葉者居多。中性粒細胞的胞質染成粉紅色，含有許多細小的淡紫色及淡紅

41、色顆粒，顆?？煞譃槭忍烨囝w粒和特殊顆粒兩種。嗜天青顆粒較少，呈紫色，約占顆?？倲档?20%，光鏡下著色略深，體積較大。中性粒細胞在血液中停留約67小時，在組織中存活約13天。圖5-5中性粒細胞5、單核細胞：占白細胞總數的38。它是白細胞中體積最大的細胞。直徑1420m，呈圓形或橢圓形。胞核形態(tài)多樣，呈卵圓形、腎形、馬蹄形或不規(guī)則形等。核常偏位，染色質顆粒細而松散，故著色較淺。胞質較多，呈弱嗜堿性，含有許多細小的嗜天青顆粒，使胞質染成深淺不勻的灰藍色。顆粒內含有過氧化物酶、酸性磷酸酶、非特異性酯酶和溶菌酶，這些酶不僅與單核細胞的功能有關，而且可作為與淋巴細胞的鑒別點。圖5-6單核細胞（三）血小板

42、：血小板或稱血栓細胞, 正常數值為10萬40萬l。它是骨髓中巨核細胞胞質脫落下來的小塊，故無細胞核，表面有完整的細胞膜。血小板體積甚小，直徑24m，呈雙凸扁盤狀；當受到機械或化學刺激時，則伸出突起，呈不規(guī)則形。在血涂片中，血小板常呈多角形，聚集成群。血小板中央部分有著藍紫色的顆粒，周邊部呈均質淺藍色（圖57）。圖5-7 血小板三、薄血膜鏡檢鏡檢瘧原蟲一般查厚血膜，薄血膜僅作為原蟲分類時的參考和血片編號之用切記在只鏡檢薄血膜時不能得出陰性的結論。（一）各種瘧原蟲各期形態(tài)鑒別1、被寄生的紅細胞形態(tài)大小及染色深淺度（是否褪色）；2、胞漿色彩及其濃淡，結構疏密，有否空泡及不著色帶，體積大??；3、色素斑

43、點（薛氏點、茂氏點）；4、查其他各期形態(tài)是否存在作參考；5、色素顆粒的形態(tài)、顏色、排列。對于這一點應掌握，尤其是厚血膜更為重要。否則在形態(tài)鑒別上會混淆弄錯。（二）瘧色素顆粒鑒別1、與原蟲在同一水平面；2、有立體感；3、色澤特殊，只有單色（色澤與背景色有關，須將視野放暗些）；4、形狀如米粒狀、沙粒狀、顆粒狀、短桿狀，細?？赡鄢啥?。（三）大滋養(yǎng)體與大配子體的形態(tài)鑒別1、大滋養(yǎng)體：大小一般不超過被寄生的紅細胞的3/4。核一個或延長呈帶狀，周圍不著色帶不明顯。胞漿邊緣不整齊，有時有空泡。在厚血膜上表現有活動性，故形態(tài)變化很大，胞漿收縮不均勻，有時斷裂成團塊，瘧色素分布凌亂。2、大配子體：大小幾乎充滿

44、真?zhèn)€紅細胞。核一個，較緊密，常偏于一側，周圍有一圈不染色帶。胞漿邊緣整齊，無空泡。瘧色素平均散在分布。在厚血膜上則體形較小，胞漿收縮均勻，不染色帶明顯，瘧色素分布規(guī)則則沿邊分布。（四）裂殖子與血小板的形態(tài)鑒別1、血小板：由骨髓巨噬細胞成熟脫落后解離而成，因此結構松散，嚴格地說不是個完整細胞（無核）。在吉氏染色中多見顯淡紅色或淡紫色，中間顆粒為紫紅色，形狀近似石榴子，且邊緣不甚光滑。2、裂殖子：由成熟裂殖體破裂逸出，以致類似血小板聚集一起，或單個、或三五成群，但形體較血小板小，直徑微米。核較大，相對的難見到胞漿，核染深紅色或紫紅色，四周胞漿圍繞，染藍色，呈卵園形，邊緣光滑。如附近查有瘧色素顆粒是

45、有力的佐證。四、厚血膜鏡檢厚血膜由于細胞重迭，干燥緩慢，以致蟲體皺縮，空泡消失，胞質變形，加之紅細胞被溶解，所以蟲種和蟲體的鑒別比薄血膜困難，但用血量多，瘧原蟲鏡下密度高，因此檢出率，常用于瘧原蟲檢出。（一）檢查方法1、在厚血膜上先滴香柏油一滴，用油鏡（100）鏡檢。2、鏡檢時應從厚血膜上開始。從上而下，從左到右，在由右至左，這樣往返一行接一行，一個視野接一個視野順序的查完整個血膜。（二）鑒別要點1、在厚膜中必須根據瘧原蟲的核、胞漿、瘧色素三個條件鑒別是否是瘧原蟲及何種蟲種。在一般情況下，具備三條中的二條也能給以判定。2、有時因染色較淺，不見原蟲的核和胞漿，只見到典型的瘧色素可斷定。3、僅見到

46、核和少許胞漿，或者因染液過偏酸性連胞漿也看不清楚，同時又不見色素，但是只要對被染血膜的顏色、紅細胞的殘影、瘧原蟲所處的背景加以綜合分析，仍可正確做出判斷?？赐暄?，若為陽性，應立即按血片編號登記原蟲的種、期，以防差錯。為檢查后記錄結果方便起見，對瘧原蟲的種、期可使用英文字母縮寫作為代號。間日瘧=P.v；惡性瘧=P.f；三日瘧=P.m；卵形瘧=P.o；環(huán)形體=R（Ring form）；大滋養(yǎng)體=T(trophozoite)；裂殖體=S(Schizont)；配子體=G(Gametocytr)。五、雜質與瘧原蟲的鑒別由于染液和載玻片上可能存在雜質以及染液酸堿度的影響，常與瘧原蟲混淆，應注意鑒別！見圖5-8（一）疑似瘧色素 血魔上的染料殘渣及灰塵，有時被誤認為瘧色素，可依據顆粒的大小，色澤及分布范圍加以區(qū)別。轉動顯微鏡微調時，可見其浮于紅細胞上，與瘧原蟲不在一個平面。（二）疑似瘧原蟲核 細菌尤其是球菌或白細胞破裂后散出的顆粒，皆為紅色小點，最易混淆。但球菌形體較大，邊緣光滑，常多見聚集一處，分布較廣。嗜中性和嗜酸性粒細胞顆粒，著色較淡，邊緣整齊，附近常有白細胞的碎屑。（三）疑似瘧原蟲胞質 網織紅細胞殘留物和白細胞殘留物通常為藍色，與瘧原蟲的胞質相似，如與某些紅點結合在一起，易被誤認為是瘧原蟲。鑒別時如形同大滋養(yǎng)體，可依據瘧色素的特點加以區(qū)別；如形狀似小滋養(yǎng)體，可依據蟲體大小、折光是否