(三)原生質(zhì)體融合課件

1、原生質(zhì)體育種Weibull等于1953年首次用溶菌酶處理巨大芽孢桿菌細(xì)胞獲得原生質(zhì)體，并首次提出原生質(zhì)體的概念。Mcquillen于1955年首次發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌原生質(zhì)體再生方法。1978年第三屆國(guó)際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上提出原生質(zhì)體融合。與正常細(xì)胞相比，原生質(zhì)體具有一些新的獨(dú)特的特性 1、由于去除了細(xì)胞壁，對(duì)外界環(huán)境影響更加敏感，對(duì)誘變劑的誘變效應(yīng)也更為強(qiáng)烈。2、破壁后細(xì)胞表面的受體和噬菌體的結(jié)合部位相應(yīng)不存在，失去對(duì)噬菌體的敏感性。3、由于解除了遺傳物質(zhì)的最大屏障細(xì)胞壁，也不受感受態(tài)的影響，可進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和融合等基因重組。以微生物原生質(zhì)體育種的常見的育種方法有：一、原生質(zhì)體再生育種二

2、、原生質(zhì)體誘變育種三、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種四、原生質(zhì)體融合育種一、原生質(zhì)體再生育種1、定義：制備原生質(zhì)體直接再生篩選高產(chǎn)變異株完整細(xì)胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體完整細(xì)胞2、產(chǎn)生比常規(guī)誘變還高的正變率，其原因有以下方面：（1）原生質(zhì)體比較敏感，制備和再生過程中的各種化合物及環(huán)境中的物理因子對(duì)染色體或質(zhì)粒DNA都有一定誘變效應(yīng)。（2）原生質(zhì)體再生本質(zhì)上是細(xì)胞壁重建和分裂能力的恢復(fù)的過程，再生的細(xì)胞壁在組成和結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化，甚至于產(chǎn)生有利于細(xì)胞代謝產(chǎn)物分泌的變異。（3）（4）原生質(zhì)體再生材料無(wú)需經(jīng)過遺傳標(biāo)記，減少了對(duì)菌株的損傷和優(yōu)良性狀的菌株。常規(guī)誘變育種選用材料為孢子，這些休眠體對(duì)誘變劑比較遲鈍，獲得的大部分為

3、負(fù)變株，而制備原生質(zhì)體的出發(fā)材料一般為對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，活力較強(qiáng)，對(duì)環(huán)境和誘變劑較為敏感， 破壁和再生過程中又淘汰了大量弱勢(shì)菌株， 能再生的菌株不論初級(jí)代謝與次級(jí)代謝過程均較活躍，故高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株比例比較大3、實(shí)例： 弗氏鏈霉菌再生后，泰樂菌素產(chǎn)量提高3倍 產(chǎn)二素鏈霉菌再生后，螺旋霉素產(chǎn)量提高2倍 原因可能為13%-85%的質(zhì)粒脫落， 解除抗生素 的調(diào)節(jié)機(jī)制。4、原生質(zhì)體再生育種一般程序 出發(fā)菌株的選擇 菌株的活化和預(yù)培養(yǎng) 原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體再生 高產(chǎn)菌株分離 復(fù)篩菌種特性和發(fā)酵性能研究遺傳穩(wěn)定性鑒定二、原生質(zhì)體誘變育種1、定義： 以微生物原生質(zhì)體為原料，物理化學(xué)誘變劑處理，再生培養(yǎng)基再生，從

4、中篩選高產(chǎn)菌株。2、原生質(zhì)體作為誘變材料的優(yōu)點(diǎn) 單孢子壁結(jié)構(gòu)致密牢固，不利于誘變劑向核內(nèi)滲透。 孢子代謝緩慢，造成基因突變頻率較低或因表型延遲而漏篩。3、原生質(zhì)體誘變一般程序 10ml對(duì)數(shù)期微生物培養(yǎng)為離心收集菌體 沉淀物用酶液懸浮水解去壁制成原生質(zhì)體 高滲溶液洗滌原生質(zhì)體原生質(zhì)體稀釋后取適量放入無(wú)菌培養(yǎng)皿 培養(yǎng)皿移至紫外燈下誘變 再生培養(yǎng)基再生培養(yǎng)菌種特性和發(fā)酵性能研究分離優(yōu)質(zhì)菌株并遺傳穩(wěn)定性鑒定出發(fā)菌株的培養(yǎng)和原生質(zhì)體制備選擇合適的化學(xué)誘變劑，配制成合適的濃度加入原生質(zhì)體懸浮液（含高滲溶液）誘變處理再生培養(yǎng)基再生培養(yǎng)菌種特性和發(fā)酵性能研究分離優(yōu)質(zhì)菌株并遺傳穩(wěn)定性鑒定離心棄誘變劑、原生質(zhì)體用

5、穩(wěn)定液洗滌三、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種1、轉(zhuǎn)化 染色體DNA或其他線狀染色體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體效率低，質(zhì)粒DNA具有高頻轉(zhuǎn)化率。2、影響原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的因素融合促進(jìn)劑PEG來(lái)源、批號(hào)及聚合度。制備原生質(zhì)體的菌絲年齡、菌絲生長(zhǎng)條件、原生質(zhì)體再生條件。轉(zhuǎn)化時(shí)，質(zhì)粒及原生質(zhì)體的濃度。再生培養(yǎng)基的組成。4、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化一般程序 對(duì)數(shù)期微生物培養(yǎng)為離心收集菌體 沉淀物用酶液懸浮水解去壁制成原生質(zhì)體 高滲溶液洗滌原生質(zhì)體、2倍SMM濃縮液、質(zhì)粒DNA、40%PEG混合2min，離心 再生培養(yǎng)基再生培養(yǎng)菌種特性和發(fā)酵性能研究分離優(yōu)質(zhì)菌株并遺傳穩(wěn)定性鑒定原生質(zhì)體融合（protoplast fusion）20世紀(jì)70年代發(fā)展起

6、來(lái)的基因重組技術(shù)。Fodorhe Schaeffer于1976年分別報(bào)道了巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌種內(nèi)原生質(zhì)體融合，微生物融合現(xiàn)象得到證實(shí)，并建立了相應(yīng)的試驗(yàn)體系。四、原生質(zhì)體融合育種 原生質(zhì)體融合： 指親本的原生質(zhì)體在高滲條件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組。在再生成細(xì)胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子。1、大幅度提高親本之間的重組頻率2、擴(kuò)大重組的親本范圍3、原生質(zhì)體融合時(shí)親本整套染色體參與交換，遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重組性狀較多，集中雙親優(yōu)良性狀計(jì)劃更大。 一、與常規(guī)雜交相比，原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)越

7、性和不足 不足之處是原生質(zhì)體融合后DNA交換和重組是隨機(jī)的發(fā)生，增加重組體分離篩選的難度。 此外細(xì)胞對(duì)異體遺傳物質(zhì)的降解和排斥作用，以及遺傳物質(zhì)非同源性等因素也會(huì)影響原生質(zhì)體融合的重組頻率，使遠(yuǎn)緣融合存在較大困難。二、原生質(zhì)體融合育種程序（一）直接親本及遺傳標(biāo)記的選擇（二）原生質(zhì)體的制備與再生（三）原生質(zhì)體融合（四）融合體再生（一）直接親本及遺傳標(biāo)記的選擇 一般把誘變譜系中篩選獲得的不同正變株作為直接親本進(jìn)行融合。 現(xiàn)在認(rèn)為融合親本應(yīng)采用較大差異的近親菌株。標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷型，抗性 熱致死（滅活）孢子顏色菌落形態(tài)遺傳分析：采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型，抗性提高產(chǎn)量：熱滅活 熒光染色標(biāo)記（二）原生質(zhì)體的制備與再

8、生1、制備: 原生質(zhì)體分離：機(jī)械法、非酶法和酶法（1）平板玻璃紙或搖瓶振蕩培養(yǎng)（2）取年輕菌體于高滲溶液中，加有關(guān)酶液，pH、溫度下酶解（3）過濾除去菌絲片段（4）低速離心棄上清,高滲溶液重懸原始親本直接親本振蕩培養(yǎng)酶解過濾離心原生質(zhì)體標(biāo)記水解酶高滲溶液沉淀用高滲溶液懸浮誘變 （1）影響原生質(zhì)體制備的因素培養(yǎng)基組成 Musilkova等研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉在限制性培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基中分離原生質(zhì)體的數(shù)量會(huì)顯著增加。 放線菌只有在加入甘氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，才能使酶類易于滲入和瓦解細(xì)胞壁。菌體的培養(yǎng)方式 絲狀菌常用平板玻璃紙法 細(xì)菌和酵母多用振蕩沉沒培養(yǎng)法。菌體菌齡 絲狀真菌以年輕的菌絲來(lái)分離原生質(zhì)體

9、，尤其菌絲尖端細(xì)胞。酵母和細(xì)菌采用對(duì)數(shù)期。 大部分絲狀菌采用菌絲作為分離原生質(zhì)體的材料穩(wěn)定劑 原生質(zhì)剝離細(xì)胞壁，對(duì)滲透壓敏感，要在高滲溶液中酶解。 作為穩(wěn)定劑的有： 無(wú)機(jī)鹽：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2 有機(jī)物：糖和糖醇，如蔗糖、甘露醇、山梨醇。 試驗(yàn)表明： 無(wú)機(jī)鹽對(duì)絲狀真菌效果好 糖和糖醇對(duì)酵母更合適 細(xì)菌采用蔗糖或NaCl酶解前的預(yù)處理 在用酶處理前，根據(jù)細(xì)胞壁的不同結(jié)構(gòu)加入某些物質(zhì)先行預(yù)處理，以抑制或阻止某一種細(xì)胞壁成分的合成，從而有利于酶的滲入。 試驗(yàn)表明： SH-化合物廣泛應(yīng)用于酵母菌和某些絲狀真菌，效果好 腐霉中，加入TritonX-100或脂肪酶后，可以除去細(xì)胞壁上的

10、脂層，促進(jìn)酶進(jìn)入細(xì)胞壁。 酵母菌常用EDTA或EDTA加巰基乙醇。 放線菌培養(yǎng)液加入0.2%4%甘氨酸。 細(xì)菌加入亞適量的青霉素。酶系和酶的濃度 細(xì)菌溶菌酶（lyxozyme） 放線菌溶菌酶（lyxozyme） 真菌蝸牛酶（snailase） 用于水解細(xì)胞壁的酶濃度要適當(dāng)， 酶量過低，作用不徹底，不利于原生質(zhì)體形成，濃度過高，處理時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)影響原生質(zhì)體數(shù)量和活性，致使再生頻率下降。酶的作用溫度和作用pH 通常大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，水解細(xì)胞壁的溫度35，一般放線菌在30-32 ，產(chǎn)黃青霉采用蝸牛酶和纖維素酶維持在28-33 須霉25 酵母菌多在28-30。菌體密度：一般3mL酶液加入300mg

11、新鮮菌絲體。酶解方式：采用 平皿、試管、錐形瓶。注意振蕩加蒸餾水之前 A加蒸餾水之后 B原生質(zhì)體形成率（）加蒸餾水之前溶液中細(xì)胞數(shù) 加蒸餾水之后溶液中細(xì)胞數(shù) 即未形成原生質(zhì)體的細(xì)胞數(shù)。 把加入蒸餾水前后的混合液分別涂布到高滲再生培養(yǎng)基中，計(jì)算菌落數(shù)。（）原生質(zhì)體的鑒定 水解酶作用于菌體后，必須定時(shí)取樣觀察原生質(zhì)體分離的程度，以確定酶解終點(diǎn)。 一般地，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察：（1）低滲爆破法 直接在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體在低滲溶液中吸水膨脹、破裂的過程。P300圖（2）熒光染色法 原生質(zhì)體混懸液用0.05%-0.1%的熒光增白劑染色，離心棄染料、洗滌后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)紅光的為完整的原生質(zhì)體，

12、發(fā)綠光表明還有細(xì)胞壁存在。（）原生質(zhì)體的收集和純化 原生質(zhì)體從菌體細(xì)胞中釋放出來(lái)后，酶解結(jié)束，必須將原生質(zhì)體與酶液和未酶解的殘余菌體及碎片分開：（1）過濾法：適于絲狀微生物。（2）密度梯度離心：采用蔗糖和氯化銫（3）界面法（4）漂浮法（4）原生質(zhì)體的活力的鑒定 分離純化后的原生質(zhì)體，用作再生或融合的出發(fā)材料，必須具有活性和再生能力：（1）熒光素雙醋酸染色法 活細(xì)胞吸收脂解FDA，能發(fā)熒光的具有活性。（2）酚藏花紅染色法 用0.01%濃度的染料染色，活性原生質(zhì)體吸收染料為紅色，無(wú)活性的為白色。（3）伊文思藍(lán)染色法 用濃度為0.25%伊文思藍(lán)染色，活性原生質(zhì)體為無(wú)色，死的原生質(zhì)體為藍(lán)色。（5）原生

13、質(zhì)體保存 原生質(zhì)體新鮮程度與其活性有關(guān)，一般都是將新制備的原生質(zhì)體立即進(jìn)行融合或其他方式的育種。 如果不是立即使用，則必須低溫保存，在一般冷藏條件下保存時(shí)間很短。一般液氮超低溫保藏。 方法： 5%的二甲基亞砜或甘油等其他保護(hù)劑，迅速降溫保藏。2、原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體再生分三個(gè)階段：準(zhǔn)備期：大分子合成與原生質(zhì)體生長(zhǎng)，這一時(shí)期主要是合成細(xì)胞器成分，表現(xiàn)為原生質(zhì)體體積增大。細(xì)胞壁恢復(fù)期：細(xì)胞壁合成與再生，主要合成細(xì)胞壁物質(zhì)，組裝、恢復(fù)成完整細(xì)胞。分裂能力恢復(fù)期：分裂能力恢復(fù)并開始分裂繁殖成為正常的細(xì)胞形態(tài)和菌落。（1）再生的影響因素（1）菌體的生理狀態(tài) 對(duì)絲狀菌而言，年輕細(xì)胞比衰老細(xì)胞強(qiáng)。（2）穩(wěn)定

14、劑：細(xì)菌放線菌酵母采用糖醇系統(tǒng)， 霉菌采用鹽溶液。（3）酶解時(shí)酶濃度及作用時(shí)間（4）再生培養(yǎng)基組成：絲狀真菌釀酒酵母的原生質(zhì)體僅能在固體培養(yǎng)基上再生。（5）殘存菌體的分離 除去沒有形成原生質(zhì)體的細(xì)胞，否則其生長(zhǎng)快，影響再生。（6）原生質(zhì)體的密度： 不宜過密。（7）排除再生培養(yǎng)基上的冷凝水（8）再生方法一般用雙重平板法：0.8%瓊脂2%瓊脂取0.1ml原生質(zhì)體再生率的計(jì)算A-總菌落數(shù)，未經(jīng)酶處理的菌懸液涂布于平板上長(zhǎng)的菌落。B-酶解混合液加蒸餾水破壞原生質(zhì)體，涂布后長(zhǎng)出的菌落。C-再生菌落數(shù)，酶解混合液加高滲溶液，涂布于再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落。AA-BBC:再生培養(yǎng)基的菌落BC-B (三)原生質(zhì)

15、體的融合（一）融合過程去壁去壁融合加30%-50%PEG適量CaCl、MgCl107-108ml-1107-108ml-1用再生培養(yǎng)基稀釋離心 沉淀懸浮 離心 （二）原生質(zhì)融合的影響因素1、融合劑 化學(xué)融合劑：聚乙二醇（分子量不同濃度不同。） 物理融合劑：電融合、激光融合 2、溫度：一般2030，時(shí)間1min1h 絲狀真菌30 ，細(xì)菌4或20 ，放線菌20 3、親株的親和力和原生質(zhì)體的活性 親株的親緣關(guān)系。4、無(wú)機(jī)離子：Ca20.05mol/LMg2 0.02mol/L5、其他條件：原生質(zhì)體的密度107108ml-1不低于106ml-1（四）融合體再生 以釀酒酵母為例（二）融合體的檢出與分離1、利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇融合體2、利用抗藥性選擇融合體3、用滅活原生質(zhì)體檢出融合體4、利用熒光染色法選擇融合體5、雙親對(duì)碳源利用不同而檢出融合體 例：釀酒酵母 呼吸完整，不能利用木 糖，對(duì)放線菌酮敏感。 另一種酵母 呼吸缺陷，能利用木糖，