微生物生長曲線測定

1、實驗七測定細菌生長曲線一、實驗?zāi)康牧私饧毦L曲線特征，測定細菌繁殖的代時；學(xué)習(xí)液體培養(yǎng)基的配制以及接種方法；反復(fù)練習(xí)無菌操作技術(shù)；了解不同細菌，不同接種方法在同一培養(yǎng)基上生長速度的不同；掌握利用細菌懸液混濁度間接測定細菌生長的方法二、實驗原理將一定量的細菌接種在液體培養(yǎng)基內(nèi)，在一定條件下培養(yǎng)，可觀察到細菌的生長繁殖有一定的規(guī)律性，如以細菌的活菌數(shù)的對數(shù)作縱坐標，以培養(yǎng)時間作橫坐標，可繪成一條曲線，成為生長曲線（如圖一）。圖一微生物生長曲線示意圖單細胞微生物的發(fā)酵具有四個階段，即I調(diào)整期（延滯期）、II對數(shù)期（生長旺盛期）、III平衡期（穩(wěn)定期）、W死亡期（衰亡期）。生長曲線可表示細菌從開始生

2、長到死亡的全過程的動態(tài)。不同的微生物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微生物的生長曲線對于了解和掌握微生物的生長規(guī)律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數(shù)板法、平板菌落計數(shù)法、稱重法和比濁法等。本實驗采用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值（OD600）與其對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。注意，由于光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。從生長曲線我們可以算出細胞每分裂一次所需要

3、的時間，即代時，以G表示。其計算公式為：tt21(lgWlgW)/lg221式中t1和t2為所取對數(shù)期兩點的時間；W1和W2分別為相應(yīng)時間測得的細胞含量（g/L）或OD。三、實驗儀器、材料和用具實驗材料:大腸桿菌，枯草桿菌菌液及平板；培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基實驗儀器:取液器（5000ul,1000ul各一支）;培養(yǎng)箱，搖床，722s分光光度計；實驗用具:無菌1000ul吸頭80個;無菌5000ul吸頭2個;比色皿9個+共用參比杯一個.四、實驗步驟準備菌種：將細菌接種到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培養(yǎng)基中，37C振蕩培養(yǎng)18h,另外準備單菌落平板各1塊分為三個小組：第（1）小組取1.0ml大

4、腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpm取3.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpm取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpm第（2）小組取一個大腸桿菌菌落接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpm取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37C110rpm取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，30C200rpm第（3）小組取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpm取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，30C200rpm取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37C110rpm每培養(yǎng)一小時取樣一

5、次（2.5h,3.5h加測1次）.對照組測量起始pH,所有瓶子測量發(fā)酵9h結(jié)束測pH.測量：選用600nm波長，以蒸餾水作為參比，開始培養(yǎng)前測定每組培養(yǎng)液的OD值作為起始點。開始培養(yǎng)后，每小時吸取測定一次OD值。五、實驗結(jié)果及分析1.實驗數(shù)據(jù)：表一三個小組時間-OD數(shù)據(jù)開始取樣時間10:5512:0112:3913:1713:53結(jié)束取樣時間9:5511:0112:0912:4713:2313:59發(fā)酵時間0122.533.5ODt大腸桿菌單菌落0.0040.0240.0270.0270.0250.03637C110rpm-0.0100.0490.1640.2550.3120.32730C20

6、0rpm-0.0100.0430.0880.1580.2420.361l.OmL0.0100.0700.1580.2660.3720.4363.0mL0.0390.0960.2570.3730.4200.4515.0mL0.0670.1340.3020.3610.3340.456枯草桿菌37C200rpm0.0080.0230.0760.1320.1840.25430C200rpm0.0130.0320.0520.0880.0910.12537C110rpm0.0070.0170.0980.1300.2300.253OD=ODt-ODO大腸桿菌單菌落0.0040.0200.0230.0230.

7、0210.03237C110rpm-0.0100.0590.1740.2650.3220.33730C200rpm-0.0100.0530.0980.1680.2520.371l.OmL0.0100.0600.1480.2560.3620.4263.0mL0.0390.0570.2180.3340.3810.4125.0mL0.0670.0670.2350.2940.2670.389微生物實驗0.246ODt枯草桿菌37C200rpm30C200rpm37C110rpm開始取樣時間結(jié)束取樣時間發(fā)酵時間大腸桿菌枯草桿菌OD=ODt-OD0大腸桿菌枯草桿菌單菌落37C110rpm30C200rpm

8、1.0mL3.0mL5.0mL37C200rpm30C200rpm37C110rpm單菌落37C110rpm30C200rpm1.0mL3.0mL5.0mL37C200rpm30C200rpm37C110rpm0.0080.0130.00714:2914:35廠0.0650.3330.4390.4640.4870.4690.3370.1710.2950.0610.3430.4490.4540.4480.4020.3290.1580.2880.0150.0190.01015:3515:43r0.2670.3400.5660.4460.4700.4570.4280.2610.3020.2630.3

9、500.5760.4360.4310.3900.4200.2480.2950.0680.0390.09116:4316:5060.3950.3420.5700.4460.4570.4640.5170.3700.3050.3910.3520.5800.4360.4180.3970.5090.3570.2980.1240.0750.12317:5017:57匚0.4540.3600.5880.4580.4830.4820.5900.5400.3050.4500.3700.5980.4480.4440.4150.5820.5270.29818:5719:09匚0.4570.3620.5860.440

10、0.4580.4780.6860.6280.3520.4530.3720.5960.4300.4190.4110.6780.6150.3450.1760.0780.219:0720:0790.7110.6060.3520.7030.5930.3450.1120.24620:1221:12100.7110.6520.3780.7030.6390.3712.作圖、簡要分析及代時計算：1）取一個大腸桿菌菌落接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpmh圖一單菌落大腸桿菌生長曲線這條曲線屬于比較標準的“S”形曲線，很容易看出調(diào)整期和對數(shù)期，由于單菌落菌較少，而且從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基環(huán)境變化較大，

11、所以出現(xiàn)了長達4小時的調(diào)整期,但可以看出，調(diào)整期之后這瓶菌都生長良好。微生物實驗計算代時：取培養(yǎng)4小時到5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2-t1=1hW=0.061W2=0.263代時G=2i=0.474h代時(lgW-lgW)/lg2(lgO.263-lg0.061)/lg2212)取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37C110rpmEdo-npr-rn幗吃豔K5O41Xo.13圖二大腸桿菌菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37C110rpm）接種后幾乎沒有調(diào)整期出現(xiàn)，大腸桿菌很快適應(yīng)了新的環(huán)境并開始呈指數(shù)增長，估計是新的培養(yǎng)環(huán)

12、境和原有環(huán)境較一致，而且在培養(yǎng)最初的時候溶氧和酸堿度都較為適宜，但是這瓶菌是穩(wěn)定期OD最小的，估計是培養(yǎng)基最初分裝不均產(chǎn)生的。計算代時：取培養(yǎng)2小時到2.5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2-t1=0.5hW=0.174W2=0.265tt0.5h代時G=21=0.824h代時（lgWlgW）/lg2（lg0.265lg0.174）/lg2213）取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，30C200rpm圖三大腸桿菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，30C200rpm）可以看出溫度對大腸桿菌適應(yīng)環(huán)境產(chǎn)生了一定的影響，使它在調(diào)整期滯留了較長的

13、時間，且在對數(shù)期增長較慢，應(yīng)該是酶活性對細胞復(fù)制的影響所致。計算代時：取培養(yǎng)2.5小時到3.5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2-t1=1hW=0.168W2=0.371代時G=2i=0.875h代時（lgW-lgW）/lg2（lg0.371lg0.168）/lg2214）取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpmhooooo匚Qt闊世虛xoo圖四大腸桿菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpm）這是大腸桿菌培養(yǎng)的最適調(diào)節(jié)，可以看出其生長良好，調(diào)整期較短，對數(shù)期較長。計算代時：取培養(yǎng)2小時到3小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)

14、生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2-t1=1hW=0.148W2=0.362代時tt21(lgWlgW)/lg221(lgO.362lg0.148)/lg2。二755）取3.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpmhooooolECIm區(qū)世渥圖五大腸桿菌生長曲線（取3.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpm）接種量的增加沒有產(chǎn)生太大的影響，生長曲線沒有太大變化。計算代時：取培養(yǎng)2小時到2.5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2J=0.5hW=0.218W2=0.334tt5h代時G=2i=0.812h代時（lgWlgW）/lg

15、2（lg0.334lg0.218）/lg2216）取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpmhlECILn闊世卷+)圖六大腸桿菌生長曲線（取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpm)3小時出現(xiàn)了一次明顯的波動，應(yīng)該是測量過程中沒有搖勻的結(jié)果，忽略它之后，這條生長曲線屬于正常形態(tài)，比較前兩天生長曲線，發(fā)現(xiàn)5mL得到的最大OD反而減小了，說明在一定量的培養(yǎng)基下，初始接種量對最后結(jié)果影響不大。最大OD應(yīng)該是受到了最初添加培養(yǎng)基的影響。計算代時：取培養(yǎng)1小時到2小時之間的數(shù)據(jù)(對數(shù)生長期)來計算代時。由代時計算公式，t2J=1hW=0.067W2=0.2

16、35代時G=2i=0.552h代時(lgW-lgW)/lg2(lg0.235-lg0.067)/lg2217)取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpmh圖七枯草桿菌生長曲線(取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37C200rpm)枯草桿菌的生長曲線包含了調(diào)整期、對數(shù)期和很小一部分穩(wěn)定期，雖然穩(wěn)定期很短,但是已經(jīng)可以看出停止生長的趨勢，說明枯草桿菌的代時較長。計算代時：取培養(yǎng)3小時到4小時之間的數(shù)據(jù)(對數(shù)生長期)來計算代時。由代時計算公式，t2J=1hW=0.176W2=0.246代時G=21=1.108h代時(lgW-lgW)/lg2(lg0.246-lg0.17

17、6)/lg2218)取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基,30C200rpmh圖八枯草桿菌生長曲線（取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，30C200rpm）溫度降低后，生長變得緩慢了，最后達到的最大OD也更小了，代時加長。計算代時：取培養(yǎng)4小時到5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2-t1=1hW=0.158W2=0.248代時tt21(lgWlgW)/lg221(lg0.248lg0.158)/lg2一1.5379）取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37C110rpmhEdo-npa幗生冊00圖九枯草桿菌生長曲線（取1.0ml枯草桿菌接種到10

18、0ml培養(yǎng)基，37C110rpm）4小時時，似乎由對數(shù)期進入了穩(wěn)定期，但是對比前兩組數(shù)據(jù)，此時的OD值明顯偏小，所以分析，可能此時突然有外因影響，使細胞進入了調(diào)整期，可以看到后來7、8小時左右細菌又有增長趨勢。計算代時：取培養(yǎng)2.5小時到3小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2-t1=1hW1=0.123W2=0.223代時G二t2Zli二_二0.582h代時（lgW-lgW）/lg2（lgO.223-lg0.123）/lg221發(fā)酵結(jié)束pH對照組pH=7.5實驗結(jié)束后所有瓶pH均小于6.4pH全部降低，說明大腸桿菌和枯草桿菌發(fā)酵均產(chǎn)生了酸。分析表二不同環(huán)境和菌種生長比較

19、培養(yǎng)菌接種量培養(yǎng)溫度/C搖床轉(zhuǎn)速/rpm生長曲線狀態(tài)代時/min調(diào)整期/h對數(shù)期/h穩(wěn)定期OD（取8小時OD）大腸桿菌單菌落37200430.45328.5l.OmL37110130.37249.4l.OmL30200230.59652.5l.OmL37200130.43046.53.0mL37200120.41948.75.0mL37200120.41133.1枯草桿菌l.OmL37200260.67866.530200350.61592.237110130.34534.91）接種量對微生物的影響：預(yù)期：接種量大，調(diào)整期縮短，對數(shù)期增長，穩(wěn)定期OD增大，代時縮短。原因：接種量大的細胞基數(shù)大，

20、因而更快適應(yīng)環(huán)境。實際：調(diào)整期影響不大，對數(shù)期稍有縮短，穩(wěn)定期OD減小，代時規(guī)律不明顯。分析：生長曲線受各種因素調(diào)節(jié)，這里實驗結(jié)果不同于預(yù)期應(yīng)該是受到培養(yǎng)基的限制,接種量大對氧氣和原料需求更多，而且產(chǎn)生酸的速度也快，也許對后來的細胞生長造成了一定的影響。2）培養(yǎng)溫度對微生物的影響預(yù)期：最適溫度下細胞生長應(yīng)該最快，調(diào)整期最短，穩(wěn)定期OD最大，代時最短原因：溫度影響細菌內(nèi)酶活力和細胞膜的通透性，進而影響新陳代謝，從而影響細菌的生長繁殖。最適溫度下，細菌酶活性最強，因而能最快適應(yīng)環(huán)境，并取得生長增殖的最咼效率。實際：大腸桿菌37C穩(wěn)定期OD最大，調(diào)整期更短，但代時更長?？莶輻U菌37C調(diào)整期更短，對數(shù)

21、期更長，穩(wěn)定期OD更大，代時更短。分析：大腸桿菌代時的問題應(yīng)該來自實驗誤差，如取樣未搖勻、計算時取點不夠準確，或?qū)嶒炦^程中某些操作導(dǎo)致生長和理論不一致。3）搖床轉(zhuǎn)速對微生物的影響預(yù)期：轉(zhuǎn)速高，調(diào)整期短，對數(shù)期長，穩(wěn)定期OD大，代時短原因：轉(zhuǎn)速影響溶氧，溶氧高，生長情況應(yīng)該越好實際：大腸桿菌與預(yù)期符合；枯草桿菌轉(zhuǎn)速快的調(diào)整期長，代時長。分析：原因可能有兩點，一是枯草桿菌在溶氧高的環(huán)境下生長沒有那么好，說明它是微好氧生物，但這與實際不符；二是其他條件限制，雖然說兩個培養(yǎng)瓶進行對照要求其他條件一致，但是由于培養(yǎng)基分配及其其他各種原因，其他條件可能并不一致而且還產(chǎn)生了比對照條件還要大的影響。4）生長曲

22、線分析兩個菌的生長曲線都包括了調(diào)整期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，實驗沒有進行到衰亡期因為而沒有觀察到后來的OD值下降。5）大腸桿菌和枯草桿菌比較大腸桿菌：代時要短一些，溫度對代時的影響比溶氧對代時的影響要大，估計是因為溶液中細胞不多，所以溶氧的限制作用沒有溫度明顯?？莶輻U菌：代時較長，溶氧比溫度對代時的影響要大，但這也可能是實驗操作中其他因素影響而得出的表觀結(jié)果。六、實驗小結(jié)這是一個大組合作、小組分工的實驗，每一組的結(jié)果都影響了整個大組隊結(jié)果的分析，這就要求我們的合作。和暑期實驗不同，這次實驗在時間上縮短了，但是在內(nèi)容上卻增多了，由于有很多組的平行比較，所以得到的信息量也相應(yīng)加大，這些信息中又包含了這種

23、各樣的誤差，所以要求我們自己在處理別人的實驗結(jié)果中也加入自己的分析?？偟膩碚f，這是個很有意思也很有意義的實驗。七、思考計算出大腸桿菌和枯草芽抱桿菌在牛肉膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基中對數(shù)生長期中的代時（min）（繁殖一代的時間），為什么比理論時間長好多？代時見表二。經(jīng)查資料得：大腸桿菌理論代時為37度時18分鐘，而枯草桿菌一般是給30度下的理論代時為31分鐘，實驗測得代時長于理論值的原因：理論代時是在理想的培養(yǎng)條件下測得，糖分、氧氣等營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)充足，細菌生長狀況良好，之前的分裂次數(shù)較少。實際實驗條件與理論值條件存在差距。如培養(yǎng)過程中不補料，營養(yǎng)物質(zhì)有限。單純的振蕩不能保證體系中有足夠的溶氧。對培養(yǎng)液

24、的pH值，氧化還原電勢也未加控制，測量過程中溫度不能保持穩(wěn)定等等。為什么可用比濁法來表示細菌的相對生長狀況？培養(yǎng)液的渾濁度與細菌的濃度與成正比，可以利用分光光度計測定細菌濁液的光密度來推知菌液的濃度。濁度的變化代表體系細菌數(shù)量的變化。其原理是：一個細胞懸浮液用肉眼觀察是呈現(xiàn)混濁的，這是因為光線通過懸浮液是，細胞散射光線。存在的細胞數(shù)越多，分散的光線就越多，因此懸浮液濁度就越大。通過分光光度計可以檢出沒有被細胞散射的光線。對于大腸桿菌和枯草桿菌，從理論上OD值與細胞總量成正比?？梢灾苽鋵⒓毎麛?shù)目與濁度聯(lián)系起來的標準曲線。生長曲線中為什么會有穩(wěn)定期和衰退期？當細胞的繁殖速度達到高峰時，其細胞總數(shù)就不會再增加，這是由于調(diào)整期、對數(shù)生長期兩階段糖類營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，代謝產(chǎn)物乙醇的積累及培養(yǎng)基的pH值、氧化還原電勢的改變，對細胞產(chǎn)生了較大的抑制性。當死亡細胞數(shù)和繁殖細胞數(shù)接近穩(wěn)定時，就出現(xiàn)穩(wěn)定期，細胞總數(shù)處于穩(wěn)定狀態(tài)。進入穩(wěn)定期后，如果繼續(xù)培養(yǎng)，由于營養(yǎng)物質(zhì)（如糖類和氧氣）的進一步消耗，