學(xué)習(xí)情景三培養(yǎng)微生物課件

1、微生物應(yīng)用技術(shù)學(xué)習(xí)情景三 培養(yǎng)微生物、測定其生長主要內(nèi)容任務(wù)1 測定微生物生長 任務(wù)2 理化因素對微生物生長的影響12任務(wù)3 微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)3學(xué)習(xí)情景三 培養(yǎng)微生物、測定其生長（1）微生物純種分離、培養(yǎng)和常用的接種技術(shù)以及菌落的初步鑒定；（2）生長曲線，生長的測量方法，環(huán)境對微生物生長的影響等；（3）理化因素對微生物生長的影響?！緦W(xué)習(xí)內(nèi)容】學(xué)習(xí)情景三 培養(yǎng)微生物、測定其生長 掌握微生物純種分離、培養(yǎng)和常用的接種技術(shù)以及菌落的初步鑒定；掌握生長曲線和生長的測量方法；掌握理化因素對微生物生長的影響?！局R(shí)目標(biāo)】【技能目標(biāo)】 根據(jù)菌種需要，配制不同類型的培養(yǎng)基；完成菌種的純化及測量等操作過

2、程。任務(wù)1 測定微生物生長學(xué)習(xí)情景三 培養(yǎng)微生物、測定其生長 為了全面對微生物的測量，需要了解微生物生長曲線的相關(guān)內(nèi)容。任務(wù)分析任務(wù)1 測定微生物生長 無論在自然條件下還是在人工條件下，微生物作用的發(fā)揮，都是“以數(shù)取勝”或是“以量取勝”。生長、繁殖就是保證微生物獲得巨大數(shù)量的必要前提。 任務(wù)提出任務(wù)1 測定微生物生長一微生物的生長繁殖生理生命活動(dòng)機(jī)理（食、住）生命活動(dòng)營養(yǎng)、呼吸、環(huán)境衛(wèi)生營養(yǎng)物及其獲取方式營養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝 呼吸那些環(huán)境因素使細(xì)菌病、死？環(huán)境衛(wèi)生任務(wù)實(shí)施的相關(guān)專業(yè)知識(shí)任務(wù)1 測定微生物生長個(gè)體生長細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致細(xì)胞體積擴(kuò)大的生物學(xué)過程。群體生長：在一定時(shí)間和

3、條件下細(xì)胞數(shù)量的增加。繁殖微生物生長到一定階段由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與重建并通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。提問：為什么這里不考察細(xì)菌個(gè)體的生長呢？個(gè)體太小，難觀察計(jì)量; 群體細(xì)菌對環(huán)境產(chǎn)生影響任務(wù)實(shí)施的相關(guān)專業(yè)知識(shí)一微生物的生長繁殖各類細(xì)菌都是傾向于群居（物以類聚）一山不容二虎提問：弱勢生物的群居優(yōu)勢是什么？生存狀況提高，攻防具佳（攻）群居的細(xì)菌獲得營養(yǎng)的能力大大高于游離的細(xì)菌， （防）群居的細(xì)菌不易被天敵傷害，還能釋放類似外激素的調(diào)節(jié)因子，使群體主動(dòng)適應(yīng)環(huán)境的變化，可有性生殖；團(tuán)結(jié)就是力量一微生物的生長繁殖外界因素引起的細(xì)菌數(shù)量的增加、停滯、衰減等變化。提問：

4、如何研究呢？ 測菌數(shù)量變化與外因的關(guān)系細(xì)菌群體力量改變環(huán)境通常都是將細(xì)菌群體作為研究對象，考察細(xì)菌群體的生長規(guī)律“生、老、病、死”。提問：細(xì)菌群的“生、老、病、死”表現(xiàn)為何呢？一微生物的生長繁殖（一）微生物生長繁殖的測定方法1.測生長量（1）測體積 初步比較。 把待測培養(yǎng)液放在刻度離心管中作自然沉降或進(jìn)行一定時(shí)間的離心，然后觀察其體積等。一微生物的生長繁殖（2）稱重法方法 ：離心法或過濾法，測定樣品的濕重或干重。已知單個(gè)細(xì)菌的平均重量 除法計(jì)算細(xì)菌的濕重量10-1510-11g/個(gè)細(xì)胞干重約為濕重的1020。干重法方法：含菌水樣在105110下進(jìn)行干燥恒重（本質(zhì)測水中懸浮物重量MLSS或MLV

5、SS）。（一）微生物生長繁殖的測定方法1.測生長量懸浮物無機(jī)物+有機(jī)物（包括細(xì)菌）提問：如何確定懸浮物中有機(jī)物與無機(jī)物的量？高溫(550)灼燒 無機(jī)物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，高溫下不會(huì)分解提問：什么情況下可以直接用懸浮物的重量表示細(xì)菌的重量？懸浮物中絕大多數(shù)是細(xì)菌。一微生物的生長繁殖1.測生長量（2）稱重法懸浮物中絕大多數(shù)為細(xì)菌時(shí)細(xì)胞數(shù)目=MLSS個(gè)體細(xì)菌的平均干重量離心沉淀 濾膜過濾計(jì)算105110下進(jìn)行干燥恒重稱重或MLSS懸浮物（一）微生物生長繁殖的測定方法除細(xì)菌外還有大量無機(jī)懸浮物時(shí) W無MLVSS揮發(fā)性懸浮物MLSS W無 =細(xì)菌群體的干重量細(xì)胞數(shù)目= MLVSS個(gè)體細(xì)菌的平均干重量 550下

6、灼燒2h稱重105110下進(jìn)行干燥恒重稱重MLSS（一）微生物生長繁殖的測定方法（3）有大量非細(xì)菌有機(jī)懸浮物時(shí)提問：如何測定呢？不能用重量法，應(yīng)改用其他方法。總體來說重量法方法誤差較大，一般只作為菌數(shù)粗略估算如活性污泥測定（以重量MLSS、MLVSS間接表示細(xì)菌數(shù)量）（一）微生物生長繁殖的測定方法 （3）比濁計(jì)數(shù)法濁細(xì)菌懸浮液的濁度提問：如何定量二者關(guān)系呢？細(xì)菌不完全透光，一定范圍內(nèi)菌溶液的混濁度與菌數(shù)量成正比原理：菌體的生長可使培養(yǎng)液產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象。 方法：用比濁計(jì)、比色計(jì)、分光光度計(jì)測定培養(yǎng)液的濁度，用透光率或光密度表示菌懸液的濃度，再對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出菌數(shù)。 （一）微生物生長繁殖的測定

7、方法 (2)比濁法（一）微生物生長繁殖的測定方法 制標(biāo)準(zhǔn)曲線（ODNo）測菌液濁度，查圖表得出細(xì)菌數(shù)量濁度儀或721分光光度儀（一）微生物生長繁殖的測定方法儀器：濁度計(jì)、分光光度計(jì)等儀器測出菌液的濃度，然后再對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可查出相似的菌數(shù)。注意:培養(yǎng)液的顏色太深會(huì)影響測定結(jié)果，不要混雜其他物質(zhì)。適用范圍：用于溶液的總細(xì)胞的計(jì)數(shù)。缺點(diǎn)：靈敏度較差優(yōu)點(diǎn)：簡便、快速、不干擾或不破壞樣品。濁度計(jì)分光光度計(jì)（一）微生物生長繁殖的測定方法（4） 含N測定法原理：細(xì)胞蛋白質(zhì)量是比較穩(wěn)定的，可反映微生物的生長量。通過菌體含氮量的測定求出蛋白質(zhì)的含量，并大致算出細(xì)胞物質(zhì)的重量。方法：從一定量培養(yǎng)物中分離出菌體

8、，洗滌后用凱氏微量定氮法測定出總氮含量，其值乘以6.25，大多數(shù)生物包括細(xì)菌，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)氮含量比較穩(wěn)定，一般為蛋白質(zhì)干重1516，平均為16。（一）微生物生長繁殖的測定方法 2.計(jì)繁殖數(shù) 提問：前述方法中計(jì)數(shù)的不都是活菌，如何分辨菌死活？繁殖提問：細(xì)菌繁殖的可見現(xiàn)象是什么？產(chǎn)生菌落（固體培養(yǎng)基培養(yǎng)）、菌液混濁（液體培養(yǎng)基培養(yǎng)）計(jì)數(shù)原理：一個(gè)細(xì)菌可繁殖成一個(gè)菌落或一群細(xì)菌.缺點(diǎn)：慢 分固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法（一）微生物生長繁殖的測定方法 2.計(jì)繁殖數(shù)計(jì)算微生物的個(gè)體數(shù)目。適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子。（1）顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 又稱為全菌計(jì)數(shù)法，借助顯微鏡觀察測定優(yōu)點(diǎn)：快速提

9、問:有哪些缺點(diǎn)?缺點(diǎn)：不能區(qū)分細(xì)菌的死活。（一）微生物生長繁殖的測定方法一微生物的生長繁殖（1）顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)器(血球計(jì)數(shù)板）測定法0.052cm2250.1ml菌液1625格或25*16格（一）微生物生長繁殖的測定方法提問：數(shù)了125個(gè)小格中有90個(gè)細(xì)菌，樣品中的細(xì)菌濃度是多少？(90個(gè)125) 400 / 0.1ml =2880個(gè)/ml適用范圍：測定個(gè)體較大的細(xì)菌或原生動(dòng)物細(xì)菌個(gè)體若太小、過多，由于每一小格中細(xì)菌層層疊加，相互遮擋，難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。數(shù)數(shù)細(xì)菌（或其他微生物或細(xì)胞）數(shù)目，（一般數(shù)125個(gè)小格），折算樣品細(xì)菌濃度；（一）微生物生長繁殖的測定方法 2.計(jì)繁殖數(shù) (2)平板菌落計(jì)

10、數(shù)法 通過測定樣品在培養(yǎng)基上形成的菌落數(shù)來間接確定其活菌數(shù)的方法。依據(jù)：在稀釋情況下一個(gè)菌落是由一個(gè)活細(xì)胞繁殖形成的。（一）微生物生長繁殖的測定方法（一）微生物生長繁殖的測定方法無菌水（2）平板計(jì)數(shù)法第一步：菌樣巧妙稀釋得到不同稀釋度 （10-x）菌液菌樣被無菌水不同稀釋倍率后平板培養(yǎng)圖 10-2 10-3 10-4 10-5 各取1ml于培養(yǎng)皿上,再加入不燙手固體培養(yǎng)基平板上混合均勻冷卻。第三步：培養(yǎng)稀釋度過低，菌落密集無法計(jì)數(shù)可以計(jì)數(shù)，但數(shù)量過多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力數(shù)量合適，統(tǒng)計(jì)計(jì)算，作為結(jié)果數(shù)量太少，誤差因素太大，不做計(jì)數(shù)第二步：接種平板每一個(gè)細(xì)菌會(huì)生成一個(gè)菌落一微生物的生長繁殖一般計(jì)數(shù)平板的細(xì)菌

11、生長菌落數(shù)以30300個(gè)為宜。第四步： 計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量=？細(xì)菌數(shù)量=數(shù)出的菌落數(shù)/稀釋度例如：10-5稀釋度時(shí)菌落數(shù)為125cfu細(xì)菌數(shù)量=125/10-5=1.25107cfu/mL 平板計(jì)數(shù)法是采用最廣的一種活菌計(jì)數(shù)法如國標(biāo)法水中細(xì)菌總數(shù)的測定 。注意：作空白及取平行樣（23組）均值減小誤差平均（一）微生物生長繁殖的測定方法（3）膜過濾法方法：用微孔薄膜過濾定量的空氣或水樣，菌體便被截留在濾膜上，然后取下濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)數(shù)其上的菌落數(shù)從而求出樣品中所含的菌數(shù)。適用范圍：對于細(xì)胞總數(shù)106個(gè)/ml的液體樣品。對膜干燥后，染色、計(jì)數(shù)（一）微生物生長繁殖的測定方法（3）薄膜計(jì)數(shù)法薄膜微孔濾膜（0.

12、45m） 濾膜培養(yǎng)膜有菌面沖上原理膜抽濾（細(xì)菌濃縮）+ 膜平板培養(yǎng) + 計(jì)數(shù)抽濾（濾器及膜事先滅菌）（一）微生物生長繁殖的測定方法統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)提問：假如 測出250cfu菌落，抽濾了50ml自來水，自來水中菌濃度是多少呢？ 25050ml=5cfu/ml自來水樣品中的細(xì)菌數(shù)量=菌落數(shù)抽濾樣品的體積數(shù)提問：如何用活菌計(jì)數(shù)法測定較臟的水樣？減少濾液體積、無菌水稀釋（一）微生物生長繁殖的測定方法（4）稀釋培養(yǎng)法原理：菌液經(jīng)多次稀釋后，菌數(shù)可隨之減少直至沒有。可從最后有菌生長的幾個(gè)稀釋度的35次重復(fù)中求最大概率數(shù)。 所以又叫MPN(最大可能數(shù)量)法。（一）微生物生長繁殖的測定方法 （4）最近似法特點(diǎn)：液體培養(yǎng)、統(tǒng)計(jì)學(xué)查表計(jì)數(shù)又稱MPN法 （或最可能數(shù)法）例如測定SRB（硫酸鹽還原菌，厭氧）的數(shù)量提問：能用稀釋平板法計(jì)數(shù)嗎？為什么？一般不能，厭氧菌暴露在空氣中不能生長（除非厭