重組抗HER2人源化單克隆抗體純化工藝研究

1、重組抗HER2人源化單克隆抗體純化工藝研究 摘 要目的：開發(fā)重組抗HER2人源化單克隆抗體純化工藝。方法：選擇了親和層析介質(zhì)、陽離子層析介質(zhì)、疏水層析介質(zhì)作為備選介質(zhì)進(jìn)行純化工藝開發(fā)。結(jié)果：確定純化策略為依次Sure、SP-FF、Phenyl-HP層析。 關(guān)鍵詞重組抗HER2人源化單克隆抗體 層析工藝 中圖分類號(hào)：TQ2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2014）22-0296-01 重組抗HER2人源化單克隆抗體（rhAnti-HER2）由人的IgGl框架區(qū)及能與HER2結(jié)合的鼠抗HER2抗體的互補(bǔ)決定區(qū)構(gòu)成1。rhAnti-HER2在體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均顯示可抑制HER2過度表

2、達(dá)的腫瘤細(xì)胞的增殖。我們對(duì)rhAnti-HER2純化工藝進(jìn)行了研究。 1.儀器和材料 1.1 儀器 AKTA純化系統(tǒng)、SORVALL離心機(jī)、親和層析介質(zhì)Sure、陽離子層析介質(zhì)SP-FF、疏水層析介質(zhì)Phenyl-HP 1.2 材料 rhAnti-HER2細(xì)胞培養(yǎng)豐收液（本研究所自產(chǎn)）、Tris（SIGMA）、HCl（西隴化工股份有限公司）、NaCl（天津博迪化工股份有限公司）、硫酸銨（天津市化學(xué)試劑三廠） 2.方法和結(jié)果 2.1 親和層析工藝研究 由于rhAnti-HER2抗體的Fc段在中性溶液中可以和ProteinA特異結(jié)合，而豐收液中絕大部分雜質(zhì)由于不能結(jié)合ProteinA而被去除，所以

3、選擇Sure作為第一步層析介質(zhì)，可以在最大效率捕獲目的蛋白的同時(shí)達(dá)到很好的純化效果。 2.1.1 確定洗脫液pH值 細(xì)胞豐收液澄清后上樣，上樣量保持一致，洗脫液pH值調(diào)為3.1、3.2、3.3、3.4分別進(jìn)行洗脫，根據(jù)收率及純度結(jié)果確定洗脫pH值。結(jié)果洗脫量分別為18、18、17、16mg；A280/A260分別為1.61、1.58、1.59、1.61；HPLC純度分別為92.8%、92.5%、93.5%、95.0%。pH3.1-pH3.4洗脫量逐漸降低，A280/A260比值逐漸增加，蛋白純度無明顯差異，因此確定洗脫液pH值為3.1-3.3。 2.1.2 確定上樣液pH值 細(xì)胞豐收液澄清后，

4、分別調(diào)pH值為6.5、7.0、7.5、8.0，上樣量恒定，保留時(shí)間5min，洗脫pH3.3，考察收率及純度確定上樣液的pH值。結(jié)果收率分別為95.5%、96.5%、97.0%、97.0%；HPLC純度分別為93.1%、95.8%、94.2%、93.0%。結(jié)果顯示，pH6.5收率及純度均較低，pH8.0純度較低，所以選定上樣液pH值為7.0-7.5。 2.2 離子交換層析工藝研究 離子層析為常用的層析方法，分離效果好，效率高。我們選用SP-FF陽離子交換層析凝膠進(jìn)行后續(xù)純化，此步驟可進(jìn)一步去除殘留雜質(zhì)。 2.2.1 保留時(shí)間及動(dòng)態(tài)載量 層析pH4.5，0.35mol/LNaCl洗脫。保留時(shí)間分別

5、為1、2、5min，其它條件不變，確定動(dòng)態(tài)載量并根據(jù)動(dòng)態(tài)載量來確定上樣保留時(shí)間。結(jié)果收率分別為82.4%、85.7%、82.9%；動(dòng)態(tài)載量分別為31、52、79mg/ml。結(jié)果顯示，各保留時(shí)間下，回收率均大于85%，動(dòng)態(tài)載量隨保留時(shí)間增加而增加，最后趨于平穩(wěn)，因此選擇保留時(shí)間大于5min，此時(shí)動(dòng)態(tài)載量為79mg/ml。 2.2.2 確定上樣液pH值 親和層析樣品分別調(diào)pH值為4.0、4.5、5.0，進(jìn)行SP層析，保留時(shí)間5min，0.4mol/LNaCl洗脫?？疾焓章始凹兌?，確定上樣液pH值。結(jié)果收率分別為80.4%、88.4%、86.9%。pH4.0上樣收率最低，pH4.5收率最高，而且pH

6、5.0時(shí)樣品的電導(dǎo)率較高，載量受限，因此上樣pH選擇pH4.5。 2.2.3 預(yù)洗及洗脫鹽濃度的確定 層析pH=4.5，保留時(shí)間5min，0-0.5mol/LNaCl鹽濃度梯度洗脫，根據(jù)各段收集樣品的純度及雜質(zhì)去除情況確定預(yù)洗及洗脫鹽濃度。結(jié)果見（表1）。 結(jié)果顯示，樣品主要集中在峰2收集部分。各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于峰前，因此選擇預(yù)洗鹽濃度為0.2mol/L，對(duì)應(yīng)電導(dǎo)率約22mS/cm，洗脫鹽濃度為0.35mol/L，對(duì)應(yīng)電導(dǎo)率約34mS/cm。 2.3 疏水層析工藝研究 使用Phenyl-HP介質(zhì)進(jìn)行后續(xù)純化，此步驟可進(jìn)一步去除殘留雜質(zhì)。 2.3.1 確定上樣鹽濃度 分別將CM-FF洗脫樣品添加硫酸

7、銨至0.5M、1M，pH4.5上樣，保留時(shí)間5min?？疾觳煌}濃度時(shí)的動(dòng)態(tài)載量。結(jié)果上樣量分別為288mg、922mg；收率分別為81.3%、91.2%；HPLC純度分別為96.1%、96.3%。結(jié)果顯示，提高上樣鹽濃度，上樣量、收率會(huì)隨之提高，洗脫質(zhì)量不變。而1M硫酸銨已接近蛋白對(duì)硫酸銨的最大可耐受濃度（顆粒析出），因此選擇1M硫酸銨上樣。 2.3.2 確定洗脫pH 保留時(shí)間5min，洗脫液pH值分別為5.5、6.5、7.5。根據(jù)收率及純度來確定洗脫pH值。結(jié)果收率分別為84.4%、87.3%、88.4%；HPLC純度分別為96.7%、96.7%、96.1%；CHO細(xì)胞蛋白殘留量分別為0.005%、0.008%、0.018%。收率隨洗脫pH增加而增加。HPLC純度變化不顯著，pH6.5雜質(zhì)殘留量較低，因此選定洗脫pH為6.5。 3.討論 我們利用國際上抗體純化通用親和層析最為第一步層析，結(jié)果第一步純化后就獲得了較高純度的目的蛋白，通過SP-FF、Phenyl-HP后續(xù)純化進(jìn)一步將提高純度，同時(shí)降低雜質(zhì)殘留量，使純度及雜質(zhì)滿足藥物開發(fā)要求。通過實(shí)驗(yàn)成功開發(fā)了重組抗HER2人源化單克隆抗體純化工藝。 參考