應(yīng)用微生物第一章-第三節(jié)-微生物胞外多糖及其應(yīng)用課件

1、1第三節(jié) 微生物胞外多糖及其應(yīng)用第一章 微生物在工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用生物技術(shù)專業(yè)應(yīng)用微生物學(xué)課程2一、微生物胞外多糖概述31、微生物胞外多糖 胞壁多糖 肽聚糖、脂多糖 胞內(nèi)多糖 糖原 胞外多糖（Extracellular polysaccharides） 分泌或擴散到細胞以外的多糖 莢膜 黏液層 最具開發(fā)利用價值的多糖4目前主要研究方向1、胞外多糖生理合成與調(diào)控研究2、胞外多糖合成遺傳學(xué)研究 合成基因大片段定位在染色體上3、多糖分子結(jié)構(gòu)與功能 一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)決定性能4、工業(yè)應(yīng)用 建筑 石油5、免疫激活功能 靈芝多糖、香菇多糖、小核菌多糖的三股螺旋結(jié)構(gòu)有免疫激活功能 干擾素的誘生劑，使抑制基因去

2、抑制 干擾素半衰期短 抗病毒、抗腫瘤的藥物1、微生物胞外多糖5目前自然界發(fā)現(xiàn)有100多種微生物產(chǎn)胞外多糖主要是細菌：Xanthomonas sp.(黃單胞菌屬)Leucostoc sp.(明串珠菌屬)Azotobacter sp.(固氮菌屬)Rhizobium sp.(根瘤菌屬)Sphingomonas sp.(鞘胺醇單胞菌屬)有少數(shù)真菌：Sclerotium sp.(小核菌屬)Rhodotorula sp.(紅酵母屬)2、產(chǎn)生胞外多糖的微生物類群6粘稠、光滑的黃色菌落培養(yǎng)液呈粘稠膠狀光學(xué)顯微鏡下包裹莢膜狀物質(zhì)電鏡下分泌絲狀多糖產(chǎn)生黃原膠野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestr

3、is）7黃原膠（Xanthan gum）“五糖重復(fù)單元”側(cè)鏈殘基被乙酰化或丙酮?；煌旰筒煌瑮l件所產(chǎn)的黃原膠存在異同8二、微生物多糖的合成模式和生理學(xué)調(diào)控1、依賴于糖基載體酯(C55-Lipid-p)的合成模式糖基載體酯（C55-Lipid-P）十一聚類異戊二烯醇磷酸酯，其功能是將胞質(zhì)內(nèi)的糖基聚合成多糖，并通過細胞膜運往胞外，因此它是控制多糖分子合成、運輸與分泌的載體。糖基載體酯的科學(xué)研究功能調(diào)節(jié)、運載活性、提高產(chǎn)量9胞內(nèi)玉米淀粉葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-磷酸葡萄糖-1-磷酸UDP-GlcGDP-ManUDP-GlcA-Glc-Glc-n Man-Ac GlcAMan=pyrUTPPPGTP

4、PPHMP途徑C55-Lipid-pp特異糖基轉(zhuǎn)移酶糖基載體酯焦磷酸化酶乙?；D(zhuǎn)移酶丙酮酸轉(zhuǎn)移酶多糖聚合酶UTP-Glc焦磷酸化酶GTP-Man焦磷酸化酶UDP-Glc脫氫酶淀粉酶胞外C55-Lipid-p+pAcPyrMembrane葡萄糖胞膜UTPPP二、微生物多糖的合成模式和生理學(xué)調(diào)控胞壁10黃原膠是依賴于C55-Lipid-P生物合成模式的典型代表。黃原膠合成生理調(diào)控核心步驟：1）胞外淀粉酶活性高低對黃原膠合成的影響X.Campestris NK-01以玉米淀粉為碳源玉米淀粉Glc進入細胞淀粉酶是控制底物進入細胞的“閘門”淀粉酶活性是碳源利用效率的關(guān)鍵高淀粉酶活性菌株篩選：淀粉酶N.K

5、-01細胞誘變比值大加碘液 證明是淀粉水解圈R水解圈(mm)R菌落(mm)玉米淀粉平板篩選淀粉酶活性高的菌株，檢測黃原膠合成速率和產(chǎn)量二、微生物多糖的合成模式和生理學(xué)調(diào)控112)、C55-Lipid-P糖基載體脂運載功能的調(diào)節(jié)共利用調(diào)節(jié)：X. campestris NK-01，G-脂多糖、肽聚糖、黃原膠合成皆以C55-Lipid-P為糖基載體LPS合成pep合成C55-Lipid-PXanthan gumC55-Lipid-P共利用順序：先用于胞壁多糖合成，后用于胞外多糖合成。 先長細胞，后合成胞外多糖Xanthan gum是次生代謝產(chǎn)物還是初級代謝產(chǎn)物？二、微生物多糖的合成模式和生理學(xué)調(diào)控1

6、23）運載活性的調(diào)節(jié)載體脂焦磷酸化酶C55-Lipid-PPC55-Lipid-PP引物胞壁多糖或胞外多糖無活性有活性載體脂焦磷酸化酶：最適pH7.0黃原膠發(fā)酵液pH5.0以下，終止合成流加NH4Cl，調(diào)pH7.0，促進黃原膠合成二、微生物多糖的合成模式和生理學(xué)調(diào)控134）篩選C55-Lipid-P含量高的菌株 C55-Lipid-P含量高的菌株桿菌肽高抗性菌株的選育（桿菌肽與C55-Lipid-P有很高的親和力）。C55-Lipid-PPC55-Lipid-P焦磷酸化酶C55-Lipid-P無運載活性有運載活性桿菌肽Bacitrain影印C55-Lipid-P含量高不長菌落（C55-Lipi

7、d-P含量低）小菌落(C55-Lipid-P含量高)含桿菌肽？在高濃度桿菌肽平板上長出的菌落C55-Lipid-P含量高二、微生物多糖的合成模式和生理學(xué)調(diào)控142、不依賴于C55-Lipid-P糖基載體合成模式 腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)厭氧條件下合成右旋糖酐(dextrans)即屬該合成模式(1). dextrans生物合成顯著特點1). 菌體生長和dextran生物合成以蔗糖為特異性底物；2). 蔗糖誘導(dǎo)菌體細胞產(chǎn)生葡聚糖-蔗糖酶(胞外酶)；3). 蔗糖做底物不進入菌體細胞。在胞外水解成葡萄 糖 和果糖，果糖進入細胞作碳源和能源，葡萄糖在胞外聚合成

8、右旋糖酐。二、微生物多糖的合成模式和生理學(xué)調(diào)控15細胞生長和dextrans合成同時進行，不進入細胞合成細胞物質(zhì)厭氧代謝Gru蔗糖n蔗糖n果糖葡聚糖蔗糖酶誘導(dǎo)葡6葡6葡6dextrans葡葡3131分解聚合能量16三、微生物多糖發(fā)酵研究1、培養(yǎng)條件優(yōu)化研究(1). 最佳培養(yǎng)基的確立單因子試驗多因子多水平正交試驗均勻設(shè)計實驗計算機軟件的應(yīng)用(2). 最佳環(huán)境因子的選擇(3). 營養(yǎng)因子。環(huán)境因子多因素。多水平均勻設(shè)計最佳選擇2、最佳培養(yǎng)條件下物質(zhì)消失變化的規(guī)律(1). 發(fā)酵過程中菌體細胞數(shù)量變化(2). 底物消長變化(3). 產(chǎn)物消長變化(4). 發(fā)酵液粘度變化(5). pH值的變化(6). 物

9、質(zhì)消長變化規(guī)律綜合分析。真實反應(yīng)菌體細胞生長、代謝與環(huán)境相互關(guān)系的規(guī)律171000330009500015700021900027pH765V(CP)菌體蛋白（）0.54 0.43 0.32 0.21 0.10 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88菌體蛋白pH產(chǎn)量(g/L)玉米淀粉()殘余淀粉粘度X.Campestris.N.K-01 1200L罐黃原膠發(fā)酵過程中代謝變化產(chǎn)量三、微生物多糖發(fā)酵研究18綜合分析：(1) 24小時前菌體細胞生長，大量消耗玉米淀粉作碳源，pH下降，黃原膠不合成，發(fā)酵液無粘度(2) 24小時后菌體平衡生長，殘余淀粉用于黃原膠合成，產(chǎn)量、粘度劇

10、增，72小時發(fā)酵終止。(3) 采用流加補充底物(淀粉、Glc或蔗糖)和氨水調(diào)節(jié)pH7.0，可進一步促進分批發(fā)酵過程中的黃原膠合成。3、黃原膠分離純化分離原理與方法(1).乙醇、丙酮沉淀法國內(nèi)外常用方法，純度高，溶劑回收是技術(shù)與成本的關(guān)鍵(2).鈣鹽沉淀法Ca離子與羧基結(jié)合，堿性條件下沉淀 COO OOCCa+ Ca+(OH)219 堿性條件下鈣鹽濃縮黃原膠分子用酸醇處理脫鈣，黃原膠分子才溶于水成本低，水溶性差(3).噴霧干燥法純度低，水溶性差(4).濾膜超濾技術(shù)用濾膜濃縮，再用少量乙醇沉淀濾膜質(zhì)量4、質(zhì)量標準 GB:食品添加劑黃原膠粘度（CP）1水溶液600剪切性能值6rpm.V/60rpm.

11、V 6干燥比重（）13灰分（）13總N含量（）1.5三、微生物多糖發(fā)酵研究20 砷（As）含量（ppm）3重金屬（以Pb計，ppm）10微生物指標細菌總數(shù)（1g粉狀產(chǎn)品）10000霉菌總數(shù)（1g粉狀產(chǎn)品）300致病菌Coliform不得檢出Salmonella不得檢出S.aureus不得檢出P.aeruginosa不得檢出X.campestris不得檢出未列入標準丙酮酸含量（）1.5三、微生物多糖發(fā)酵研究211、幾種重要的胞外多糖分子組成（1）.Dextrans(右旋糖酐)產(chǎn)生菌:腸膜狀明串珠菌糖基單體:-D-Glc分子結(jié)構(gòu)分子量:數(shù)千萬（2）.Pullulan（普魯蘭）產(chǎn)生菌：出芽 梗霉重復(fù)

12、單位結(jié)構(gòu) n分子量：41042106GlcGlcGlcGlcGlcGlc支鏈：-1.3鏈GlcGlcGlc-1.4四、微生物胞外多糖的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)22（3）.cleroglucan(核菌葡聚糖)產(chǎn)生菌:葡聚糖小核菌糖基單體：DGlc重復(fù)單位結(jié)構(gòu)（4）.Xanthan（黃原膠）產(chǎn)生菌：X.Campestris（野油菜黃單胞菌）糖基載體：Glc，Man，GlcA非糖基組分：Ac，Pyr重復(fù)單位結(jié)構(gòu)GlcGlcnGlc-1、4鍵Glc-1、6鍵四、微生物胞外多糖的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)23pyr含量越高，剪切稀釋性能越好分子量25106（5）. Bacterial alginate（細菌藻朊酸）產(chǎn)生菌：棕

13、色固氮菌糖基單體：ManA,GulA非糖基組分：Ac分子結(jié)構(gòu)ManAGulAManAGlcGlcnMan-AcGlcAMan=pyr(并非皆有pyr)-1、4鍵Ac|24（6）.Colanic acid（腸細菌酸性多糖）產(chǎn)生菌：大腸菌群糖基單體：Glc，Gal，F(xiàn)uc，GlcA非糖基組分：Ac重復(fù)單位結(jié)構(gòu)：大腸菌群細胞表面多糖抗原成分，不能作為商品 PyrGal|GlcA|Gal|nGlcFucFucAc|四、微生物胞外多糖的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)25結(jié)冷膠主鏈結(jié)構(gòu)是葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖以211摩爾比聚合而成的四碳重復(fù)單元的長鏈分子。天然結(jié)冷膠與低乙酰基結(jié)冷膠在結(jié)構(gòu)上的不同點在于：前者在第一個葡

14、萄糖分子C2 處被甘油酸酯化, C6處被乙酸酯化。天然結(jié)冷膠的分子結(jié)構(gòu)（7）. 結(jié)冷膠四、微生物胞外多糖的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)26一級結(jié)構(gòu)：黃原膠分子主鏈以-1.4鍵構(gòu)成纖維素骨架的線性結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈含羧酸帶負電荷，反向纏繞主鏈，呈鋸齒狀二級結(jié)構(gòu)：兩條線性黃原膠分子靠氫鍵維系成右手雙股螺旋結(jié)構(gòu)五、微生物胞外多糖的分子構(gòu)型與性質(zhì) 黃原膠的分子構(gòu)型27雙股螺旋結(jié)構(gòu)間靠微弱的非共價鍵結(jié)合，排列成螺旋共聚體 黃原膠分子構(gòu)型的變化：螺旋共聚體升溫、高剪切降溫、低剪切不規(guī)則線團雙股螺旋三級結(jié)構(gòu)：28黃原膠的優(yōu)良性能粘濃曲線（1）增黏性黃原膠溶液具有一定黏度，并在一定條件下隨溶液濃度增加而增大。29粘剪曲線（2）剪切

15、稀釋性、觸變性剪切稀釋性表觀粘度隨著剪切速率的增加而降低的特性觸變性由于剪切作用造成黏度降低的自行恢復(fù)能力螺旋共聚體雙股螺旋不規(guī)則線團本質(zhì)是由黃原膠分子構(gòu)型的變化所決定的：黃原膠的優(yōu)良性能30（3）乳化性，懸浮顆粒性黃原膠的優(yōu)良性能31（5）穩(wěn)定性（耐溫，抗鹽）COO-Na+，K+，Mg2+，Ca2+COO-黃原膠的優(yōu)良性能（6）成凝膠性+ Cr3+（4）持水性32(1).食品工業(yè)應(yīng)用冰激凌等冷凍食品烘烤食品果凍、果漿食品飲料、食品保鮮(2).非食品工業(yè)制藥、印染、紡織、造紙、搪瓷、炸藥、農(nóng)藥噴灑、建筑材料、墨水等(3).油田開發(fā)油田鉆井泥漿、壓裂液、固井液、注水采油增粘劑、注入調(diào)剖劑、大孔道

16、封堵劑四、微生物胞外多糖廣泛應(yīng)用33胞外多糖在礦物加工工程中的研究和應(yīng)用 硫化礦的浮選中的抑制劑，其基本思路是以細菌胞外聚合物替代金屬鹽類和氰化物，這樣不僅可以獲得較好的經(jīng)濟效益，而且還可解決使用金屬鹽類和氰化物帶來的環(huán)境污染問題。很多研究者借鑒環(huán)境領(lǐng)域中有關(guān)利用細菌胞外聚合物處理重金屬廢水的研究成果，在礦物浮選過程中將胞外聚合物作為生物絮凝劑。索馬桑達蘭等指出，細菌及胞外聚合物可增強方解石的絮凝。有色金屬的濕法浸出及從有色金屬廢渣中回收重金屬的研究，基本思路是吸附至礦物表面的細菌被自身產(chǎn)生的EPS所包裹，而EPS又介導(dǎo)了細菌與硫化礦物能源的接觸，在生物膜的形成和細菌- 基質(zhì)的界面作用中起著重

17、要作用。菌表面的脂類、多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)形成的EPS是細菌真正的功能表面，在細菌與礦物之間的復(fù)雜界面作用中起著極其重要的作用。隨著礦物加工行業(yè)的不斷發(fā)展，胞外聚合物在礦物加工工程中的作用會越來越大，主要將體現(xiàn)在以下幾個方面: 與其它處理方法結(jié)合處理低品位難處理礦石; 作為礦物浮選的生物藥劑代替昂貴的對環(huán)境有危害的化學(xué)藥劑; 與其它方法結(jié)合處理固體廢棄物，回收有價金屬; 除去礦物產(chǎn)品中的雜質(zhì)，例如除去煤中的硫、除去鋼渣和錳礦石中的磷等。 34胞外多糖在環(huán)境工程中的研究和應(yīng)用 胞外聚合物在環(huán)境工程中的應(yīng)用主要是去除廢水中的重金屬。由于胞外聚合物可以與金屬離子之間相互作用，因而可以利用胞外聚合物去除

18、廢水中的金屬離子。 首先沉淀的金屬離子被生物膜絮凝物捕獲； 胞外聚合物與可溶性金屬成鍵； 細胞積累可溶性金屬； 使金屬向大氣中揮發(fā)。隨著國家對環(huán)境保護的日益重視，胞外聚合物在環(huán)境工程中的應(yīng)用前景也會更加廣泛，主要將體現(xiàn)在以下幾個方面： 與活性污泥相結(jié)合處理重金屬廢水； 用于修復(fù)被烴類和原油污染的土壤； 用于修復(fù)被重金屬污染的土壤； 用于消除開放海洋或沿海環(huán)境中碳氫化合物的污染。35胞外多糖在食品工業(yè)中的研究和應(yīng)用 食品工業(yè)中對胞外聚合物主要是利用其中占總成分量65%的胞外多糖。胞外多糖可以用作食品添加劑、抗凝劑、保鮮劑等，已經(jīng)獲得工業(yè)應(yīng)用的有結(jié)冷膠、黃原膠等。在細菌胞外多糖中，被研究得較多的是

19、乳酸菌胞外多糖，其中包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬和乳球菌屬等。由腸膜明串珠菌產(chǎn)生的右旋糖酐是最早被開發(fā)利用的乳酸菌胞外多糖，也是美國食品和藥品管理局(FDA)批準的第一種可用于食品的微生物胞外多糖。乳酸菌胞外多糖主要用作食品添加劑，如作為酸奶、飯后甜點、湯、沙司和色拉的助劑，作為益生元，用來提高干酪的產(chǎn)量和保水性等。 隨著人們生活水平的提高，胞外聚合物及其主要成分會越來越多地在食品工業(yè)中被應(yīng)用，主要將體現(xiàn)在以下幾個方面： 作為天然保健食品被開發(fā)； 用于酸奶、干酪的生產(chǎn)； 作為優(yōu)良的天然食品添加劑，改善食品的結(jié)構(gòu)，增加食品的風(fēng)味； 用作保鮮劑。 36胞外多糖在生物醫(yī)藥工程中的應(yīng)用 生物醫(yī)藥工程中對胞外聚合物的研究和應(yīng)用主要集中在胞外聚合物的主要成份多糖的生物活性功能、藥理作用與免疫保健作用方面。多糖作為藥物應(yīng)用開始于20世紀40年代，人們相繼發(fā)現(xiàn)它具有很多生物學(xué)活性，如抗輻射、抗凝血、降血糖、抗感染，預(yù)防和治療腫瘤及艾滋病等。因此，研究和開發(fā)生物多糖成為熱點課題。EPS可以幫助細菌抵制抗生素、有毒金屬、氯化物等不利因素。在牙菌斑生物膜中，變形鏈球菌產(chǎn)生的胞外多糖能幫助細菌躲避人類中性白細胞