核酸研究進(jìn)展-生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件

1、生物系統(tǒng)中mRNA或DNA等目標(biāo)核酸分子的分析鑒定必須回答如下三個基本問題：目標(biāo)核酸分子是否存在于實驗標(biāo)本中。實驗標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的含量是多少。實驗標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的序列如何；以及與其他實驗標(biāo)本中的情況比較，目標(biāo)核酸分子的序列是否有變化。核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展11證明目標(biāo)核酸分子是否存在于實驗標(biāo)本中的基本實驗方法：1）雜交法，2）PCR法，3）測序法。核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展12雜交法：序列已知，同時還要合成一個標(biāo)記了的特異性探針。Dot blotting：不經(jīng)過電泳，直接把檢測樣本點在一個適宜載體上，針對目標(biāo)DNA分子或RNA分子進(jìn)行雜交檢測。Southern blotting：在電泳后，針對

2、目標(biāo)DNA分子的雜交檢測。Northern blotting：在電泳后，針對目標(biāo)RNA分子的雜交檢測。目標(biāo)DNA分子原位雜交檢測。目標(biāo)RNA分子原位雜交檢測。核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展13雜交法的優(yōu)點與缺點：優(yōu)點： Dot blotting：簡單實用，適于進(jìn)行大樣本數(shù)同時檢測。 Northern blotting：如果檢測結(jié)果陽性，其可信度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于RT-PCR，因此被譽為評價基因轉(zhuǎn)錄的Golden Marker。 Southern blotting：對DNA病毒類病原體等的檢測實用性很強(qiáng)。缺點： Dot blotting：由于在同一斑點位置，除了目標(biāo)核酸分子外，同時還存在其它的成千上萬種不同的核酸

3、分子，而這些核酸分子有可能會與探針分子部分結(jié)合，這會促進(jìn)探針分子與目標(biāo)核酸分子的結(jié)合，因此將可能導(dǎo)致陽性結(jié)果放大，甚至是假陽性結(jié)果。 Northern blotting：對低拷貝mRNA有時檢測不出來，容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果。核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展14例一：cDNA microarray檢測SHEEC食管癌細(xì)胞NGAL基因mRNA轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)果反向 Dot blotting核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展15例二：Northern blotting檢測SHEEC食管癌細(xì)胞NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA實驗結(jié)果NGAL 化學(xué)發(fā)光法核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展16例三：Northern blotting 檢測缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞

4、EGR1基因轉(zhuǎn)錄mRNA 實驗結(jié)果EGR1 同位素法核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展17確保雜交法實驗成功的八個關(guān)鍵點：關(guān)鍵點1：確保實驗方案設(shè)計合理。關(guān)鍵點2：確保探針的特異性充分。關(guān)鍵點3：確保檢測的靈敏度足夠高。關(guān)鍵點4：確保樣本質(zhì)量合格。關(guān)鍵點5：確保實驗試劑質(zhì)量合格。關(guān)鍵點6：確保實驗過程規(guī)范。關(guān)鍵點7：對于編碼序列的cDNA，要確保沒有RNA的干擾。關(guān)鍵點8：幾種雜交法，或雜交法與其它方法聯(lián)合使用，相互印證，確保實驗結(jié)果可靠。核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展18PCR法：序列已知，同時還要合成一對特異性引物。核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1優(yōu)點： 實驗的靈敏度很高，理論上可檢測實驗生物系統(tǒng)中所存在的1個拷貝目標(biāo)核酸

5、分子。 陰性結(jié)果的可信度很高。缺點：由于容易存在樣本污染情況，與此同時，畢竟在實驗過程中存在著目標(biāo)核酸分子拷貝數(shù)人為放大這樣一個事實，因此，其陽性結(jié)果的可信度不如Northern boltting 或 Southern boltting。9例子：RT-PCR檢測SHEEC食管癌細(xì)胞NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA實驗結(jié)果NGAL 600bpS M S: 食管癌細(xì)胞SHEECM: DNA marker核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展110核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1確保PCR法實驗成功的八個關(guān)鍵點：關(guān)鍵點1：確保實驗方案設(shè)計合理。關(guān)鍵點2：確保引物的特異性充分。關(guān)鍵點3：確保樣本質(zhì)量合格。關(guān)鍵點4：確保實驗試劑質(zhì)量。關(guān)鍵

6、點5：確保實驗過程規(guī)范。關(guān)鍵點6：確保PCR變性、退火和延伸溫度適度。關(guān)鍵點7：對于編碼序列cDNA，要確保沒有RNA的干擾。 關(guān)鍵點8：幾種PCR法，或PCR法與其它方法聯(lián)合使用，相互印證，確保實驗結(jié)果可靠。11核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1測序法：通過電泳等手段已知實驗生物系統(tǒng)中目標(biāo)核酸的大致大小，而且是對照生物系統(tǒng)中不存在，或者兩者相比在含量上可能有顯著差別，然而序列未知。優(yōu)點： 可信度最高。 對于解析鑒定未知核酸分子序列片段是必需的手段。缺點：目標(biāo)片段邊緣序列的測定結(jié)果有時不準(zhǔn)確，在讀原初測序圖時要格外小心。12核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1目標(biāo)片段邊緣序列的測定結(jié)果有時不準(zhǔn)確例子13Poly A t

7、ail核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展114核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展115核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1測定實驗標(biāo)本中目標(biāo)核酸分子的含量16核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1通過 Dot blotting，結(jié)合斑點光密度掃描分析，測定實驗標(biāo)本中目標(biāo)mRNA分子、目標(biāo)cDNA分子或目標(biāo)DNA分子的含量17A永生化食管上皮細(xì)胞SHEEB食管癌細(xì)胞SHEEC例子：cDNA microarray （反向 Dot blotting） 檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮細(xì)胞SHEE中 NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實驗結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：B/A 2或 0.5為顯著性差異表達(dá)實際情況： B/A3.53核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展118核酸實驗研究技

8、術(shù)進(jìn)展1通過 RT-PCR，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實驗標(biāo)本中目標(biāo)mRNA分子或目標(biāo)cDNA分子的含量19例子：RT-PCR 檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮細(xì)胞SHEE中 NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實驗結(jié)果NGAL 600bpA B M A: 永生化食管上皮細(xì)胞SHEEB: 食管癌細(xì)胞SHEECM: DNA markerA B M GAPDH 226bp核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展120兩個問題：反轉(zhuǎn)錄PCR實驗是否需要探針 ？反轉(zhuǎn)錄PCR的特異性如何保證 ？ 核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展121核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1通過 Northern blotting，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實驗

9、標(biāo)本中目標(biāo)mRNA分子的含量22例一：Northern blotting 檢測SHEEC食管癌細(xì)胞與永生化食管上皮細(xì)胞SHEE中 NGAL基因轉(zhuǎn)錄mRNA相對含量實驗結(jié)果（化學(xué)發(fā)光）NGAL A BA: 食管癌細(xì)胞SHEECB: 永生化食管上皮細(xì)胞SHEEA BGAPDH A BA B500 -400 -300 -200 -100 -100 -80 -60 -40 -20 -核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展123核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1例二：Northern blotting 檢測缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞EGR1基因轉(zhuǎn)錄mRNA 相對含量實驗結(jié)果(同位素標(biāo)記法)1 正常2 缺氧復(fù)氧3 缺氧復(fù)氧溶劑對照4 缺氧

10、復(fù)氧F25 缺氧復(fù)氧鈣離子拮抗劑1 2 3 4 5 1 2 3 4 5EGR1 -Actin 24核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1通過 Southern blotting ，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實驗標(biāo)本中目標(biāo)DNA分子的含量25核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1通過 Southern blotting ，結(jié)合條帶光密度掃描分析，測定實驗標(biāo)本中目標(biāo)DNA分子的含量26核糖核酸酶保護(hù)分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）是一種 較好的mRNA定量檢測技術(shù)。RPA的各項實驗指標(biāo)均優(yōu)于Northern Blotting。運用RPA可實現(xiàn)對目標(biāo)RNA分子的高通量定量檢測。核糖核酸酶

11、保護(hù)分析Ribonuclease Protection Assay (RPA)核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展127原理：以目標(biāo)基因DNA為模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放射法）作為標(biāo)記信號，體外轉(zhuǎn)錄合成反義RNA探針。將過量的反義RNA探針與樣品總RNA雜交，然后進(jìn)行核糖核酸酶處理。未與探針雜交的單鏈RNA和過量的游離探針被降解，而目標(biāo)RNA則因與探針結(jié)合形成雙鏈而被保護(hù)。雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或化學(xué)發(fā)光等方法確定目標(biāo)RNA的量。核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展128核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展129核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展1適時熒光定量PCRReal time fluorescent qu

12、antitation PCR30適時熒光定量PCR與常規(guī)PCR的本質(zhì)區(qū)別常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性定量或半定量分析 適時熒光定量PCR技術(shù)：通過一個特殊的熒光探針，對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一次循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行適時跟蹤定量分析 核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展131real time PCR 的擴(kuò)增曲線核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展132PE公司在同一臺PCR儀上對相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖Ct值極具重現(xiàn)性核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展133Ct與初始模板的關(guān)系固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號值與模板數(shù)成正比固定熒光信號值后，循環(huán)數(shù)與初始模板數(shù)成反比。初始模板數(shù)越多, 熒光信號達(dá)到閾值時所需要的循環(huán)數(shù)(Ct 值)

13、越少起始模板濃度的對數(shù)與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值就可計算出樣品中所含的初始模板數(shù)。Threshold104103102核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展134常用的定量PCR熒光探針SYBR Green I Taqman水解探針分子信標(biāo)核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展135SYBR Green I結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展136SYBR Green I 工作原理未結(jié)合的SYBR green I核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展137SYBR Green I的優(yōu)點價格相對便宜使用簡便可以用于不同的模板靈敏度很高SYBR Green I的缺點特異性較差核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展138T

14、aqMan Probes熒光素淬滅劑 與目標(biāo)序列互補(bǔ)FAMTETJOEHEXVIC TAMRA DABCYL 核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展139TaqMan Probes工作原理探針與目標(biāo)序列配對 ，熒光基團(tuán)與熒光淬滅劑相鄰，不發(fā)生特異熒光光能量轉(zhuǎn)移Taq游離的探針熒光基團(tuán) 淬滅劑 延伸時，Taq酶水解探針，熒光基團(tuán)與熒光淬滅劑分離，發(fā)出特異熒光。Taq發(fā)出特異熒光光另一波長的熒光核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展140TaqMan Probes的優(yōu)點：定量關(guān)系準(zhǔn)確。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)增加，TaqMan探針釋放出來的熒光基團(tuán)成倍增加，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。TaqMan探針特別適合于病毒定量、基因轉(zhuǎn)錄水平定量、癌細(xì)胞基因微突變檢測等。敏感性高。特異性高。TaqMan Probes的缺點：只適合于一個特定目標(biāo)的檢測。核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展141分子信標(biāo) (發(fā)夾型雜交探針)熒光基團(tuán)莖由互補(bǔ)配對的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ) 淬滅劑 莖(5-7bp) 環(huán)（15-30bp）FAM Texas Red 核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展142分子信標(biāo)工作原理探針與DNA模板雜交光發(fā)出熒光熒光基團(tuán)單鏈DNA 模板淬滅劑 莖 環(huán)光核酸實驗研究技術(shù)進(jìn)展143分子